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一种荧光生物传感器,其制备方法以及用途.pdf

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一种 荧光 生物 传感器 制备 方法 以及 用途
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摘要
申请专利号:

CN201610836694.1

申请日:

2016.09.21

公开号:

CN106483110A

公开日:

2017.03.08

当前法律状态:

实审

有效性:

审中

法?#19978;?#24773;: 实质审查的生效IPC(主分类):G01N 21/64申请日:20160921|||公开
IPC分类号: G01N21/64 主分类号: G01N21/64
申请人: 安徽师范大学
发明人: 王广凤; 朱升美
地址: 241000 安徽省芜湖市弋江区花津?#19979;?#23433;徽师范大学
优?#28909;ǎ?/td>
专利代理机构: 芜湖安汇知识产权代理有限公司 34107 代理人: 任晨晨
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法律状态
申请(专利)号:

CN201610836694.1

授权公告号:

|||

法律状态公告日:

2017.04.05|||2017.03.08

法律状态类型:

实质审查的生效|||公开

摘要

本发明涉及一种荧光生物传感器,其制备方法以及用途,基于二维二氧化锰纳米片为荧光传感平台,使用吗啉?#19968;?#37240;还原高锰酸钾一步合成二氧化锰纳米片,二氧化锰纳米片吸附FAM?ssDNA,猝灭FAM荧光。在碱性磷酸酶的作用下,将维生素C磷酸酯镁水解生成抗坏血酸,二维二氧化锰纳米片被抗坏血酸还原成锰离子,释放出FAM?ssDNA并恢复荧光,构建了由二氧化锰纳米片和碱性磷酸酶调节荧光强度的荧光传感器检测碱性磷酸酶活性。与现有技术相比,本发明利用二维二氧化锰纳米片对荧光信号的改变,即“off?on”模式检测碱性磷酸酶,具有简单、快速、背景信号低、灵敏度高、检测限低、选择性好的特点。

权利要求书

1.一种荧光生物传感器的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)合成单层二维二氧化锰纳米片;
(2)将FAM-DNA序列和碱性磷酸酶溶解在Tris–HCl缓冲溶液中,得到FAM-DNA缓冲溶液
和碱性磷酸酶溶液;
(3)取FAM-DNA溶液,加入不同浓度的二氧化锰纳米片,摇动混合均匀,得到第一状态的
荧光生物传感器;
(4)在步骤(3)?#26800;?#21040;的混合液中,加入一定量的维生素C磷酸酯镁和碱性磷酸酶,反应
得到第二状态的荧光生物传感器。
2.如权利要求1所述的荧光生物传感器的制备方法,其特征在于,步骤(1)中,取5ml高
锰酸钾与12ml吗啉?#19968;?#37240;缓冲溶液中,将混合液超声30?#31181;櫻?#27493;骤(4)中,在37℃的恒温箱
中反应30min。
3.如权利要求1和2所述的荧光生物传感器的制备方法,其特征在于,步骤(3)中,第一
状态的荧光生物传感器为“关闭”的荧光生物传感器,步骤(4)中,第二状态的荧光生物传感
器为“开”的荧光生物传感器。
4.如权利要求1-3所述的荧光生物传感器的制备方法,其特征在于,步骤(1)包括如下
步骤:
(1-1)高锰酸钾浓度为10mM,吗啉?#19968;?#37240;缓冲溶液为0.1M,pH=6.0,取5ml高锰酸钾与
12ml吗啉?#19968;?#37240;缓冲溶液中;
(1-2)将混合液超声30?#31181;櫻?#24418;成棕褐色溶液;
(1-3)将超声后的混合?#21512;?000rpm离心15?#31181;櫻?br />(1-4)用去离子水和乙醇洗涤沉淀,去除残余反应物;
(1-5)将沉淀在60℃?#31245;錚?br />(1-6)将沉淀超声分散在50ml去离子水中,在4℃下保存备用。
5.如权利要求1-4所述的荧光生物传感器的制备方法,其特征在于,步骤(2)包括如下
步骤:
(2-1)将10μL 100μM FAM-DNA缓冲溶液加入1990μL Tris–HCl缓冲溶液得到500nM溶
液,4℃下保存备用;
(2-2)将碱性磷酸酶用0.01M,pH值为8.12?#28082;?#26377;5mM氯化镁和0.1mM氯化锌的Tris-HCl
缓冲溶?#21512;?#37322;得到2500U/ml,-4℃下保存备用。
6.如权利要求1-5所述的荧光生物传感器的制备方法,其特征在于,步骤(3)中,取40μL
步骤(2)中FAM-DNA溶液,加入40μL二氧化锰纳米片,摇动混合均匀,室温下放置5min,使
FAM-DNA吸附在二氧化锰纳米片上,FAM的荧光被猝灭。
7.如权利要求1-6所述的荧光生物传感器的制备方法,其特征在于,步骤(4)中,加入40
μL维生素C磷酸酯镁和不同体积的碱性磷酸酶,在37℃的恒温箱中反应30min,使维生素C磷
酸酯镁与碱性磷酸酶充分反应生成抗坏血酸,还原二氧化锰纳米片,释放出FAM-DNA,恢复
荧光。
8.如权利要求7所述的荧光生物传感器的制备方法,其特征在于,步骤(2)中稀释FAN-
DNA的缓冲溶液Tris-HCl的pH为8.5,浓度为0.1M;步骤(3)中,FAM-DNA溶液加入二氧化锰纳
米片反应不同时间,反应5min FAM荧光能达到最大程度的猝灭;和/或,步骤(3)中,FAM-DNA
最终浓度为100nM,二氧化锰纳米片浓度为0.2mg/mL;步骤(3)中的混合液,用荧光仪检测荧
光强度;步骤(4)中,FAM-DNA最终浓度为100nM,二氧化锰纳米片浓度为0.2mg/Ml,维生素C
磷酸酯镁的最终浓度为0.02M,和碱性磷酸酶的最终浓度分别为5.0U/L,10.0U/L,20.0U/L,
30.0U/L,50.0U/L,100.0U/L,150.0U/L,200.0U/L,300.0U/L,400.0U/L,500.0U/L;和/或,
步骤(4)中,碱性磷酸酶用0.01M,pH值为8.12含有5mM氯化镁和0.1mM氯化锌的Tris-HCl缓
冲溶?#21512;?#37322;;步骤(4)中,混合液用荧光仪检测荧光强度,构建线性关系,实现对碱性磷酸酶
活性的检测。
9.一种荧光生物传感器,其特征在于,采用如权利要求1-8所述制备方法制得的基于二
维二氧化锰纳米片--荧光探针构建的荧光传感平台。
10.如权利要求9所述荧光生物传感器的用途,其特征在于,对不同浓度的碱性磷酸酶
活性检测。

说明书

一种荧光生物传感器,其制备方法以及用途

技术领域

本发明属于生物传感器技术领域,具体涉及一种基于二维二氧化锰纳米片--荧光
探针构建的荧光传感平台的方法及其应用,可以实现对碱性磷酸酶活性的灵敏检测。

背景技术

碱性磷酸酶(ALP)是一种磷酸单酯酶,促进各种磷酸化底物的去磷酸化过程。已经
证明碱性磷酸酶在调节细胞生长、细胞凋亡等细胞内过程中起着至关重要的作用,因此常
常作为各种疾病的诊?#29616;?#26631;,包括乳腺癌和前列腺癌、骨病、肝功能异常、糖尿病。此外,碱
性磷酸酶在环境和食?#20998;?#37327;监测中也发挥着重要的作用。因此,设计一种简单,灵敏检测碱
性磷酸酶活性的方法极其重要。

目前基于碱性磷酸酶对不同底物的去磷酸化作用检测其活性的方法多涉及复杂
和耗时冗长的检测过程。荧光光谱法由于其优越的灵敏度,操作简单,良好的重现性和低成
本,受到广泛的关注。然而,大多数采用信号循环放大来提高灵敏度,忽视了?#26723;?#32972;景信号,
限制了检测灵敏度和检测范围。因此,采用?#26723;?#32972;景信号快速灵敏检测碱性磷酸酶活性非
常?#26723;?#26399;待。

近年来,二维二氧化锰纳米片由于其独特的物理和化学性质引起了研究人员的关
注。二氧化锰纳米片作为氧化还原活性的过渡金属氧化物具有良好的水溶性和优良的生物
相容性,由于其具有高的比表面积和良好的物理吸附能力以及荧光猝灭能力在生物传感器
中具有广泛应用。

因此,利用二维二氧化锰纳米?#26723;?#32972;景信号,开发简单、高灵敏性、高选择性的荧
光生物传感器检测碱性磷酸酶活性至关重要。

发明内容

本发明公开了一种基于二维二氧化锰纳米片为荧光传感平台,使用吗啉?#19968;?#37240;还
原高锰酸钾一步合成二氧化锰纳米片,二氧化锰纳米片吸附FAM-ssDNA,猝灭FAM荧光。在碱
性磷酸酶的作用下,将维生素C磷酸酯镁水解生成抗坏血酸,二维二氧化锰纳米片被抗坏血
酸还原成锰离子,释放出FAM-ssDNA并恢复荧光,构建了由二氧化锰纳米片和碱性磷酸酶调
节荧光强度的荧光传感器。

本发明还提供了一种荧光生物传感器的应用,利用制备的荧光生物传感器,不同
浓度的碱性磷酸酶荧光强度不同,构建线性关系,实现了对碱性磷酸酶灵敏性、特异性的检
测。具体技术方案如下:

一种荧光生物传感器的制备方法,包括如下步骤:

(1)合成单层二维二氧化锰纳米片;

(2)将FAM-DNA序列和碱性磷酸酶溶解在Tris–HCl缓冲溶液中,得到FAM-DNA缓冲
溶液和碱性磷酸酶溶液;

(3)取FAM-DNA溶液,加入不同浓度的二氧化锰纳米片,摇动混合均匀,得到第一状
态的荧光生物传感器;

(4)在步骤(3)?#26800;?#21040;的混合液中,加入一定量的维生素C磷酸酯镁和碱性磷酸酶,
反应得到第二状态的荧光生物传感器。

进一步地,步骤(1)中,取5ml高锰酸钾与12ml吗啉?#19968;?#37240;缓冲溶液中,将混合液超
声30?#31181;櫻?#27493;骤(4)中,在37℃的恒温箱中反应30min。

进一步地,步骤(3)中,第一状态的荧光生物传感器为“关闭”的荧光生物传感器,
步骤(4)中,第二状态的荧光生物传感器为“开”的荧光生物传感器。

步骤(1)包括如下步骤:

(1-1)高锰酸钾浓度为10mM,吗啉?#19968;?#37240;缓冲溶液为0.1M,pH=6.0,取5ml高锰酸
钾与12ml吗啉?#19968;?#37240;缓冲溶液中;

(1-2)将混合液超声30?#31181;櫻?#24418;成棕褐色溶液;

(1-3)将超声后的混合?#21512;?000rpm离心15?#31181;櫻?br />

(1-4)用去离子水和乙醇洗涤沉淀,去除残余反应物;

(1-5)将沉淀在60℃?#31245;錚?br />

(1-6)将沉淀超声分散在50ml去离子水中,在4℃下保存备用。

进一步地,步骤(2)包括如下步骤:

(2-1)将10μL 100μM FAM-DNA缓冲溶液加入1990μL Tris–HCl缓冲溶液得到500nM
溶液,4℃下保存备用;

(2-2)将碱性磷酸酶用0.01M,pH值为8.12?#28082;?#26377;5mM氯化镁和0.1mM氯化锌的
Tris-HCl缓冲溶?#21512;?#37322;得到2500U/ml,-4℃下保存备用。

进一步地,步骤(3)中,取40μL步骤(2)中FAM-DNA溶液,加入40μL二氧化锰纳米片,
摇动混合均匀,室温下放置5min,使FAM-DNA吸附在二氧化锰纳米片上,FAM的荧光被猝灭。

进一步地,步骤(4)中,加入40μL维生素C磷酸酯镁和不同体积的碱性磷酸酶,在37
℃的恒温箱中反应30min,使维生素C磷酸酯镁与碱性磷酸酶充分反应生成抗坏血酸,还原
二氧化锰纳米片,释放出FAM-DNA,恢复荧光。

进一步地,步骤(2)中稀释FAN-DNA的缓冲溶液Tris-HCl的pH为8.5,浓度为0.1M;
步骤(3)中,FAM-DNA溶液加入二氧化锰纳米片反应不同时间,反应5min FAM荧光能达到最
大程度的猝灭;和/或,步骤(3)中,FAM-DNA最终浓度为100nM,二氧化锰纳米片浓度为
0.2mg/mL;步骤(3)中的混合液,用荧光仪检测荧光强度;步骤(4)中,FAM-DNA最终浓度为
100nM,二氧化锰纳米片浓度为0.2mg/Ml,维生素C磷酸酯镁的最终浓度为0.02M,和碱性磷
酸酶的最终浓度分别为5.0U/L,10.0U/L,20.0U/L,30.0U/L,50.0U/L,100.0U/L,150.0U/L,
200.0U/L,300.0U/L,400.0U/L,500.0U/L;和/或,步骤(4)中,碱性磷酸酶用0.01M,pH值为
8.12含有5mM氯化镁和0.1mM氯化锌的Tris-HCl缓冲溶?#21512;?#37322;;步骤(4)中,混合液用荧光仪
检测荧光强度,构建线性关系,实现对碱性磷酸酶活性的检测。

一种荧光生物传感器,采用上述制备方法制得的基于二维二氧化锰纳米片--荧光
探针构建的荧光传感平台。

上述荧光生物传感器的用途,用于对不同浓度的碱性磷酸酶活性检测。

与目前现有技术相比,本生物传感器的制备方法,使用的二氧化锰纳米片合成简
单,耗能低,成本低,生物相容性好,首先利用二氧化锰纳米片猝灭FAM-DNA的荧光,从而降
低背景信号;然后利用维生素C磷酸酯镁与碱性磷酸酶反应生成抗坏血酸还原二氧化锰,得
到自由的FAM-DNA并恢复荧光,最后利用FAM-DNA荧光恢复的强度构建与碱性磷酸酶浓度的
线性关系,实现对碱性磷酸酶活性的检测。因此对碱性磷酸酶活性的检测具有低背景,灵敏
度高、检测限低、选择性好的特点。

附图说明

图1为基于二维二氧化锰纳米片--荧光探针构建的荧光传感平台检测碱性磷酸酶
活性的示意图;

图2A为二氧化锰纳米片?#32435;?#25551;电子显微镜表征图;

图2B为二氧化锰纳米片的透射电子显微镜表征图;

图3A为FAM-DNA的荧光激发光谱和荧光发射光谱图;

a为FAM-DNA的荧光激发光谱;

b为FAM-DNA荧光发射光谱;

图3B为不同浓度的二氧化锰纳米片对FAM-DNA荧光强度影响的荧光光谱图;

a为10OnM FAM-DNA;

b为0.02mg/ml MnO2,c为0.04mg/ml MnO2,d 0.08mg/ml MnO2,e 0.12mg/ml
MnO2,f 0.16mg/ml MnO2,g 0.20mg/ml MnO2,h 0.3mg/ml MnO2,i 0.4mg/ml MnO2,j
0.5mg/ml MnO2;

图3C为二氧化锰纳米片浓度与荧光强度变化的曲线图;

图3D为二氧化锰纳米片浓度与荧光强度的线性关系图;

图3E为该方法可行性的荧光光谱图;

a为10OnM FAM-DNA;

b为在a溶液中含有0.2mg/ml MnO2;

c为在b溶液中含有0.2mg/ml的维生素C磷酸酯镁和500U/L的碱性磷酸酶;

图4A为碱性磷酸酶培养时间的优化图;

图4B为实验温度的优化图;

图4C为pH值对本实验的优化图。

图4D为维生素C磷酸酯镁浓度的优化图

图5A基于二维二氧化锰纳米片--荧光探针构建的荧光传感平台对不同浓度检测
碱性磷酸酶活性的荧光光谱图;

a 5.0U/L,b 10.0U/L,c 20.0U/L,d 30.0U/L,e 50.0U/L,f 100.0U/L,g 150.0U/
L,h 200.0U/L,i 300.0U/L,j 400.0U/L,k 500.0U/L

图5B为碱性磷酸酶的浓度与荧光强度变化的曲线图;

图5C为碱性磷酸酶的浓度与荧光强度的线性关系图

图6为此方法的选择性图,分别用碱性磷酸酶、三磷酸腺苷、抗生物素蛋白、溶菌
酶、凝血酶和血红蛋白。

具体实施方式

下面根据附图对本发明进行详细描述,其为本发明多种实施方式中的一种优选实
施例。

在一个优选实施例中,一种基于二维二氧化锰纳米片--荧光探针构建的荧光传感
平台的方法及其应用,所述方法包括以下步骤:

(1)、一步法超声波合成单层二维二氧化锰纳米片,取5ml高锰酸钾与12ml吗啉乙
磺酸缓冲溶液中,将混合液超声30?#31181;印?br />

(2)、将购买的2.5OD FAM-DNA序列和碱性磷酸酶溶解在Tris–HCl缓冲溶液中,得
到FAM-DNA缓冲溶液和碱性磷酸酶溶液;

(3)、取一定量的(2)中FAM-DNA溶液,加入不同浓度的二氧化锰纳米片,摇动混合
均匀,得到“关闭”的荧光生物传感器。

(4)、在步骤(3)?#26800;?#21040;的混合液中,加入一定量的维生素C磷酸酯镁和碱性磷酸
酶,在37℃的恒温箱中反应30min,得到“开”的荧光生物传感器。

步骤(1)为:高锰酸钾浓度为10mM,吗啉?#19968;?#37240;缓冲溶液为0.1M,pH=6.0,取5ml高
锰酸钾与12ml吗啉?#19968;?#37240;缓冲溶液中,将混合液超声30?#31181;櫻?#24418;成棕褐色溶液,将超声后的
混合?#21512;?000rpm离心15?#31181;?#21518;,用去离子水和乙醇洗涤沉淀,去除残余反应物,再将沉淀
在60℃?#31245;錚?#26368;后,将沉淀超声分散在50ml去离子水中,在4℃下保存备用;步骤(2)为将10μ
L 100μM FAM-DNA缓冲溶液加入1990μL Tris–HCl缓冲溶液得到500nM溶液,4℃下保存备
用;将够买的碱性磷酸酶用0.01M,pH值为8.12?#28082;?#26377;5mM氯化镁和0.1mM氯化锌的Tris-HCl
缓冲溶?#21512;?#37322;得到2500U/ml,-4℃下保存备用;步骤(3)为取40μL步骤(2)中FAM-DNA溶液,
加入40μL二氧化锰纳米片,摇动混合均匀,室温下放置5min,使FAM-DNA吸附在二氧化锰纳
米片上,FAM的荧光被猝灭;步骤(4)为加入40μL维生素C磷酸酯镁和不同体积的碱性磷酸
酶,在37℃的恒温箱中反应30min,使维生素C磷酸酯镁与碱性磷酸酶充分反应生成抗坏血
酸,还原二氧化锰纳米片,释放出FAM-DNA,恢复荧光;

上述的荧光生物传感器的应用,应用方法具体为:利用制备的荧光生物传感器,加
入不同浓度的碱性磷酸酶荧光恢复强度不同,构建线性关系,实现了基于二维氧化锰纳米
片--荧光探针构建的荧光传感平台对碱性磷酸酶灵敏性、特异性的检测。

在另一个优选实施例中,可以采用如下方案:一种基于二维二氧化锰纳米片构建
的荧光传感器包括以下步骤:

(1)、一步法超声合成单层二维二氧化锰纳米片,取5ml高锰酸钾与12ml吗啉?#19968;?br />酸缓冲溶液中,将混合液超声30?#31181;印?br />

(2)、将购买的2.5OD FAM-DNA序列和碱性磷酸酶溶解在Tris–HCl缓冲溶液中,得
到FAM-DNA缓冲溶液和碱性磷酸酶溶液;

(3)、取一定量的(2)中FAM-DNA溶液,加入不同浓度的二氧化锰纳米片,摇动混合
均匀,得到“关闭”的荧光生物传感器。

(4)、在步骤(3)?#26800;?#21040;的混合液中,加入一定量的维生素C磷酸酯镁和碱性磷酸
酶,在37℃的恒温箱中反应30min,得到“开”的荧光生物传感器。

具体的,步骤(1)二氧化锰纳米片的制备:取5ml高锰酸钾与12ml吗啉?#19968;?#37240;缓冲
溶液,将混合液超声30?#31181;櫻?#24418;成棕褐色溶液,将超声后的混合?#21512;?000rpm离心15?#31181;?#21518;,
用去离子水和乙醇洗涤沉淀,去除残余反应物,再将沉淀在60℃?#31245;錚?#26368;后,将沉淀超声分
散在50ml去离子水中。

进一步的,步骤(1)中高锰酸钾浓度为10mM,吗啉?#19968;?#37240;缓冲溶液为0.1M,pH值为
6.0。

进一步的,步骤(1)中二氧化锰纳米片分散液的浓度为1mg/ml,在4℃下保存备用;

具体的,步骤(2)为:将10μL 100μM FAM-DNA缓冲溶液加入1990μL Tris–HCl缓冲
溶液得到500nM溶液,-4℃下保存备用;将够买的碱性磷酸酶用0.01M,pH值为8.12?#28082;?#26377;
5mM氯化镁和0.1mM氯化锌的Tris-HCl缓冲溶?#21512;?#37322;得到2500U/ml,-4℃下保存备用;

进一步的,步骤(2)中稀释FAN-DNA的缓冲溶液Tris-HCl的pH为8.5,浓度为0.1M。

具体的,步骤(3)为:取40μL步骤(2)中FAM-DNA溶液,加入40μL二氧化锰纳米片,摇
动混合均匀,室温下放置5min,使FAM-DNA吸附在二氧化锰纳米片上,FAM的荧光被猝灭,得
到“关闭”的荧光生物传感器。

进一步的,步骤(3)中FAM-DNA溶液加入二氧化锰纳米片反应不同时间,反应5min
FAM荧光能达到最大程度的猝灭。

进一步的,步骤(3)中FAM-DNA最终浓度为100nM,二氧化锰纳米片浓度为0.2mg/
mL;

进一步的,步骤(3)中的混合液,用荧光仪检测荧光强度。

具体的,步骤(4)为:在步骤(3)?#26800;?#21040;的混合液中,加入40μL维生素C磷酸酯镁和
不同体积的碱性磷酸酶,在37℃的恒温箱中反应30min,使维生素C磷酸酯镁与碱性磷酸酶
充分反应生成抗坏血酸,还原二氧化锰纳米片,释放出FAM-DNA,恢复荧光,得到“开”的荧光
生物传感器。

进一步的,步骤(4)中FAM-DNA最终浓度为100nM,二氧化锰纳米片浓度为0.2mg/
Ml,维生素C磷酸酯镁的最终浓度为0.02M,和碱性磷酸酶的最终浓度分别为5.0U/L,10.0U/
L,20.0U/L,30.0U/L,50.0U/L,100.0U/L,150.0U/L,200.0U/L,300.0U/L,400.0U/L,
500.0U/L;

进一步的,步骤(4)中碱性磷酸酶用0.01M,pH值为8.12含有5mM氯化镁和0.1mM氯
化锌的Tris-HCl缓冲溶?#21512;?#37322;;

进一步的,步骤(4)中的混合液,用荧光仪检测荧光强度,构建线性关系,实现对碱
性磷酸酶活性的检测。

由于二氧化锰纳米片可以吸附FAM-DNA,猝灭其荧光信号,因?#31169;档?#32972;景信号,而
维生素C磷酸酯镁与碱性磷酸酶反应生成抗坏血酸使二氧化锰纳米片还原成锰离子,释放
出FAM-DNA并恢复荧光信号,而FAM-DNA的荧光信号强度与抗坏血酸的浓度相关,也就与碱
性磷酸酶的浓度有关。随着碱性磷酸酶浓度的增加,FAM-DNA的荧光信号强度会随之增加,
因此,此荧光传感器可对不同浓度的碱性磷酸酶活性检测。

优选实施例1

一种基于二维二氧化锰纳米片--荧光探针构建的荧光传感平台的方法,包括以下
步骤:

(1)、配置10mM的高锰酸钾溶液和0.1M,pH=6.0的吗啉?#19968;?#37240;缓冲溶液,用于合成
二氧化锰纳米片。

(2)、将购买的FAM-DNA序列(FAM-DNA:FAM-AAA AAA AAA AAA AAA)溶解在0.1M
Tris-HCl(pH 7.4)缓冲溶液中,并在4℃下保存备用;将购买的碱性磷酸酶溶解在0.01M pH
=8.12?#28082;?#26377;5mM氯化镁和0.1mM氯化锌的Tris-HCl缓冲溶液中,并在-4℃下保存备用。

(3)、将5ml高锰酸钾溶液加入到12ml吗啉?#19968;?#37240;缓冲溶液中,将混合液超声30分
?#26377;?#25104;棕褐色溶液,然后将超声后的混合液7000rpm离心15?#31181;櫻?#29992;去离子水和乙醇洗涤沉
淀,去除残余反应物,再将沉淀在60℃?#31245;錚?#26368;后,将沉淀超声分散在50ml去离子水中。

(4)、取一定量步骤(3)得到的二氧化锰纳米片溶液,加入40ul FAM-DNA溶液,混合
均匀,在37℃放置5min,使FAM-DNA荧光衰减,得到“关闭”的荧光生物传感器;

(5)、重复步骤(4)后,再加入40μL维生素C磷酸酯镁和不同体积的碱性磷酸酶,在
37℃的恒温箱中反应30min,使维生素C磷酸酯镁与碱性磷酸酶充分反应生成抗坏血酸,还
原二氧化锰纳米片,释放出FAM-DNA,恢复荧光,得到“开”的荧光生物传感器;

一种基于二维二氧化锰纳米片--荧光探针构建的荧光传感平台的方法及应用,具
体方法为:

a、将5ml高锰酸钾溶液加入到12ml吗啉?#19968;?#37240;缓冲溶液中,将混合液超声30?#31181;?br />形成棕褐色溶液,然后将超声后的混合液7000rpm离心15?#31181;櫻?#29992;去离子水和乙醇洗涤沉
淀,去除残余反应物,再将沉淀在60℃?#31245;錚?#26368;后,将沉淀超声分散在50ml去离子水中;

实验中,二氧化锰纳米片通过扫描电子显微镜(图2A)和透射电子显微镜(图2B)表
征,证明合成的二氧化锰纳米片是理想的;

b、在含有100nM的FAM-DNA溶液中分别加入不同浓度的二氧化锰纳米片,浓度分别
为0.0,0.02,0.04,0.06,0.08,0.12,0.16,0.20,0.30,0.40,and 0.50mg/ml,混合均匀,在
37℃放置5min,使FAM-DNA荧光衰减,分别测检测荧光强度。

实验在含有0.02~0.5mg/mL的二氧化锰时都可以进行,但是从0.20mg/ml时信号
衰减缓慢,所以选择0.20mg/ml L二氧化锰纳米片作为实验最优条件。

c、在100nM的FAM-DNA溶液中,加入0.20mg/ml二氧化锰纳米片,混合均匀,反应
5min后,再加入40μL维生素C磷酸酯镁和30μL的碱性磷酸酶,混合均匀,在37℃放置30min,
二氧化锰纳米片被还原成锰离子,FAM-DNA成游离态,恢复荧光。证明该实验具有可行性。

优选实施例2

一种基于二维二氧化锰纳米片--荧光探针构建的荧光传感平台的方法,包括以下
步骤:

在含有0.2mg/ml的二氧化锰纳米片溶液中加入40ul FAM-DNA溶液,混合均匀,在
37℃放置5min,使FAM-DNA荧光衰减,再加入维生素C磷酸酯镁和碱性磷酸酶,在37℃的恒温
箱中反应30min,使维生素C磷酸酯镁与碱性磷酸酶充分反应生成抗坏血酸,还原二氧化锰
纳米片,释放出FAM-DNA,恢复荧光,得到“开”的荧光生物传感器。

一种基于二维二氧化锰纳米片--荧光探针构建的荧光传感平台的方法及应用,具
体方法为:

a、在一系列含有0.2mg/ml的二氧化锰纳米片溶液中分别加入40ul FAM-DNA溶液,
混合均匀,在37℃放置5min,使FAM-DNA荧光衰减,再分别加入维生素C磷酸酯镁和碱性磷酸
酶,在37℃的恒温箱中分别反应5、10、15、20、25、30、35min,检测FAM-DNA的荧光强度。

实验体系的荧光信号强度随着反应时间的增加而增加,但经过实验数据的比较,
如图4A,实验反应时间超过30min后荧光信号增加不明显,所以选择实验反应时间30min为
最优条件。

b、在一系列含有0.2mg/ml的二氧化锰纳米片溶液中分别加入40ul FAM-DNA溶液,
混合均匀,在37℃放置5min,使FAM-DNA荧光衰减,再分别加入维生素C磷酸酯镁和碱性磷酸
酶,在不同温度的恒温箱中30min,检测FAM-DNA的荧光强度。

实验体系分别在20、30、35、40、50、60℃反应30min,如图4B,由荧光恢复强度可知
实验的培养温度为37℃时,实验的效果最好。

c、在一系列含有0.2mg/ml的二氧化锰纳米片溶液中分别加入40ul FAM-DNA溶液,
混合均匀,在37℃放置5min,使FAM-DNA荧光衰减,再分别加入维生素C磷酸酯镁和碱性磷酸
酶,分别使用pH值分别为6,7,7.5,8,8.5,9,10的Tris-HCl缓冲溶液,在37℃的恒温箱中反
应30min,检测FAM-DNA的荧光强度。

实验体系的环境对实验结果有很大影响,如图4C,所用缓冲溶液的pH值为8.5实验
结果最?#36873;?br />

d、在一系列含有0.2mg/ml的二氧化锰纳米片溶液中加入40ul FAM-DNA溶液,混合
均匀,在37℃放置5min,使FAM-DNA荧光衰减,再加入不同浓度的维生素C磷酸酯镁和30ul碱
性磷酸酶,在37℃的恒温箱中反应30min,检测FAM-DNA的荧光强度。

实验中的维生素C磷酸酯镁浓度可在0.002-0.025M之间,但经过实验数据的比较,
如图4D,维生素C磷酸酯镁浓度为0.020M,实验的效果最好。

e、在含有0.2mg/ml的二氧化锰纳米片溶液中加入40ul FAM-DNA溶液,混合均匀,
在37℃放置5min,使FAM-DNA荧光衰减,再加入0.02M维生素C磷酸酯镁和不同浓度的碱性磷
酸酶,在37℃的恒温箱中反应30min,检测FAM-DNA的荧光强度。

在最优实验条件下,碱性磷酸酶的最终浓度分别为5.0U/L,10.0U/L,20.0U/L,
30.0U/L,50.0U/L,100.0U/L,150.0U/L,200.0U/L,300.0U/L,400.0U/L,500.0U/L;检测荧
光恢复强度,构建线性关系,实现对碱性磷酸酶活性的检测。

本申请的检测结果与现有技术相比,结果如下:

碱性磷酸酶检测方法
检测范围
参考文献
本申请
5-500U/L
本申请
比色
5-100mU/mL
Gao et.al.(2014)
比色
20–200U/L
Yang et.al.(2015)
电化学
1-20U/ml
Miao et.al.(2011)
荧光
3.4--100.0U/L
Tang et.al.(2016)
荧光
0.1—10U/L
Zhang et.al.(2015
荧光
0–30U L1
Li et.al.(2014)

上面结合附图对本发明进行了示例性描述,?#21248;?#26412;发明具体实现并不受上述方式
的限制,只要采用了本发明的方法构思和技术方?#38468;?#34892;的各种改进,或未经改进直接应用
于其它场合的,均在本发明的保护范围之内。

关于本文
本文标题:一种荧光生物传感器,其制备方法以及用途.pdf
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