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一种蛋白类生物大分子快速偶联标记色素基团试剂盒.pdf

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一种 蛋白 生物 大分子 快速 标记 色素 基团 试剂盒
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摘要
申请专利号:

CN201610412013.9

申请日:

2016.06.13

公开号:

CN106483295A

公开日:

2017.03.08

当前法律状态:

撤回

有效性:

无权

法?#19978;?#24773;: 发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):G01N 33/68申请公布日:20170308|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/68申请日:20160613|||公开
IPC分类号: G01N33/68; G01N33/58 主分类号: G01N33/68
申请人: 苏州泽科生物科技有限公司
发明人: 吴永红; 吴敏; 孙杨东; 王长振; 陈孝羽; 周奉雪; 张立松; 刘丹丹
地址: 215125 江苏省苏州市工业园区星湖街218号生物纳?#33258;癆4楼419室
优?#28909;ǎ?/td>
专利代理机构: 代理人:
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法律状态
申请(专利)号:

CN201610412013.9

授权公告号:

||||||

法律状态公告日:

2018.08.28|||2017.04.05|||2017.03.08

法律状态类型:

发明专利申请公布后的视为撤回|||实质审查的生效|||公开

摘要

本发明涉及一种蛋白类生物大分子快速偶联标记色素基团试剂盒,可实现任何蛋白类生物大分子的不同色素基团偶联标记,具体包括色素溶解液、蛋白偶联标记液和阳性对照品。为了实现上述目的,本发明提供了一种蛋白类生物大分子快速偶联标记色素基团的方法,包括以下步骤:1)?根据不同色素基团特性配置不同色素溶解液;2)?根据不同色素基团特性配置通用性蛋白偶联标记液;3)?根据染料的溶解特性采用色素溶解液溶解备用;4)?按照一定比例加入色素和待染蛋白类生物大分子,混合后特定温度孵育,制备样品后采用SDS?PAGE检测。5)?根据上述SDS?PAGE检测结果,可采用不同分离方法进行色素基团标记蛋白类生物大分子分离以获得纯品。

权利要求书

1.一种蛋白类生物大分子快速偶联标记色素基团的方法,包括以下步骤:
1) 根据不同色素基团特性配置不同色素溶解液;
2) 根据不同色素基团特性配置蛋白偶联标记液;
3) 根据染料的溶解特性采用色素溶解液溶解备用;
4) 按照一定比例加入色素和待染蛋白类生物大分子,混合后特定温度孵育,制备样品
后采用SDS-PAGE检测。
5) 根据上述SDS-PAGE检测结果,可采用不同分离方法进行色素基团标记蛋白类生物
大分子分离以获得纯品。
2.根据权利1所述的色素基团,其特征在于,包括酸性染料、碱性染料、活性染料等适用
于蛋白质?#23435;?#26579;色的纺织品染料,特别是活性染料。
3.根据权利1所述的色素溶解液,其特征在于,由20mM Tris-HCl缓冲液、100mM NaCl、
50mM尿素组成。
4.根据权利1所述的蛋白偶联标记液,其特征在于,由20mM Tris-HCl缓冲液、100mM
NaCl、100mM NaHCO3组成。
5.根据权利1所述的染料颜色,其特征在于,包括红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等七种颜色中
任何一种,或是任何一种或几种染色组合。
6.根据权利1所述的分离方法,其特征在于,可为凝胶过滤、透析、凝胶回收等。
7.一种蛋白类生物大分子快速偶联标记色素基团试剂盒,可实现任何蛋白类生物大分
子的不同色素基团偶联标记,具体包括色素溶解液,蛋白偶联标记液和阳性对照品。

说明书

一种蛋白类生物大分子快速偶联标记色素基团试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域一种蛋白类生物大分子快速偶联标记色素基团试剂盒,
具体指色素溶解液、蛋白偶联标记液和阳性对照品。

背景技术

蛋白质基本组成单元为氨基酸,不同氨基酸以“脱水缩合”的方式组成多肽链,进
而折叠形成具有特定空间结构的生物大分子。目前,自然界中共发现20种天然氨基酸,每种
氨基酸至少含有一个羧基(-COOH)、一个氨基(-NH2)、一个氢原子和一个侧链基团(-R)。其
中,侧链基团是各种氨基酸的主要区别基团。氨基酸通过脱水缩合形成蛋白质肽段后,每个
多肽链至少含有一个羧基(-COOH)和一个氨基(-NH2),该基团可作为亲核试剂与带正电荷
或部分正电荷的碳原子发生亲核取代或亲核加成反应形成?#24067;?#38190;,进而使色素基团与蛋白
?#20351;布?#20598;联而显色。同样地,氨基酸中的侧链基团也可能含有亲核试剂,如羧基(-OH)、巯基
(-SH)、?#21069;?#22522;(-NH-)等,可与蛋白质发生反应进而实现色素基团标记。因此,利用氨基酸中
特定基团的亲核特性,在一定条件下实现色素基团的?#24067;?#20598;联,进而可实现蛋白类生物大
分子的不同色素基团标记。

本发明旨在基于色素基团的不同特性提供一种蛋白类生物大分子快速偶联标记
方法,通过该试剂盒可实现不同色素基团对不同蛋白?#23454;?#24555;速标记,进而使偶联标记的蛋
白类生物大分子呈现标记色素基团的颜色。本发明提供一种可大规模制备及生产不同色素
基团偶联标记蛋白类生物大分子的试剂盒,该试剂盒根据不同色素基团特性制定了最优偶
联标记液,结合阳性对照品可实现不同色素基团的快速偶联标记蛋白类生物大分子,具有
操作简单、成本低、速度快、产量大、特异性高等特点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种蛋白类生物大分子快速偶联标记色素基团试剂盒,可
实现任何蛋白类生物大分子的不同色素基团偶联标记,具体包括蛋白偶联标记液和阳性对
照品。

为了实现上述目的,本发明提供了一种蛋白类生物大分子快速偶联标记色素基团
的方法,包括以下步骤:

1) 根据不同色素基团特性配置不同色素溶解液;

2) 根据不同色素基团特性配置通用性蛋白偶联标记液;

3) 根据染料的溶解特性采用色素溶解液溶解备用;

4) 按照一定比例加入色素和待染蛋白类生物大分子,混合后特定温度孵育,制备样品
后采用SDS-PAGE检测。

5) 根据上述SDS-PAGE检测结果,可采用不同分离方法进行色素基团标记蛋白类
生物大分子分离以获得纯品。

上述步骤1)所述不同色素基团,可为酸性染料、碱性染料、活性染料等适用于蛋白
质?#23435;?#26579;色的染料,特别是活性染料。

上述步骤1)所述色素溶解液,由20mM Tris-HCl缓冲液、100mM NaCl、50mM尿素组
成。

上述步骤2)所述的蛋白偶联标记液,由20mM Tris-HCl缓冲液、100mM NaCl、100mM
NaHCO3组成。

上述步骤3)所述染料,可为红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等七种颜色中任何一种,或是
任何一种或几种染色组合。

上述步骤4)所述分离方法,可为凝胶过滤、透析、凝胶回收等。

本发明提供了一种蛋白类生物大分子快速偶联标记色素基团的试剂盒,包括色素
溶解液、蛋白偶联标记液和阳性对照品。基于前期测试的最优反应体系,可以利用不同染料
特性快速地将蛋白类生物大分子偶联标记色素基团,从而将指定蛋白显示出不同的颜色。

附图说明

图1. 活性红偶联标记牛血清白蛋白最优条件确定;

图2. 活性蓝偶联标记牛血清白蛋白最优条件确定;

图3. 活性黄偶联标记牛血清白蛋白最优条件确定;

图4. 活性紫偶联标记牛血清白蛋白最优条件确定。

具体实施方式

通过以下实施例对本发明作进一步的阐述,但下述实施例仅是一个例子,并不作
为本发明的限制,在不偏离本发明的情况下,本发明的主要特征可以用于各种实施方式。

实施例1

活性红偶联标记牛血清白蛋白最优条件探索

1. 实验目的:研究活性红偶联标记蛋白的最优pH值和温度;

2.实验分组:根据pH值(6,7,8,9)与反应温度(60℃,70℃,80℃)交叉共分成12组。

实验步骤:

1) 色素溶解液和蛋白偶联标记液配置:

a. 色素溶解液:20mM Tris-base + 100mM NaCl + 50mM尿素;

b. 蛋白偶联标记液:20mM Tris-base + 100mM NaCl + 100mM NaHCO3;

根据上述缓冲液浓度称取一定质量的相关试剂,采用HCl调节pH值至6.0,7.0,8.0,滤
纸过滤备用。

活性红母液配置:

根据活性红活性基团数量?#22242;?#34880;清白蛋白的氨基数量关系,称取适量活性红,采用上
述配置的不同pH值色素溶解液室温振荡溶解至?#24352;?#24230;50mg/ml,5000rpm离心5min,取上清
液作为母液备用。

牛血清白蛋白母液配置:

称取适量牛血清白蛋白,采用上述配置的不同pH值蛋白偶联标记液室温振荡溶解至终
浓度5.0mg/ml,5000rpm离心5min,取上清液作为母液备用。

活性红偶联标记牛血清白蛋白:

根据上述配置的母液按照10:1的比例采用蛋白偶联标记液稀释至?#24352;?#24230;1mg/ml,分别
采用60℃、70℃和80℃三个温度梯度孵育60min,12000rpm室温离心10min,吸取上清,加入
适量 5×蛋白上样缓冲液, 95℃水浴锅煮样10 min备用。

检测:

按照聚丙烯酰?#32442;?#33014;配置方法制备12.5%的SDS-PAGE胶,按照15μl/孔加入胶孔,浓缩
胶:100V 10 min,分离胶:200V 40min,蛋白分离后取出凝胶直接采用照相机拍照采集图
片。

实验结果:

如图1所示,随着孵育时间的增加,活性红偶联标记牛血清白蛋白的量逐渐增加。同时,
随着反应体系pH值的增加,活性红偶联标记牛血清白蛋白的量先增加后?#26723;停?#22312; pH=7.0,
反应温度95℃时最?#36873;?br />

实施例2

活性蓝偶联标记牛血清白蛋白最优条件探索

1. 实验目的:研究活性蓝偶联标记蛋白的最优pH值和温度;

2. 实验分组:根据pH值(6,7,8,9)与反应温度(60℃,70℃,80℃)交叉共分成12组。

实验步骤:

1) 色素溶解液和蛋白偶联标记液配置:

a. 色素溶解液:20mM Tris-base + 100mM NaCl + 50mM尿素;

b. 蛋白偶联标记液:20mM Tris-base + 100mM NaCl + 100mM NaHCO3;

根据上述缓冲液浓度称取一定质量的相关试剂,采用HCl调节pH值至6.0,7.0,8.0,滤
纸过滤备用。

活性蓝母液配置:

根据活性蓝活性基团数量?#22242;?#34880;清白蛋白的氨基数量关系,称取适量活性蓝,采用上
述配置的不同pH值色素溶解液室温振荡溶解至?#24352;?#24230;50mg/ml,5000rpm离心5min,取上清
液作为母液备用。

牛血清白蛋白母液配置:

称取适量牛血清白蛋白,采用上述配置的不同pH值蛋白偶联标记液室温振荡溶解至终
浓度5.0mg/ml,5000rpm离心5min,取上清液作为母液备用。

活性蓝偶联标记牛血清白蛋白:

根据上述配置的母液按照10:1的比例采用蛋白偶联标记液稀释至?#24352;?#24230;1mg/ml,分别
采用60℃、70℃和80℃三个温度梯度孵育60min,12000rpm室温离心10min,吸取上清,加入
适量 5×蛋白上样缓冲液, 95℃水浴锅煮样10 min备用。

检测:

按照聚丙烯酰?#32442;?#33014;配置方法制备12.5%的SDS-PAGE胶,按照15μl/孔加入胶孔,浓缩
胶:100V 10 min,分离胶:200V 40min,蛋白分离后取出凝胶直接采用照相机拍照采集图
片。

实验结果:

如图1所示,随着孵育时间的增加,活性蓝偶联标记牛血清白蛋白的量逐渐增加。同时,
随着反应体系pH值的增加,活性蓝偶联标记牛血清白蛋白的量先增加后?#26723;停?#22312; pH=7.0,
反应温度95℃时最?#36873;?br />

实施例3

活性黄偶联标记牛血清白蛋白最优条件探索

1. 实验目的:研究活性黄偶联标记蛋白的最优pH值和温度;

2. 实验分组:根据pH值(6,7,8,9)与反应温度(60℃,70℃,80℃)交叉共分成12组。

实验步骤:

1) 色素溶解液和蛋白偶联标记液配置:

a. 色素溶解液:20mM Tris-base + 100mM NaCl + 50mM尿素;

b. 蛋白偶联标记液:20mM Tris-base + 100mM NaCl + 100mM NaHCO3;

根据上述缓冲液浓度称取一定质量的相关试剂,采用HCl调节pH值至6.0,7.0,8.0,滤
纸过滤备用。

活性黄母液配置:

根据活性黄活性基团数量?#22242;?#34880;清白蛋白的氨基数量关系,称取适量活性黄,采用上
述配置的不同pH值色素溶解液室温振荡溶解至?#24352;?#24230;50mg/ml,5000rpm离心5min,取上清
液作为母液备用。

牛血清白蛋白母液配置:

称取适量牛血清白蛋白,采用上述配置的不同pH值蛋白偶联标记液室温振荡溶解至终
浓度5.0mg/ml,5000rpm离心5min,取上清液作为母液备用。

活性黄偶联标记牛血清白蛋白:

根据上述配置的母液按照10:1的比例采用蛋白偶联标记液稀释至?#24352;?#24230;1mg/ml,分别
采用60℃、70℃和80℃三个温度梯度孵育60min,12000rpm室温离心10min,吸取上清,加入
适量 5×蛋白上样缓冲液, 95℃水浴锅煮样10 min备用。

检测:

按照聚丙烯酰?#32442;?#33014;配置方法制备12.5%的SDS-PAGE胶,按照15μl/孔加入胶孔,浓缩
胶:100V 10 min,分离胶:200V 40min,蛋白分离后取出凝胶直接采用照相机拍照采集图
片。

实验结果:

如图1所示,随着孵育时间的增加,活性黄偶联标记牛血清白蛋白的量逐渐增加。同时,
随着反应体系pH值的增加,活性黄偶联标记牛血清白蛋白的量先增加后?#26723;停?#22312; pH=7.0,
反应温度95℃时最?#36873;?br />

实施例4

活性紫偶联标记牛血清蛋白最优条件探索

1. 实验目的:研究活性紫偶联标记蛋白的最优pH值和温度;

2. 实验分组:根据pH值(6,7,8,9)与反应温度(60℃,70℃,80℃)交叉共分成12组。

实验步骤:

1) 色素溶解液和蛋白偶联标记液配置:

a. 色素溶解液:20mM Tris-base + 100mM NaCl + 50mM尿素;

b. 蛋白偶联标记液:20mM Tris-base + 100mM NaCl + 100mM NaHCO3;

根据上述缓冲液浓度称取一定质量的相关试剂,采用HCl调节pH值至6.0,7.0,8.0,滤
纸过滤备用。

活性紫母液配置:

根据活性紫活性基团数量?#22242;?#34880;清白蛋白的氨基数量关系,称取适量活性紫,采用上
述配置的不同pH值色素溶解液室温振荡溶解至?#24352;?#24230;50mg/ml,5000rpm离心5min,取上清
液作为母液备用。

牛血清白蛋白母液配置:

称取适量牛血清白蛋白,采用上述配置的不同pH值蛋白偶联标记液室温振荡溶解至终
浓度5.0mg/ml,5000rpm离心5min,取上清液作为母液备用。

活性紫偶联标记牛血清白蛋白:

根据上述配置的母液按照10:1的比例采用蛋白偶联标记液稀释至?#24352;?#24230;1mg/ml,分别
采用60℃、70℃和80℃三个温度梯度孵育60min,12000rpm室温离心10min,吸取上清,加入
适量 5×蛋白上样缓冲液, 95℃水浴锅煮样10 min备用。

检测:

按照聚丙烯酰?#32442;?#33014;配置方法制备12.5%的SDS-PAGE胶,按照15μl/孔加入胶孔,浓缩
胶:100V 10 min,分离胶:200V 40min,蛋白分离后取出凝胶直接采用照相机拍照采集图
片。

实验结果:

如图1所示,随着孵育时间的增加,活性紫偶联标记牛血清白蛋白的量逐渐增加。同时,
随着反应体系pH值的增加,活性紫偶联标记牛血清白蛋白的量先增加后?#26723;停?#22312; pH=7.0,
反应温度95℃时最?#36873;?br />

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