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HE4A临床免疫检测试剂盒及其制备方法.pdf

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HE4A 临床 免疫 检测 试剂盒 及其 制备 方法
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摘要
申请专利号:

CN201610893550.X

申请日:

2016.10.13

公开号:

CN106483293A

公开日:

2017.03.08

当前法律状态:

驳回

有效性:

无权

法?#19978;?#24773;: 发明专利申请公布后的驳回IPC(主分类):G01N 33/577申请公布日:20170308|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/577申请日:20161013|||公开
IPC分类号: G01N33/577; G01N33/543; G01N21/76 主分类号: G01N33/577
申请人: 广州华弘生物科技有限公司
发明人: 陈立国; 邹伟权; 张亚丽; 李庆祥; 母润红; 王涛; 苏焱
地址: 510530 广东省广州市高新技术产业开发区科学?#21069;?#27827;路84号自编二栋101
优?#28909;ǎ?/td>
专利代理机构: ?#26412;?#31934;金石专利代理事务所(普通合伙) 11470 代理人: 刘晔
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法律状态
申请(专利)号:

CN201610893550.X

授权公告号:

||||||

法律状态公告日:

2018.10.09|||2017.04.05|||2017.03.08

法律状态类型:

发明专利申请公布后的驳回|||实质审查的生效|||公开

摘要

本发明属于生物检测领域,具体涉及一种HE4a的定量测定试剂盒,其包含的试剂有包被HE4a抗体的磁分离试剂,吖啶酯标记的HE4a抗体溶液,洗涤液以及化学发光激发溶液。所述化学发光激发溶液分为发光激发溶液A和发光激发溶液B;发光激发溶液A为含有0.1M?HNO3和1mg/mL的过氧化氢溶液;所述发光激发溶液B为含有5mg/mL的十二烷基二甲基苯基溴化鏻和0.25M?NaOH溶液。

权利要求书

1.一种HE4a的定量测定试剂盒,其包含的试剂有包被HE4a抗体的磁分离试剂,吖啶酯
标记的HE4a抗体溶液,洗涤液以及化学发光激发溶液。
2.根据权利要求1所述的定量测定试剂盒,其特征在于,所述包被HE4a抗体的磁分离试
剂为含有0.8mg/ml的?#21058;?#26377;抗HE4a单克隆抗体的磁性微球,0.1mg/ml的丙二醇,0.1mg/ml
的PEG200的100mmol/L的PBS缓冲液,pH值为7.4。
3.根据权利要求1所述的定量测定试剂盒,其特征在于,所述吖啶酯标记的HE4a抗体溶
液是含有0.5mg/ml吖啶酯标记的抗HE4a单克隆抗体和0.5mg/ml?#19994;?#30333;的100mmol/L的PBS
缓冲液,pH值为7.4。
4.根据权利要求1所述的定量测定试剂盒,其特征在于,所述洗涤液由在浓度为50mol/
L、pH为7.4的磷酸盐缓冲液中加入1%的Tween-20配制而成。
5.根据权利要求1所述的定量测定试剂盒,其特征在于,所述化学发光激发溶液分为发
光激发溶液A和发光激发溶液B;发光激发溶液A为含有0.1M HNO3和1mg/mL的过氧化氢溶
液;所述发光激发溶液B为含有5mg/mL的十二烷基二甲基苯基溴化鏻和0.25M NaOH溶液。
6.根据权利要求1所述的定量测定试剂盒,其特征在于,所述吖啶酯选自4-(2-琥珀酰
?#21069;被?#32679;基)苯基-10-甲基吖啶-9-?#20154;?#37231;氟磺酸盐、吖啶酯-NSP-DMAE-NHS或吖啶磺酰胺
NSP-SA-NHS;优选为4-(2-琥珀酰?#21069;被?#32679;基)苯基-10-甲基吖啶-9-?#20154;?#37231;氟磺酸盐。
7.一种权利要求1所述试剂盒的制备方法,具体步骤如下:
1)包被HE4a抗体的磁分离试剂的制备:采用化学交联法将HE4a单克隆抗体和磁性微球
?#21058;?#30913;性微球?#26412;?#22312;1.0μm左右,制备后用PBS缓冲液冲洗三次,然后用70mmol/L的PBS缓
冲液重新悬浮,加入?#24352;?#24230;0.1mg/ml的丙二醇和0.1mg/ml的PEG200,调pH值至7.4即得;
2)吖啶酯标记的HE4a抗体溶液的制备?#21512;騪H值为7.5的100mM的PBS缓冲液中加入0.3g
的HE4a单克隆抗体和0.5mM的4-(2-琥珀酰?#21069;被?#32679;基)苯基-10-甲基吖啶-9-?#20154;?#37231;氟磺
酸盐,避光情况下室温摇晃反应20min,反应完毕后,加入10%?#34507;?#37240;盐溶液,继续避光室温
摇晃反应30min;以G25脱盐柱纯化,收集吖啶酯标记的HE4a抗体,加入到0.5mg/ml?#19994;?#30333;的
100mmol/L的PBS缓冲液,调pH值为7.4。
3)常规方法配置洗涤液和化学底物溶液。

说明书

He4a临床免疫检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明属于生物检测领域,具体涉及He4a临床免疫检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

卵巢癌在女性生殖系统恶性肿瘤中发病率为第三位,仅次于子宫颈癌和子宫体
癌,但死亡率却居首位,因卵巢位于盆腔深部不?#37049;?#21450;,患者出现临床症状就诊时多数已是
晚期,其五年生存率?#33108;?#20110;25-30%之间。而早期卵巢癌患者5年生存率可达90%,因此,提
高卵巢癌的早期诊断水平对于早期治疗、延长患者生存期具有重要意义。

血清肿瘤标志物检测简便且创伤小,因而在肿瘤筛查、诊断、治疗等方面广?#27827;?br />用。目前CA125是临床上最常用的肿瘤标记物,但由于CA125在生理期和一些盆腔良性病变
中也有升高,限制了它的应用。因此,需要一种更加灵敏和特异的肿瘤标记物来提高卵巢癌
的早期诊断水平。

人附睾蛋白4(HE4/HE4a)基因最初是在人附睾远端上皮细胞中发现的,并认为HE4
是WFDC2基因的编码产物,其为弱酸性小分子分泌蛋白,是乳酸蛋白(WAP)结构域?#26131;?#20013;的
一员。WAP结构域是由近50个?#34987;?#37240;组成的保守序列和由8个半胱氨酸为特点的4个二硫键
核心区组成,其编码产物为具有各种不同功能的小分子分泌性蛋白,分子量为11KDa,远小
于CA125,这可能是在卵巢癌早期HE4比CA125更容易分泌进入外周血的主要原因。HE4在正
常卵巢组织及良性肿瘤中含量极低,但在卵巢癌中含量较高,因此,血清HE4含量的测定将
有助于卵巢癌的早期诊断及治疗效果的监测,联合CA125可提高卵巢癌诊断的敏感度和特
异性。

传统的化学发光免疫分析大多以微孔板作为固相载体连接抗原或抗体,吖啶酯快
速集中的发光特性使免疫分析过程更?#36164;?#29616;自动化,便对固相载体有进一步要求。磁性微
粒作为更加高效的抗原、抗体免疫反应固相载体,是一种在外磁场存在的条件下具有响应
性的磁性金属或金属氧化物,大多以氧化铁为核心,经过分?#26377;?#39280;可以在其表面固定大量
生物分子。此外磁性微粒的超顺磁性使其在外加磁场存在的情况下能够迅速聚集,而去掉
外磁场后又能够重新悬浮分散于溶液中,极大缩短免疫检测操作过程中的清洗时间。

但是采用吖啶酯进行化学发光免疫分析时,存在采用HNO3/H2O2系统激发时发光值
小,灵敏度低?#28909;?#28857;,虽然本领域中会采用在NaOH溶液二次激发时添加Triton-100来增加
发光强度,但是在实际应用中效果较差,仍然无法解决吖啶酯发光强度弱的缺点。并且抗体
包被的磁性微球在长期保存时容易发生聚集,从而影响试剂盒长期保存的稳定性。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种HE4a的定量测定试剂盒,其包含的试剂有包被HE4a
抗体的磁分离试剂,吖啶酯标记的HE4a抗体溶液,洗涤液以及化学发光激发溶液。.

所述包被HE4a抗体的磁分离试剂为含有0.8mg/ml的?#21058;?#26377;抗HE4a单克隆抗体的
磁性微球,0.1mg/ml的丙二醇,0.1mg/ml的PEG200的100mmol/L的PBS缓冲液,pH值为7.4。

所述吖啶酯标记的HE4a抗体溶液是含有0.5mg/ml吖啶酯标记的抗HE4a单克隆抗
体和0.5mg/ml?#19994;?#30333;的100mmol/L的PBS缓冲液,pH值为7.4。

洗涤液由在浓度为50mol/L、pH为7.4的磷酸盐缓冲液中加入1%的Tween-20配制
而成。

所述化学发光激发溶液分为发光激发溶液A和发光激发溶液B;发光激发溶液A为
含有0.1M HNO3和1mg/mL的过氧化氢溶液;所述发光激发溶液B为含有5mg/mL的十二烷基二
甲基苯基溴化鏻和0.25MNaOH溶液。

在进一步地实施方案中,所述吖啶酯选自4-(2-琥珀酰?#21069;被?#32679;基)苯基-10-甲基
吖啶-9-?#20154;?#37231;氟磺酸盐、吖啶酯-NSP-DMAE-NHS或吖啶磺酰胺NSP-SA-NHS;优选为4-(2-琥
珀酰?#21069;被?#32679;基)苯基-10-甲基吖啶-9-?#20154;?#37231;氟磺酸盐。

本发明的另一个目的是提供所述试剂盒的制备方法,具体步骤如下:

1)包被HE4a抗体的磁分离试剂的制备:采用化学交联法将HE4a单克隆抗体和磁性
微球?#21058;?#30913;性微球?#26412;?#22312;1.0μm左右,制备后用PBS缓冲液冲洗三次,然后用70mmol/L的
PBS缓冲液重新悬浮,加入?#24352;?#24230;0.1mg/ml的丙二醇和0.1mg/ml的PEG200,调pH值至7.4即
得;

2)吖啶酯标记的HE4a抗体溶液的制备?#21512;騪H值为7.5的100mM的PBS缓冲液中加入
0.3g的HE4a单克隆抗体和0.5mM的4-(2-琥珀酰?#21069;被?#32679;基)苯基-10-甲基吖啶-9-?#20154;?#37231;
氟磺酸盐,避光情况下室温摇晃反应20min,反应完毕后,加入10%?#34507;?#37240;盐溶液,继续避光
室温摇晃反应30min;以G25脱盐柱纯化,收集吖啶酯标记的HE4a抗体,加入到0.5mg/ml?#19994;?br />白的100mmol/L的PBS缓冲液,调pH值为7.4。

3)常规方法配置洗涤液和化学底物溶液。

本发明通过调节磁分离试剂的组分含量,极大地提高了磁分离试剂的稳定性。另
外针对吖啶酯发光强度低的缺点,本发明通过大量筛选获得了一种可以极大提高其发光强
度的化学激发溶液,本发明意外发现在NaOH溶液中添加了表面活性剂十二烷基二甲基苯基
溴化鏻后,检测试剂盒的发光强度得到了极大的改善。

具体实施方式

下面将进一步的来举例说明本发明。需要指出的是,以?#28388;?#26126;仅仅是对本发明要
求保护的技术方案的举例说明,并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所
附权利要求书记载的内容为准。

实施例1试剂盒制备

1)包被HE4a抗体的磁分离试剂的制备:采用常规化学交联法将HE4a单克隆抗体和
磁性微球?#21058;?#30913;性微球?#26412;?#22312;1.0μm左右,制备后用PBS缓冲液冲洗三次,然后用70mmol/L
的PBS缓冲液重新悬浮,加入?#24352;?#24230;0.1mg/ml的丙二醇和0.1mg/ml的PEG200,调pH值至7.4
即得;

2)吖啶酯标记的HE4a抗体溶液的制备?#21512;騪H值为7.5的100mM的1LPBS缓冲液中加
入0.3g的HE4a单克隆抗体和0.5mM的4-(2-琥珀酰?#21069;被?#32679;基)苯基-10-甲基吖啶-9-?#20154;?br />酯氟磺酸盐,避光情况下室温摇晃反应20min,反应完毕后,加入10%?#34507;?#37240;盐溶液100μl,
继续避光室温摇晃反应30min;以G25脱盐柱纯化,收集吖啶酯标记的HE4a抗体,加入到
0.5mg/ml?#19994;?#30333;的100mmol/L的PBS缓冲液,调pH值为7.4。

3)常规方法配置洗涤液和化学底物溶液。

制备后试剂盒组成如下:

包被HE4a抗体的磁分离试剂为含有0.8mg/ml的?#21058;?#26377;抗HE4a单克隆抗体的磁性
微球,0.1mg/ml的丙二醇,0.1mg/ml的PEG200的100mmol/L的PBS缓冲液,pH值为7.4。

吖啶酯标记的HE4a抗体溶液是含有0.5mg/ml4-(2-琥珀酰?#21069;被?#32679;基)苯基-10-
甲基吖啶-9-?#20154;?#37231;氟磺酸盐标记的抗HE4a单克隆抗体和0.5mg/ml?#19994;?#30333;的100mmol/L的
PBS缓冲液,pH值为7.4。

洗涤液由在浓度为50mol/L、pH为7.4的磷酸盐缓冲液中加入1%的Tween-20配制
而成。

所述化学发光激发溶液分为发光激发溶液A和发光激发溶液B;发光激发溶液A为
含有0.1M HNO3和1mg/mL的过氧化氢溶液;所述发光激发溶液B为含有5mg/mL的十二烷基二
甲基苯基溴化鏻和0.25MNaOH溶液。

实施例2试剂盒检测方法

a.向微孔板分别加入血清样本和HE4a标准品,每孔30μl;

b.依次向每孔加入吖啶酯标记的HE4a抗体溶液和包被HE4a抗体的磁分离试剂各
50μl,振荡30s后,置37℃水浴30?#31181;印?br />

c.采用磁分离器,沉淀2?#31181;印?#32531;慢的倒转分离器倒出上清液,把倒转的微孔板连
同分离器一起放在滤纸上,用力拍击分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴。

d.加200μl洗涤液至每孔中,振荡混匀30s,磁分离去洗涤液,重复三次。

e.加发光激发溶液A、B每孔各50μl,充分混匀,立刻加入化学发光仪中检测信号
值。

实施例3包被HE4a抗体的磁分离试剂的稳定性考察

采用不同的溶液组成的磁分离试剂,在37℃下以60转/?#31181;右?#21160;放置一个月,采用
实施例2的方法测定HE4a标准品(浓度5ng/ml),其他检测试剂同实施例1,计算不同放置时
间测定的化学信号?#28068;?天时测定的化学信号值的百分比。各组磁分离试剂组成如下:

组1?#21644;?#23454;施例1

组2:0.8mg/ml的?#21058;?#26377;抗HE4a单克隆抗体的磁性微球,0.1mg/ml的丙二醇,
0.3mg/ml的PEG200的100mmol/L的PBS缓冲液,pH值为7.4

组3:0.8mg/ml的?#21058;?#26377;抗HE4a单克隆抗体的磁性微球,0.1mg/ml的明胶,0.3mg/
ml的PEG200的100mmol/L的PBS缓冲液,pH值为7.4

组4:0.8mg/ml的?#21058;?#26377;抗HE4a单克隆抗体的磁性微球,0.1mg/ml的丙二醇的
100mmol/L的PBS缓冲液,pH值为7.4

具体结果如下:

N=5
组1
组2
组3
组4
5天
99.5%
92.3%
91.2%
88.9%
15天
98.7%
85.2%
81.4%
77.1%
30天
97.6%
75.4%
70.1%
62.3%

实施例4性能考察

采用实施例1制备的He4a检测试剂盒进行下列测定:

1)分别取He4a标准品浓度依次为0.3ng/ml、0.6ng/ml、1.25ng/ml、2.5ng/ml、5ng/
ml、10ng/ml、15ng/ml、25ng/ml;按照实施例2的方法进行测定,以化学发光值(RLU)为Y轴,
以标准品浓度为x轴,绘制标?#35760;?#32447;;结果表明:本发明实施例1试剂盒线性良好,线性方程
为y=65242X+4195;线性系数R>0.999

2)对20次零标准品的测定,取其2倍的平均偏差,其在标?#35760;?#32447;上所对应的浓度即
为分析灵敏度,结果表明实施例1试剂盒灵敏度为0.021ng/ml

实施例5化学发光激发溶?#30418;?#33021;考察

分别配置不同组分的发光激发溶液B,其他检测试剂同实施例1,并采用实施例2的
方法进行检测,检测样品为0.3ng/ml的He4a标准品,测定各组的化学发光值,具体结果如
下:


实施例1
对比例1
对比例2
RLU
23892
10984
8143

对比例1:发光激发溶液B为5mg/mL的Triton X-100和0.25M NaOH溶液,其他试剂
组分同实施例1

对比例2:发光激发溶液B为5mg/mL的吐温20和0.25M NaOH溶液,其他试剂组分同
实施例1

本发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案,其中一个或更多个技
术方案中所记载的技术特征可以与?#25105;?#30340;一个或多个技术方案相组合,这些经组合而得到
的技术方案也在本申请保护范围内,就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开
内容中具体记载一样。

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