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一种肠出血性大肠杆菌O157H7检测平台及其制备方法.pdf

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一种 血性 大肠杆菌 O157H7 检测 平台 及其 制备 方法
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摘要
申请专利号:

CN201610896810.9

申请日:

2016.10.14

公开号:

CN106483288A

公开日:

2017.03.08

当前法律状态:

授权

有效性:

有权

法?#19978;?#24773;: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/569申请日:20161014|||公开
IPC分类号: G01N33/569; G01N27/04 主分类号: G01N33/569
申请人: 哈尔滨工业大学
发明人: 刘绍琴; 颜美; 李天婵
地址: 150000 黑龙江省哈尔滨市南岗区西大直街92号
优?#28909;ǎ?/td>
专利代理机构: 哈尔滨龙科专利代理有限公司 23206 代理人: 高媛
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法律状态
申请(专利)号:

CN201610896810.9

授权公告号:

||||||

法律状态公告日:

2018.01.30|||2017.04.05|||2017.03.08

法律状态类型:

授权|||实质审查的生效|||公开

摘要

本发明公开了一种肠出血性大肠杆菌O157:H7检测平台及其制备方法,所述检测平台包括以下两部分:(1)电化学阻抗芯片:用于捕获肠出血性大肠杆菌O157:H7;(2)基于?#26041;?#23548;等温扩增技术的微流控芯片:用于鉴定以及定量肠出血性大肠杆菌O157:H7。在不需要复杂设备的前提下,本发明的检测平台对于肠出血性大肠杆菌O157:H7的检测限为1CFU/mL。相比其他检测方法,此检测平台检测快速、灵敏度高、成本低、操作简便。本发明的建立和应用将缩短肠出血性大肠杆菌0157:H7的检测周期,可为今后肠出血性大肠杆菌0157:H7的检测提供有力的技术支持,对于致病菌进行快速检测与识别、医疗诊断以及食品安全具有重大的意义。

权利要求书

1.一种肠出血性大肠杆菌O157:H7检测平台,其特征在于所述检测平台由以下两部分
构成:(1)电化学阻抗芯片:用于捕获肠出血性大肠杆菌O157:H7;(2)基于?#26041;?#23548;等温扩增
技术的微流控芯片:用于鉴定以及定量肠出血性大肠杆菌O157:H7。
2.一种权利要求1所述的肠出血性大肠杆菌O157:H7检测平台的制备方法,其特征在于
所述方法具体?#34903;?#22914;下:
一、电化学阻抗芯片的制备:
a、ITO基底的处理
(1)ITO基底分别用异丙醇、丙酮、去离子水超声清洗,用水彻底清洗后,在V氨水:V过氧化氢:
V水=1:1:5的溶液中密封条件80~90℃煮1~2 h,最后用水清洗,N2吹干;(2)将清洗后的ITO
基底在室温下浸在3-氨丙基三?#24050;?#22522;硅烷的甲苯溶液中,静置反应12~24 h,然后用丙酮
和去离子水反复冲洗,N2吹干,4 ℃保存;
b、多壁碳纳米管的预处理
(1)称取MWCNTs置于浓硫酸和浓硝酸的混酸溶液中,200~250 W超声6~24 h,使其分
散成均匀的黑色溶液;(2)反复洗涤使滤液pH接近中性,真空?#31245;?#31665;烘干,然后用PSS溶液将
MWCNTs 制成多壁碳纳米管溶液;
c、多壁碳纳米管薄膜的制备
(1)经过预处理的ITO基底首先放入PSS溶液中5~10 min,去离子水洗净后,N2吹干;(2)
再将ITO基底放入PEI溶液中5~10 min,用去离子水洗净,N2吹干,得到表面覆盖有PSS/PEI
聚电解质复合层的ITO基底,将其放入多壁碳纳米管溶液中5~10 min,去离子水洗净,N2吹
干;(3)重复操作?#34903;瑁?),得到PSS/(PEI/MWCNTs)n的薄膜;
d、抗体的固定
(1)将组装有多层碳纳米管薄膜的ITO基底放入交联剂EDC和NHS的溶液中,在室温?#33455;?br />置2~3 h对羧基进行活化,之后用去离子水洗去残留的交联剂,并用N2吹干;(2)在ITO基底
表面上滴加anti-E.coli O157:H7多克隆抗体,均匀涂开,在4 ℃的冰箱里放置24~36 h,
确保抗体充分有效地吸附;(3)用1%BSA溶液在室温下处理连接有抗体的ITO基底1~2 h,以
封闭ITO电极表面未结合抗体的活性位点,防止假阳性结果的产生;(4)所制得ITO电极再分
别用PBS和蒸馏水冲洗3~5次,吹干,于4 ℃保存备用;
二、基于?#26041;?#23548;等温扩增技术的微流控芯片的制备
a、LAMP反应体系的建立
通过针对E.coli O157:H7的rfbE特异性基因设计内引物FIP、BIP和外引物F3、B3,并建
立LAMP反应体系;
b、微流控芯片的制备:
(1)使用PMMA作为微流控芯片模具,PDMS作为芯片的材?#21097;?#23558;PDMS单体与固化剂按10~
12:1的质量比混合,搅拌均匀,放入真空?#31245;?#31665;内抽真空?#38597;藎?#28982;后将之?#34903;?#21040;PMMA模板
上,置于烘箱加热使PDMS固化;(2)将固化的PDMS芯片与载玻片基底经过等离子体清洗后共
价键合,制成用于 LAMP 反应的平行微流控管道。
3.根据权利要求2所述的肠出血性大肠杆菌O157:H7检测平台的制备方法,其特征在于
所述3-氨丙基三?#24050;?#22522;硅烷的甲苯溶液的质量分数为1~3%。
4.根据权利要求2所述的肠出血性大肠杆菌O157:H7检测平台的制备方法,其特征在于
所述PSS溶液的浓度为0.5~1mg/mL。
5.根据权利要求2所述的肠出血性大肠杆菌O157:H7检测平台的制备方法,其特征在于
所述PEI溶液的浓度为0.5~1mg/mL。
6.根据权利要求2所述的肠出血性大肠杆菌O157:H7检测平台的制备方法,其特征在于
所述多壁碳纳米管溶液的浓度为0.5~1mg/mL。
7.根据权利要求2所述的肠出血性大肠杆菌O157:H7检测平台的制备方法,其特征在于
所述交联剂EDC的浓度为45 mM,NHS的浓度为15 mM。
8.根据权利要求2所述的肠出血性大肠杆菌O157:H7检测平台的制备方法,其特征在于
所述anti-E.coli O157:H7多克隆抗体的浓度为5~20μg/mL。
9.根据权利要求2所述的肠出血性大肠杆菌O157:H7检测平台的制备方法,其特征在于
所述外引物F3的序列为AACTACTGTAAGTAATGGAACG,外引物B3的序列为
GTGATTTTTTGTTCTATGTCACT,内引物FIP的序列为
TGTTGGAACAATAACTTCATCTCCTGTTGCTCTTCATTTAGCTTTG,内引物BIP的序列为
AATGCTATAAAATACACAGGAGCCACAGACATTTGCCAAGTTTCA。
10.根据权利要求2或9所述的肠出血性大肠杆菌O157:H7检测平台的制备方法,其特征
在于所述LAMP反应体系为25μL,ThermoPol buffer为1?#31890;琈g2+浓度为6~12 mM;dNTPs浓度
为0.6~1.2 mM,外引物浓度为0.05~0.25 μM,内引物浓度为0.4~2.0 μM,Betaine浓度为
0.8~1.4M,反应温度为60~65 ℃,反应时间为30~60 min,金纳米粒?#20248;?#24230;为0.031~
0.071 nM,模板DNA含量为2μL,Bst DNA聚合酶的含量为0.8~1.2μL。

说明书

一种肠出血性大肠杆菌O157:H7检测平台及其制备方法

技术领域

本发明属于分析检测技术领域,涉及一种用于肠出血性大肠杆菌O157:H7的检测
平台及其制备方法。

背景技术

肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC)是近十余年
来才认识到的一种新人畜?#19981;?#30340;致泻性大肠杆菌,其中O157:H7是与人出血性结肠炎和溶
血性尿毒综合症有关的主要血清型,是一类威胁人类健康的重要致病菌。1982年美国首次
从血性腹泻病人的粪便标本中分离得到该菌,并报道与食用汉堡牛肉饼有关。此后,美国、
加拿大、英国、日本等西方国家和我国报道的由 EHEC O157:H7引起的暴发和散发病例?#26438;?br />增加。疾病控制中心评估显示在美国每6个人?#33455;?#26377;一个感染致病菌,将近125000人因此就
医,大约3000个病例因此过早死亡。在这些致病菌中,EHEC O157:H7是能引起严重的疾病和
死亡的食源性致病菌之一。

快速检测和鉴定肠出血性大肠杆菌O157:H7是预防感染此菌的关键。目前,检测和
鉴定此菌最常用的方法是培养基培养的方法,?#34903;?#32321;琐?#28082;?#26102;比较长。因此大量的检测方
法被发明,包括酶联免疫法、PCR、石英晶体微天平(QCM)?#20302;場?#34920;面等离子体共振(SPR)等方
法。虽然这些方法节省了检测时间,但是在应用时受到了各种限制。比如,PCR检测的方法需
要昂贵的设备,复杂的试剂以及?#33455;?#39564;的技术人?#20445;?#25152;以迫切需要一种快速简便、易操作的
检测技术。

发明内容

针对上述问题,本发明提供了一种肠出血性大肠杆菌O157:H7检测平台及其制备
方法,将包被有抗体的多层碳纳米管薄膜的电化学阻抗芯片与基于?#26041;?#23548;等温扩增技术的
微流控芯片进行结合来捕获和识别肠出血性大肠杆菌O157:H7,包被有抗体的多层碳纳米
管薄膜可以选择性地捕获、培养以及释放目的细菌,之后被捕获的细菌裂解释放核酸在微
流控芯片中进行?#26041;?#23548;等温扩增。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的:

一种肠出血性大肠杆菌O157:H7检测平台,包括以下两部分:(1)电化学阻抗芯片:用于
捕获肠出血性大肠杆菌O157:H7;(2)基于?#26041;?#23548;等温扩增技术的微流控芯片:用于鉴定以
及定量肠出血性大肠杆菌O157:H7。

一种上述肠出血性大肠杆菌O157:H7检测平台的制备方法,具体?#34903;?#22914;下:

一、电化学阻抗芯片的制备:

a、ITO基底的处理

(1)ITO基底分别用异丙醇、丙酮、去离子水超声清洗,用水彻底清洗后,在V氨水:V过氧化氢:
V水=1:1:5的溶液中密封条件80~90℃煮1~2 h,最后用水清洗,N2吹干;(2)将清洗后的ITO
基底在室温下浸在3-氨丙基三?#24050;?#22522;硅烷的甲苯溶液中,静置反应12~24 h,然后用丙酮
和去离子水反复冲洗,N2吹干,4 ℃保存。

b、多壁碳纳米管的预处理

(1)称取MWCNTs置于浓硫酸和浓硝酸的混酸溶液中,200~250 W超声6~24 h,使其分
散成均匀的黑色溶液;(2)反复洗涤使滤液pH接近中性(pH≈7),真空?#31245;?#31665;烘干,然后用
PSS溶液将MWCNTs 制成溶液。

c、多壁碳纳米管薄膜的制备

(1)经过预处理的ITO基底首先放入PSS溶液中5~10 min,去离子水洗净后,N2吹干;
(2)再将ITO基底放入PEI溶液中5~10 min,用去离子水洗净,N2吹干,得到表面覆盖有PSS/
PEI聚电解质复合层的ITO基底,将其放入多壁碳纳米管溶液中5~10 min,去离子水洗净,
N2吹干;(3)重复操作?#34903;瑁?),得到PSS/(PEI/MWCNTs)n的薄膜。

d、抗体的固定

(1)将组装有多层碳纳米管薄膜的ITO基底放入交联剂EDC和NHS的溶液中,在室温?#33455;?br />置2~3 h对羧基进行活化,之后用去离子水洗去残留的交联剂,并用N2吹干;(2)在ITO基底
表面上滴加anti-E.coli O157:H7多克隆抗体,均匀涂开,在4 ℃的冰箱里放置24~36 h,
确保抗体充分有效地吸附;(3)用1%BSA溶液在室温下处理连接有抗体的ITO基底1~2 h,以
封闭ITO电极表面未结合抗体的活性位点,防止假阳性结果的产生;(4)所制得ITO电极再分
别用PBS和蒸馏水冲洗3~5次,吹干,于4 ℃保存备用。

二、基于?#26041;?#23548;等温扩增技术(LAMP)的微流控芯片的制备

a、LAMP反应体系的建立

通过针对E.coli O157:H7的rfbE特异性基因设计引物,包括内引物FIP、BIP和外引物
F3、B3一共四条引物,并对LAMP反应体?#21040;?#34892;优化和建立。

b、微流控芯片的制备

(1)使用聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)作为微流控芯片模具,聚二甲基硅氧烷(PDMS)作为
芯片的材?#21097;?#23558;PDMS单体与固化剂按10~12:1的质量比混合,搅拌均匀,放入真空?#31245;?#31665;内
抽真空?#38597;藎?#28982;后将之?#34903;?#21040;PMMA模板上,置于烘箱加热使PDMS固化;(2)将固化的PDMS芯
片与载玻片基底经过等离子体清洗后共价键合,制成用于 LAMP 反应的平行微流控管道。

本发明中,所述3-氨丙基三?#24050;?#22522;硅烷的甲苯溶液的质量分数为1~3%。

本发明中,所述PSS溶液、PEI溶液、多壁碳纳米管溶液的浓度均为0.5~1mg/mL。

本发明中,所述交联剂EDC的浓度为45 mM,NHS的浓度为15 mM。

本发明中,所述anti-E.coli O157:H7多克隆抗体的浓度为5~20μg/mL。

本发明中,所述LAMP体系中引物序列F3为AACTACTGTAAGTAATGGAACG,B3为
GTGATTTTTTGTTCTATGTCACT,FIP为TGTTGGAACAATAACTTCATCTCCTGTTGCTCTTCATTTAGCTTTG,
BIP为AATGCTATAAAATACACAGGAGCCACAGACATTTGCCAAGTTTCA。

本发明中,所述LAMP体系为25μL,ThermoPol buffer为1?#31890;琈g2+浓度为6~12 mM;
dNTPs浓度为0.6~1.2 mM,外引物浓度为0.05~0.25 μM,内引物浓度为0.4~2.0 μM,
Betaine浓度为0.8~1.4M,反应温度为60~65 ℃,反应时间为30~60 min,金纳米粒?#20248;?br />度为0.031~0.071 nM,模板DNA含量为2μL,Bst DNA聚合酶的含量为0.8~1.2μL。

在不需要复杂设备的前提下,本发明的检测平台对于肠出血性大肠杆菌O157:H7
的检测限为1CFU/mL。相比其他检测方法,此检测平台检测快速、灵敏度高、成本低、操作简
便。本发明的建立和应用将缩短肠出血性大肠杆菌0157:H7的检测周期,可为今后肠出血性
大肠杆菌0157:H7的检测提供有力的技术支持,对于致病菌进行快速检测与识别、医疗诊断
以及食品安全具有重大的意义。

附图说明

图1为肠出血性大肠杆菌O157:H7电化学阻抗芯片的制备流程图;

图2为基于?#26041;?#23548;等温扩增技术(LAMP)的微流控芯片的定量装置;

图3为检测平台对果汁中肠出血性大肠杆菌O157:H7的检测结果;

图4为检测平台对牛奶中肠出血性大肠杆菌O157:H7的检测结果。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明,但并不局限于此,凡是对本
发明技术方?#38468;?#34892;修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的精神和范围,均应涵盖
在本发明的保护范围中。

实施例1:

本实施例的肠出血性大肠杆菌O157:H7检测平台由两部分构成:(1)电化学阻抗芯片:
用于捕获肠出血性大肠杆菌O157:H7;(2)基于?#26041;?#23548;等温扩增技术的微流控芯片:用于鉴
定以及定量肠出血性大肠杆菌O157:H7。

实施例2:

如图1所示,本实施例所述的制备肠出血性大肠杆菌O157:H7的电化学阻抗芯片的方法
如下:

(1)ITO基底的处理:

ITO基底分别用异丙醇、丙酮、去离子水超声清洗10min,用水彻底清洗后,在V氨水:
V过氧化氢:V水=1:1:5的溶液中密封条件80 ℃煮1 h,最后用水清洗,N2吹干。将清洗后的ITO基
底在室温下浸在1%的3-氨丙基三?#24050;?#22522;硅烷的甲苯溶液中,静置反应12h,然后用丙酮和去
离子水反复冲洗,N2吹干,4 ℃保存。

(2)多壁碳纳米管的预处理

称取0.6gMWCNTs置于100mL V(H2SO4):V(HNO3)=3:l的混酸溶液中,200 W超声24 h,使
其分散成均匀的黑色溶液,反复洗涤使滤液pH接近中性,真空?#31245;?#31665;50 ℃烘干,然后用1
mg/mL的PSS溶液将MWCNTs 制成0.5 mg/mL的溶液。

(3)多壁碳纳米管薄膜的制备

PEI、PSS均配制成1 mg/mL的溶液,经过预处理的ITO基底首先放入PSS溶液中10 min,
去离子水洗净后,N2吹干。再将ITO基底放入PEI溶液中10 min,用去离子水洗净,N2吹干,得
到表面覆盖有PSS/PEI的聚电解质复合层的ITO基底,将其放入多壁碳纳米管溶液中10
min,去离子水洗净,N2吹干。如此重复操作,得到PSS/(PEI/MWCNTs)5的薄膜。

(4)抗体的固定

将组装有多层碳纳米管薄膜的ITO基底放入交联剂EDC(45 mM)和NHS(15 mM)的溶液
中,在室温?#33455;?#32622;2小时对羧基进行活化,之后用去离子水洗去残留的交联剂,并用N2吹干。
在ITO基底表面上滴加100 μL的10 μg/mL的anti-E.coli O157:H7多克隆抗体,均匀涂开,
在4 ℃的冰箱里放置24 h,确保抗体充分有效地吸附。

用1%BSA溶液在室温下处理连接有抗体的ITO基底1 h,以封闭ITO电极表面未结合
抗体的活性位点,防止假阳性结果的产生。所制得ITO电极再分别用PBS和蒸馏水冲洗3~5
次,吹干,于4 ℃保存备用。

实施例3:

本实施例所述的制备基于?#26041;?#23548;等温扩增技术(LAMP)的微流控芯片的方法如下:

(1)LAMP反应体系的建立

通过针对E.coli O157:H7的rfbE特异性基因设计引物,包括外引物F3
(AACTACTGTAAGTAATGGAACG)、外引物B3(GTGAT-TTTTTGTTCTATGTCACT)以及内引物FIP
(TGTTGGAACAATAA-CTTCATCTCCTGTTGCTCTTCATTTAGCTTTG)、内引物BIP(AA-
TGCTATAAAATACACAGGAGCCACAGACATTTGCCAAGTTTCA)一共四条引物。

LAMP反应体系为25 μL: 1xThermoPol buffer、8 mM Mg2+、0.8 M Betaine、1.0 mM
dNTPs、0.2 μM 外引物、1.6 μM 内引物、0.063 nM 金纳米粒子、2 μL 模板DNA和1 μL Bst
DNA聚合酶(8U)。反应条件为63 ℃恒温1 h。

(2)微流控芯片的制备

使用聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)作为微流控芯片模具,聚二甲基硅氧烷(PDMS)作为芯片
的材?#21097;?#21046;作出一个有八个平行管道的微流控芯片,管道长10 mm,宽0.6 mm,高0.8 mm,体
积约为5 μL。将PDMS单体与固化剂按质量比12:1混合,搅拌均匀,放入真空?#31245;?#31665;内抽真空
?#38597;藎?#28982;后将之?#34903;?#21040;PMMA模板上,置于80 ℃烘箱加热2小时使PDMS固化。固化的PDMS芯片
与载玻片基底经过等离子体清洗后共价键合,制成用于 LAMP 反应的平行微流控管道。

实施例4:

本实施例为本发明的检测平台对?#23548;?#26679;品果汁中肠出血性大肠杆菌O157:H7的检测结
果。检测?#34903;?#22914;下:

将从超市中买来的果汁中人为地加入肠出血性大肠杆菌O157:H7形成不同的浓度,分
别为1、5、10、100 CFU/mL,之后将样品先用电化学阻抗芯片进行捕获目标细菌,在培养基中
培养1h后用pH=2.2的盐酸-甘氨酸缓冲液破坏抗原抗体之间的酰胺键释放出目标细菌,目
标细菌裂解释放出核酸进行LAMP扩增,反应的浊度用光纤传感器进行定量分析。检测结果
如表1和图3所示。

结果表明,用此方法的检测结果测得的肠出血性大肠杆菌O157:H7的加标回收率
在101.0~108.9%之间,回收率良好,且与平板计数法检测的结果相一致,所以本发明的检
测方法可以用于?#23548;?#24212;用。

表1 果汁中E. coli O157:H7的加标回收率


实施例5:

本实施例为本发明的检测平台对?#23548;?#26679;品牛奶中肠出血性大肠杆菌O157:H7的检测结
果。检测?#34903;?#22914;下:

将从超市中买来的牛奶中人为地加入肠出血性大肠杆菌O157:H7形成不同的浓度,分
别为1、5、10、100 CFU/mL,之后将样品先用电化学阻抗芯片进行捕获目标细菌,在培养基中
培养1h后用pH=2.2的盐酸-甘氨酸缓冲液破坏抗原抗体之间的酰胺键释放出目标细菌,目
标细菌裂解释放出核酸进行LAMP扩增,反应的浊度用光纤传感器进行定量分析。检测结果
如表2和图4所示。

结果表明,用此方法的检测结果测得的肠出血性大肠杆菌O157:H7的加标回收率
在101.3~121.0%之间,回收率良好,且与平板计数法检测的结果相一致,所以本发明的检
测方法可以用于?#23548;?#24212;用。

表2 牛奶中E. coli O157:H7的加标回收率


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