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一种利用激光诱导肌红蛋白还原的方法.pdf

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一种 利用 激光 诱导 肌红蛋白 还原 方法
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摘要
申请专利号:

CN201610835073.1

申请日:

2016.09.21

公开号:

CN106483086A

公开日:

2017.03.08

当前法律状态:

实审

有效性:

审中

法?#19978;?#24773;: 实质审查的生效IPC(主分类):G01N 21/33申请日:20160921|||公开
IPC分类号: G01N21/33; G01N33/72 主分类号: G01N21/33
申请人: 大连大学
发明人: 曹洪玉; 史飞; 高凌星; 郑学仿; 唐乾
地址: 116622 辽宁省大连市开发区学府大街10号
优?#28909;ǎ?/td>
专利代理机构: 大连八方知识产权代理有限公司 21226 代理人: 朱秀芬
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法律状态
申请(专利)号:

CN201610835073.1

授权公告号:

|||

法律状态公告日:

2017.04.05|||2017.03.08

法律状态类型:

实质审查的生效|||公开

摘要

本发明属于生理学领域,具体涉及到生命体內肌红蛋白的还原过程,模拟体液环境下肌红蛋白与氧气的结合与分离,以及蛋白活性中心铁卟啉的结构的变化和电子转移的过程。本发明采用激光闪光光解、紫外?可见、圆二色等多种光谱的方法研究肌红蛋白活性中心位点铁卟啉铁的价态和配位状态的变化。本发明的有益效果:本发明利用激光闪光光解技术研究氨基酸对肌红蛋白瞬态吸收以及其动力学过程的影响,发现游离氨基酸可以发挥与蛋白质中氨基酸不同的作用,对光激发肌红蛋白弛豫过程影响较大。这具有重要的生理学和医学意义,为光动力学治疗肌肉和血液疾病提供了新的可能,并?#19968;?#21487;能为肉类产品的保鲜技术的发?#22266;?#20379;新的思路。

权利要求书

1.一种利用激光诱导肌红蛋白还原的方法,其特征在于,包括以下?#34903;瑁?br />一、不同形态的肌红蛋白的制备与光谱数据的测定,包括的?#34903;瑁?br />(1)配制0.2mol/L的PH=7.4的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液作为储备液,并于4℃的冰箱中
避光保存,待用时稀释到0.05mol/L;
(2)用配好的0.05mol/L的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液配制10-4mol/L的pH=7.4的高铁肌
红蛋白作为储备液,并于4℃的冰箱中避光保存,待用时再稀释到10-5mol/L;
(3)用配好的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液将高铁肌红蛋白稀释成浓度为10-5mol/L的高铁
肌红蛋白溶液,取2ml高铁肌红蛋白溶液于比色皿中,测其紫外-可见光谱,再向其中加入10
μl、浓度为0.1mol/L的K3Fe(CN)6,直至达到高铁肌红蛋白溶液:K3Fe(CN)6的摩尔比为1:
100,待其完全反应后,再测定其紫外-可见光谱;
(4)亚铁肌红蛋白制备是利用将2ml浓度为10-5mol/L的高铁肌红蛋白溶液进行还原,高
铁肌红蛋白溶液中加入8μl、浓度为0.1mol·L-1的连二亚硫酸钠(Na2S2O4)溶液,直至达到高
铁肌红蛋白溶液:Na2S2O4的摩尔比达到1:40,将高铁肌红蛋白还原后,透析除去连二亚硫酸
钠制得;
(5)氧合肌红蛋白(MbO2)制备是利用将2ml浓度为10-5mol/L的高铁肌红蛋白溶液进行
还原,高铁肌红蛋白溶液中加入8μl、浓度为0.1mol·L-1的连二亚硫酸钠(Na2S2O4)溶液,直
至达到高铁肌红蛋白溶液:Na2S2O4的摩尔比达到1:40,将高铁肌红蛋白还原后,通入过量的
高纯氧气并透析除去连二亚硫酸钠制得;
(6)高铁肌红蛋白、亚铁肌红蛋白、氧合肌红蛋白的紫外-可见光谱的测定,测定条件为
狭缝宽度为2nm,扫描波长范围220~700nm,扫描速率200nm·min-1,响应时间中等,再向高
铁肌红蛋白、亚铁肌红蛋白、氧合肌红蛋白中分别加入0.01mol/L的游离色氨酸Trp,达到摩
尔比为高铁肌红蛋白:Trp=1:1,分别测定高铁肌红蛋白、亚铁肌红蛋白和氧合肌红蛋白的
紫外-可见光谱;
(7)高铁肌红蛋白、亚铁肌红蛋白、氧合肌红蛋白的圆二色光谱的测定,测定条件为狭
缝宽度1nm,扫描波长范围为190~250nm,扫描速率为50nm·min-1,响应时间为2s,再向高铁
肌红蛋白、亚铁肌红蛋白、氧合肌红蛋白中加入0.01mol/L的游离色氨酸,达到摩尔比为高
铁肌红蛋白:Trp=1:1,分别测定高铁肌红蛋白、亚铁肌红蛋白和氧合肌红蛋白的圆二色光
谱;
二、激光诱导不同形态的肌红蛋白,包括的?#34903;瑁?br />(1)激光还原高铁肌红蛋白、亚铁肌红蛋白、氧合肌红蛋白:在激光照射肌红蛋白溶液
前,在室温20℃下,先通氮气以除去溶液中的溶氧,在室温条件下,激光照射高铁肌红蛋白、
亚铁肌红蛋白、氧合肌红蛋白,所用的激发光(266nm)光源是Nd:YAG调Q激光器,探测光光源
是450W氙灯,光谱采集时间范围为1000ns,波长范围为250-800nm,通过L900软件将动力学
吸收光谱转化为瞬态吸收光谱和动力学衰减曲线;
(2)加入游离色氨酸后,激光还原向高铁肌红蛋白、亚铁肌红蛋白、氧合肌红蛋白:在高
铁肌红蛋白、亚铁肌红蛋白、氧合肌红蛋白中加入0.01mol/L的游离色氨酸,达到摩尔比为
高铁肌红蛋白:游离色氨酸=1:1,激光照射肌红蛋白溶液前,在室温20℃下,激光照射高铁
肌红蛋白、亚铁肌红蛋白、氧合肌红蛋白,先通氮气以除去溶液中的溶氧,在室温条件下,所
用的激发光(266nm)光源是Nd:YAG调Q激光器,探测光光源是450W氙灯,光谱采集时间范围
为1000ns,波长范围为250-800nm,并通过L900软件将动力学吸收光谱转化为瞬态吸收光谱
和动力学衰减曲线。

说明书

一种利用激光诱导肌红蛋白还原的方法

技术领域

本发明属于生理学领域,具体涉及到生命体内肌红蛋白的还原过程,模拟体液环
境下肌红蛋白与氧气的结合与分离,以及蛋白活性中心铁卟啉的结构的变化和电子转移的
过程。

技术背景

以血红素为辅基的蛋白质称为血红素蛋白(hemoproteins),血红素蛋白可以催化
一系列反应,从电子转移、小分子运输、传感,到氧活化反应。血红素辅基构?#38378;?#36825;种蛋白的
活性中心。血红素类蛋白在生物体内具有很多重要的功能,如存储和运输O2、电子转移、生
物催化和小分子生物传感器(O2、NO和CO)等。由于肌红蛋白结构简单并且具有重要的生物
活性,因此肌红蛋白(Myoglobin,Mb)成为研究蛋白动力学、蛋白结构变化以及蛋白与其他
分子相互作用的模型蛋白。

肌红蛋白(Mb)是由153个氨基酸环绕中央的血红素组成的单链蛋白质,由一条多
肽链和一个血红素辅基构成,在体内与O2分子结合起着储存和促进氧气在生物体细胞中扩
散的作用;它还能与CO和NO等小分子配体可逆结合,从而调控其它蛋白的生理功能。Mb活性
中心的血红素Fe(Fe2+或Fe3+状态)有6个配?#36824;?#36947;,其中4个与卟啉环的N原子相连,第五配
位与近端His93残基的咪唑氮结合,第六配位空置(DeoxyMb)或与小分子配体结合。血红素
內Fe呈Fe2+状态时可以与小分子配体(如O2、CO等)配位结合,呈Fe3+状态时可以与水分子配
体结合形成MetMb。

色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)与半胱氨酸(Cys)的光学行为研究部
分已报道在光化学与光物理上,色氨酸在近紫外区域有强?#19994;?#21560;收,其次为酪氨酸,但蛋白
质内部的氨基酸残基对近紫外光却无吸收。Hayon等利用激光闪光光解研究表明,光激发色
氨酸形成单重激发态色氨酸并伴随两个无辐射弛豫通道:?#32043;?#24418;成水和电子(e-aq)以及色
氨酸阳离子自由基,Trp·+迅速转化为Trp·与H+(1-2),第二个是?#23548;?#31388;跃形成三重态3Trp.
光激发酪氨酸后,经荧光发射、无辐射衰减或?#23548;?#36479;越到激发三重态(3-4)。另外,在中性pH
时酪氨酸从从三重态吸收第二个光子,通过双光子过程进行光电离反应生成水合电子与阳
离子自由基并迅速去质子化(5-6);在高pH时,形成中性自由基与水和电子(7)。

Trp+hv→Trp·++e-aq (1)

Trp·+→Trp·+H+ (2)

1Trp+hv→1Trp* (3)

1Trp*→3Trp (4)

3Tyr-OH+hv→Tyr-OH·++e-aq (5)

Tyr-OH·+→Tyr-O·+H+ (6)

Tyr-O·-+hv→Tyr-O·+e-aq (7)

自1980年代末以来光激发肌红蛋白的超快反应过程已成为研究对象,血红素的光
循环过程仍是一个极具争议的问题,普遍认为光激发卟啉后有一个卟啉环电子向Fe的d轨
道转移的过程。蛋白血红素辅基的双原子配体在一定程度上能够发生光解,因此,蛋白血红
素Fe与配体结合与解离的动力学过程引起了很多研究学者的兴趣。Nienhaus等利用稳态和
时间分辨技术对Myoglobin-CO的光化学行为进行了研究,表明蛋白质的配体解离后进入蛋
白溶液过程涉及到特定的氨基酸残基,例如,远端组氨酸(His64)的旋转被指认为
Myoglobin-CO光解后产生一瞬态物种的特征行为。Hochstrasser等以405nm激发,检测Q带
(450–630nm)与band-Ⅲ谱带(730–900nm)区域,测量肌红蛋白Mb的瞬态动力学光谱。发现有
两个超快电子弛豫?#34903;瑁?#19968;个小于100fs,另一个几乎为100fs,Mb均可以弛豫到电子基态
(S0)。尽管氨基酸、肌红蛋白与配体结合解离的动力学过程已进行?#30636;?#20998;研究,但氨基酸影
响肌红蛋白的光学性质研?#21487;?#26377;报道。

关于光诱导高铁肌红蛋白(metmyoglobin,metMb)还原及其引起的蛋白结构变化
方面的研究,国内尚未见报道,而国外文献报道大部分集?#24615;?#21033;用外来电子供体或是光敏
剂来进行还原反应。至今光诱导还原反应的详细机理尚不清楚,主要的困惑在于光诱导还
原过程中电子供体的辨别。Bartocci等认为血红素轴向配体是电子供体,其提供的电子发
生转移从而还原?#25628;?#32418;素铁,而其他研究者则认为氨基酸残基,特别是色氨酸残基是光诱
导还原反应的电子供体。总之,血红素蛋白光还原的机制及其波长的?#35272;?#24615;仍然没有得到
很好的诠释。

光动力学疗法(Photodynamic Therapy,PDT)是近些年来发展起来的一种新型的
物理化学治疗技术,其基本原理是光敏剂在特定波长光源的激发下进?#24515;?#37327;的跃迁,随后
将能量转移给生物体的氧,后者接受能量形成单线氧、自由基或自由基离子等,它们作用于
靶细胞,引起病变细胞的凋亡,达到治疗疾病的目的。研究出光诱导肌红蛋白的还原过程,
涉及到蛋白活性中心铁卟啉的结构的变化、电子转移?#30333;?#30001;基中间态变化等过程,这与光
动力学疗法有相似之处,这可能会为以后的光动力学治疗肌肉和血液疾病提供了新的可
能。

在我们的生活中,食品的保鲜尤其是肉类的防腐保?#39318;?#21476;以来便是人们研究的重
要课题。随着现代人生活方式的转变、生活节奏的加快以及健康饮食观念的加重,使得传统
的肉类保鲜已无法满足人们的需求,因?#21496;?#38656;要有新的技术的开发。肉类的腐败主要有三
种因素引起:(1)微生物污?#23613;?#29983;长繁殖;(2)脂肪氧化;(3)肌红蛋白变色。肌红蛋白的变色
是由于肌红蛋白氧化所致的,而光诱导肌红蛋白的还原过程可能为肉类保鲜提供新的思
路。

发明内容

本发明的目的是为了推测出光诱导血红素蛋白还原反应的机理、光诱导还原过程
中电子供体及电子转移的过程。

为实现以上的技术目的,本发明将采取以下的技术方案:

一种利用激光诱导肌红蛋白还原的方法,包括以下?#34903;瑁?br />

一、不同形态的肌红蛋白的制备与光谱数据的测定,包括的?#34903;瑁?br />

(1)配制一定量的高浓度(0.2mol/L)的PH=7.4的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液作为
储备液,并于4℃的冰箱中避光保存,待用时稀释到0.05mol/L;

(2)用配好的0.05mol/L的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液配制高浓度(10-4mol/L)的pH
=7.4的高铁肌红蛋白(MetMb)作为储备液,并于4℃的冰箱中避光保存,待用时再稀释到
10-5mol/L;

(3)用配好的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液将高铁肌红蛋白稀释成浓度为10-5mol/L的
高铁肌红蛋白溶液,取2ml高铁肌红蛋白溶液于比色皿中,测其紫外-可见光谱,再向其中加
入10μl、浓度为0.1mol/L的K3Fe(CN)6,直至达到MetMb:K3Fe(CN)6的摩尔比为1:100,待其完
全反应后,再测定其紫外-可见光谱;

(4)亚铁肌红蛋白(DeoxyMb)制备是利用将2ml的高铁肌红蛋白(浓度为10-5mol/L)
进行还原,高铁肌红蛋白中加入8μl、浓度为0.1mol·L-1的连二亚硫酸钠(Na2S2O4)溶液,直
至达到MetMb:Na2S2O4的摩尔比达到1:40,将高铁肌红蛋白还原后,透析除去连二亚硫酸钠
制得;

(5)氧合肌红蛋白(MbO2)制备是利用将2ml的高铁肌红蛋白(浓度为10-5mol/L)进
行还原,高铁肌红蛋白中加入8μl、浓度为0.1mol·L-1的连二亚硫酸钠(Na2S2O4)溶液,直至
达到MetMb:Na2S2O4的摩尔比达到1:40,将高铁肌红蛋白还原后,通入过量的高纯氧气并透
析除去连二亚硫酸钠制得;

(6)高铁肌红蛋白、亚铁肌红蛋白、氧合肌红蛋白的紫外-可见光谱的测定(测定条
件为狭缝宽度为2nm,扫描波长范围220~700nm,扫描速率200nm·min-1,响应时间中等),再
向高铁肌红蛋白、亚铁肌红蛋白、氧合肌红蛋白中分别加入游离色氨酸(Trp)(0.01mol/L)
(达到摩尔比为MetMb:Trp=1:1),分别测定高铁肌红蛋白、亚铁肌红蛋白和氧合肌红蛋白
的紫外-可见光谱;

(7)高铁肌红蛋白、亚铁肌红蛋白、氧合肌红蛋白的圆二色光谱的测定(测定条件
为狭缝宽度1nm,扫描波长范围为190~250nm,扫描速率为50nm·min-1,响应时间为2s),再
向高铁肌红蛋白、亚铁肌红蛋白、氧合肌红蛋白中加入游离色氨酸(0.01mol/L)(达到摩尔
比为MetMb:Trp=1:1),分别测定高铁肌红蛋白、亚铁肌红蛋白和氧合肌红蛋白的圆二色光
谱。

二、光诱导不同形态的肌红蛋白光谱数据的测定与分析,包括的?#34903;瑁?br />

(1)测定高铁肌红蛋白、亚铁肌红蛋白、氧合肌红蛋白的激光闪光光解动力学吸收
光谱(实验所用的激发光(266nm)光源是Nd:YAG调Q激光器,探测光光源是450W氙灯,光谱采
集时间范围为1000ns,波长范围为250-800nm),激光照射肌红蛋白溶液前,先通氮气以除去
溶液中的溶氧,且实验是在室温(20℃)下进行的,并通过L900软件将动力学吸收光谱转化
为瞬态吸收光谱和动力学衰减曲线;

(2)向高铁肌红蛋白、亚铁肌红蛋白、氧合肌红蛋白中加入游离色氨酸(0.01mol/
L)(摩尔比为MetMb:Trp=1:1),测定其激光闪光光解动力学吸收光谱(所用的激发光
(266nm)光源是Nd:YAG调Q激光器,探测光光源是450W氙灯,光谱采集时间范围为1000ns,波
长范围为250-800nm),激光照射肌红蛋白溶液前,先通氮气以除去溶液中的溶氧,且实验是
在室温(20℃)下进行的,并通过L900软件将动力学吸收光谱转化为瞬态吸收光谱和动力学
衰减曲线;

(3)通氮气除去蛋白溶液中的溶氧后,用激光照射高铁肌红蛋白、亚铁肌红蛋白、
氧合肌红蛋白,测定它们的紫外-可见吸收光谱和圆二色光谱;

(4)通氮气除去蛋白溶液中的溶氧后,用激光照射加入游离色氨酸(0.01mol/L)
(摩尔比为MetMb:Trp=1:1)的高铁肌红蛋白、亚铁肌红蛋白、氧合肌红蛋白,测定它们的紫
外-可见光谱和圆二色光谱;

(5)通过分析紫外-可见吸收光谱,会发现激光能夠诱导高铁肌红蛋白发生还原的
过程,激光诱导后高铁肌红蛋白Soret带和Q带的特征吸收峰都向亚铁肌红蛋白的特征吸收
峰移动,加入的游离氨基酸对还原过程有微弱的促进作用,而氧合肌红蛋白和亚铁肌红蛋
白Soret带和Q带的特征吸收峰的变化,表明激光能夠诱导它们的构型发生变化;

(6)通过分析圆二色光谱,会发现三种形态的肌红蛋白在222nm和208nm处表现出
两个负的特征肩峰谱带,这是典型的α–螺旋结构蛋白质的CD光谱特征,激光照射后两个负
吸收峰的强度减小,但形状和肩峰的位置未发生明显改变,这说明激光可引起蛋白构象及
二级结构的微弱变化;

(7)通过分析激光闪光解瞬态吸收光谱,会发现在266nm激光光解后,高铁肌红蛋
白在265、295、315、405nm区域出现特征吸收峰,氧合肌红蛋白在265、295、320、410nm区域出
现特征吸收峰,亚铁肌红蛋白在275、310、430、~700nm区域出现特征吸收峰,其中265、
295nm处为漂白峰,310、315、320nm处为蛋白质内色氨酸激发态的吸收峰,430nm处为二价铁
血红素的特征吸收峰,410nm为二价铁氧合态的吸收峰,405nm为三价铁血红素的吸收峰;

(8)通过分析激光闪光解瞬态吸收光谱,可以发现游离色氨酸经激光闪光解后,不
同延迟时间内会产生不同的瞬态物种,肌红蛋白经激光闪光解后同样也会产生不同的瞬态
物种,加入色氨酸后,铁卟啉的吸收峰位置并未发生变化,但吸收峰强度明显增大,表明激
发态氨基酸与蛋白质之间进行了能量转移,使得卟啉环吸收峰强度增加。DeoxyMb中色氨酸
激发态吸收峰位置由310nm直接红移至330nm,随着时间的延长,吸收峰强度逐渐下降;而
MetMb与MbO2320nm处色氨酸激发态峰位置未改变,随着时间的延迟,最大波长吸收峰逐渐
红移至350nm且强度?#26723;停?#20135;生多种氨基酸瞬态形式与大约700nm处的水和电子峰,表明激
发态MbO2与MetMb与氨基酸只进行了能量转移,而激发态氨基酸通过自身的激发态弛豫过
程回到基态。

(9)通过分析动力学衰减曲线和动力学曲线多指数拟合参数,可以看出各蛋白质
的衰减趋势并不一致,亚铁肌红蛋白最?#20154;?#20943;至零,其次为高铁肌红蛋白与氧化肌红蛋白,
加入色氨酸后,对亚铁肌红蛋白的时间衰减曲线影响明显,衰减至零的时间延长,而高铁肌
红蛋白与氧化肌红蛋白的时间衰变曲线变化不大。

通过处理和分析各个?#34903;?#20809;谱数据可以得出结论:激光能够诱导高铁肌红蛋白发
生还原过程,而添加色氨酸对高铁肌红蛋白的还原过程影响不太明显。

本发明的有益效果:本发明利用激光闪光光解技术研究氨基酸对肌红蛋白瞬态吸
收以及其动力学过程的影响,发现游离氨基酸可以发挥与蛋白质中氨基酸不同的作用,对
光激发肌红蛋白弛豫过程影响较大。这具有重要的生理学和医学意义,为光动力学治疗肌
肉和血液疾病提供了新的可能,并?#19968;?#21487;能为肉类产品的保鲜技术的发?#22266;?#20379;新的思路。

附图说明

图1为激光诱导、未光照和激光诱导加入游离色氨酸的高铁肌红蛋白的紫外-可见
吸收光谱;

图2为激光诱导、未光照和激光诱导加入游离色氨酸的氧合肌红蛋白的紫外-可见
吸收光谱;

图3为激光诱导、未光照和激光诱导加入游离色氨酸的亚铁肌红蛋白的紫外-可见
吸收光谱;

图4为激光诱导和未光照的高铁肌红蛋白的圆二色光谱;

图5为激光诱导和未光照的氧合肌红蛋白的圆二色光谱;

图6为激光诱导和未光照的亚铁肌红蛋白的圆二色光谱;

图7为高铁肌红蛋白的激光闪光光解瞬态吸收光谱;

图8为氧合肌红蛋白的激光闪光光解瞬态吸收光谱;

图9为亚铁肌红蛋白的激光闪光光解瞬态吸收光谱;

图10为加入游离色氨酸后高铁肌红蛋白的激光闪光光解瞬态吸收光谱;

图11为加入游离色氨酸后氧合肌红蛋白的激光闪光光解瞬态吸收光谱;

图12为加入游离色氨酸后亚铁肌红蛋白的激光闪光光解瞬态吸收光谱;

图13为高铁肌红蛋白、氧合肌红蛋白和亚铁肌红蛋白的激光闪光光解动力学衰减
曲线;

图14为加入游离色氨酸后高铁肌红蛋白、氧合肌红蛋白和亚铁肌红蛋白的激光闪
光光解动力学衰减曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式,进一步阐明本发明。

一种利用激光诱导肌红蛋白还原的方法,包括以下?#34903;瑁?br />

一、不同形态的肌红蛋白的制备与光谱数据的测定,包括的?#34903;瑁?br />

(1)配制一定量的高浓度(0.2mol/L)的PH=7.4的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液作为
储备液,并于4℃的冰箱中避光保存,待用时稀释到0.05mol/L;

(2)用配好的0.05mol/L的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液配制高浓度(10-4mol/L)的pH
=7.4的高铁肌红蛋白(MetMb)作为储备液,并于4℃的冰箱中避光保存,待用时再稀释到
10-5mol/L(所用的高铁肌红蛋白是购自美国的Sigma公司);

(3)用配好的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液将高铁肌红蛋白稀释成浓度为10-5mol/L的
高铁肌红蛋白溶液,取2ml高铁肌红蛋白溶液于比色皿中,测其紫外-可见光谱,再向其中加
入10μl、浓度为0.1mol/L的K3Fe(CN)6,直至达到MetMb:K3Fe(CN)6的摩尔比为1:100,待其完
全反应后,再测定其紫外-可见光谱;

(4)亚铁肌红蛋白(DeoxyMb)制备是利用将2ml的高铁肌红蛋白(浓度为10-5mol/L)
进行还原,高铁肌红蛋白中加入8μl、浓度为0.1mol·L-1的连二亚硫酸钠(Na2S2O4)溶液,直
至达到MetMb:Na2S2O4的摩尔比为1:40,将高铁肌红蛋白还原后,透析除去连二亚硫酸钠制
得;

(5)氧合肌红蛋白(MbO2)制备是利用将2ml的高铁肌红蛋白(浓度为10-5mol/L)进
行还原,高铁肌红蛋白中加入8μl、浓度为0.1mol·L-1的连二亚硫酸钠(Na2S2O4)溶液,直至
达到MetMb:Na2S2O4的摩尔比为1:40,将高铁肌红蛋白还原后,通入过量的高纯氧气并透析
除去连二亚硫酸钠制得;

(6)高铁肌红蛋白、亚铁肌红蛋白、氧合肌红蛋白的紫外-可见光谱的测定(测定条
件为狭缝宽度为2nm,扫描波长范围220~700nm,扫描速率200nm·min-1,响应时间中等),再
向高铁肌红蛋白、亚铁肌红蛋白、氧合肌红蛋白中分别加入游离色氨酸(Trp)(0.01mol/L)
(达到摩尔比为MetMb:Trp=1:1),分别测定高铁肌红蛋白、亚铁肌红蛋白和氧合肌红蛋白
的紫外-可见光谱;

(7)高铁肌红蛋白、亚铁肌红蛋白、氧合肌红蛋白的圆二色光谱的测定(测定条件
为狭缝宽度1nm,扫描波长范围为190~250nm,扫描速率为50nm·min-1,响应时间为2s),再
向高铁肌红蛋白、亚铁肌红蛋白、氧合肌红蛋白中加入游离色氨酸(0.01mol/L)(达到摩尔
比为MetMb:Trp=1:1),分别测定高铁肌红蛋白、亚铁肌红蛋白和氧合肌红蛋白的圆二色光
谱。

二、光诱导不同形态的肌红蛋白光谱数据的测定与分析,包括的?#34903;瑁?br />

(1)测定高铁肌红蛋白、亚铁肌红蛋白、氧合肌红蛋白的激光闪光光解动力学吸收
光谱(实验所用的激发光(266nm)光源是Nd:YAG调Q激光器,探测光光源是450W氙灯,光谱采
集时间范围为1000ns,波长范围为250-800nm),激光照射肌红蛋白溶液前,先通氮气以除去
溶液中的溶氧,且实验是在室温(20℃)下进行的,并通过L900软件将动力学吸收光谱转化
为瞬态吸收光谱和动力学衰减曲线;

(2)向高铁肌红蛋白、亚铁肌红蛋白、氧合肌红蛋白中加入游离色氨酸(0.01mol/
L)(摩尔比为MetMb:Trp=1:1),测定其激光闪光光解动力学吸收光谱(所用的激发光
(266nm)光源是Nd:YAG调Q激光器,探测光光源是450W氙灯,光谱采集时间范围为1000ns,波
长范围为250-800nm),激光照射肌红蛋白溶液前,先通氮气以除去溶液中的溶氧,且实验是
在室温(20℃)下进行的,并通过L900软件将动力学吸收光谱转化为瞬态吸收光谱和动力学
衰减曲线;

(3)通氮气除去蛋白溶液中的溶氧后,用激光照射高铁肌红蛋白、亚铁肌红蛋白、
氧合肌红蛋白,测定它们的紫外-可见吸收光谱和圆二色光谱;

(4)通氮气除去蛋白溶液中的溶氧后,用激光照射加入游离色氨酸(0.01mol/L)
(摩尔比为MetMb:Trp=1:1)的高铁肌红蛋白、亚铁肌红蛋白、氧合肌红蛋白,测定它们的紫
外-可见光谱和圆二色光谱,同时,根据所有动力学衰减曲线绘制表1不同形态的肌红蛋白
动力学衰减曲线多指数拟合参数;

表1为不同形态的肌红蛋白动力学衰减曲线多指数拟合参数

Tab.1 Multi exponential fitting parameters of the knetic curve of Mb


(5)通过分析紫外-可见吸收光谱(如图1-3),我们发现激光能夠诱导高铁肌红蛋
白发生还原过程,如图1所示的激光诱导后高铁肌红蛋白Soret带和Q带的特征吸收峰都向
亚铁肌红蛋白的特征吸收峰移动,加入的游离氨基酸对还原过程有微弱的促进作用,而氧
合肌红蛋白和亚铁肌红蛋白Soret带和Q带的特征吸收峰的变化(如图2-3),表明激光能夠
诱导它们的构型发生变化;

(6)通过分析圆二色光谱(如图4-6),我们发现三种形态的肌红蛋白在222nm和
208nm处表现出两个负的特征肩峰谱带,这是典型的α–螺旋结构蛋白质的CD光谱特征,激光
照射后两个负吸收峰的强度减小,但形状和肩峰的位置未发生明显改变,这说明激光可引
起蛋白构象及二级结构的微弱变化;

(7)通过分析激光闪光解瞬态吸收光谱(如图7-9),我们发现在266nm激光光解后,
高铁肌红蛋白在265、295、315、405nm区域出现特征吸收峰,氧合肌红蛋白在265、295、320、
410nm区域出现特征吸收峰,亚铁肌红蛋白在275、310、430、~700nm区域出现特征吸收峰,
其中265、295nm处为漂白峰,310、315、320nm处为蛋白质内色氨酸激发态的吸收峰,430nm处
为二价铁血红素的特征吸收峰,410nm为二价铁氧合态的吸收峰,405nm为三价铁血红素的
吸收峰;

(8)通过分析激光闪光解瞬态吸收光谱(如图10-12),我们发现游离色氨酸经激光
闪光解后,不同延迟时间内会产生不同的瞬态物种,肌红蛋白经激光闪光解后同样也会产
生不同的瞬态物种,加入色氨酸后,铁卟啉的吸收峰位置并未发生变化,但吸收峰强度明显
增大,表明激发态氨基酸与蛋白质之间进行了能量转移,使得卟啉环吸收峰强度增加。
DeoxyMb中色氨酸激发态吸收峰位置由310nm直接红移至330nm,随着时间的延长,吸收峰强
度逐渐下降,可能是因为氨基酸经激发后不仅与DeoxyMb进行了能量传递,还进行了氧化还
原反应;而MetMb与MbO2320nm处色氨酸激发态峰位置未改变,随着时间的延迟,最大波长吸
收峰逐渐红移至350nm且强度?#26723;停?#20135;生多种氨基酸瞬态形式与大约700nm处的水和电子
峰,表明激发态MbO2与MetMb与氨基酸只进行了能量转移,而激发态氨基酸通过自身的激发
态弛豫过程回到基态。

(9)通过分析动力学衰减曲线(如图13-14)和动力学曲线多指数拟合参数(表1),
我们可以看出各蛋白质的衰减趋势并不一致,亚铁肌红蛋白最?#20154;?#20943;至零,其次为高铁肌
红蛋白与氧化肌红蛋白,加入色氨酸后,对亚铁肌红蛋白的时间衰减曲线影响明显,衰减至
零的时间延长,而高铁肌红蛋白与氧化肌红蛋白的时间衰变曲线变化不大。

通过处理和分析各个?#34903;?#20809;谱数据可以得出结论:激光能够诱导高铁肌红蛋白发
生还原过程,而添加色氨酸对高铁肌红蛋白的还原过程影响不太明显。

关于本文
本文标题:一种利用激光诱导肌红蛋白还原的方法.pdf
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