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一种用于人成熟骨髓间充质干细胞检测的试剂盒.pdf

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一种 用于 成熟 骨髓 间充质 干细胞 检测 试剂盒
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摘要
申请专利号:

CN201611257340.8

申请日:

2016.12.30

公开号:

CN106483289A

公开日:

2017.03.08

当前法律状态:

实审

有效性:

审中

法?#19978;?#24773;: 实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/569申请日:20161230|||公开
IPC分类号: G01N33/569; C12N15/115(2010.01)I; C12N5/0775(2010.01)I 主分类号: G01N33/569
申请人: 魏乃东
发明人: 魏乃东
地址: 300457 天津市滨海新区经济技术开发区第四大街天大科技园B3座国家干细胞工程技术研究中心
优?#28909;ǎ?/td>
专利代理机构: 代理人:
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法律状态
申请(专利)号:

CN201611257340.8

授权公告号:

|||

法律状态公告日:

2017.04.05|||2017.03.08

法律状态类型:

实质审查的生效|||公开

摘要

本发明公开了一种用于人成熟骨髓间充质干细胞检测的试剂盒,其含有能特异性检测人成熟骨髓间充质干细胞的核酸适体。利用本发明的试剂盒,可以特异性的分离人成熟骨髓间充质干细胞,该试剂盒具有操作简单、方便直接用于人成熟骨髓间充质干细胞的分离,节约时间和成本。

权利要求书

1.一种用于人成熟骨髓间充质干细胞检测的试剂盒,其含有能特异性检测人成熟骨髓
间充质干细胞的核酸适体。
2.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于?#26680;?#36848;适体的一端?#21058;?#26377;磁珠,用于富集分
离得到的人成熟骨髓间充质干细胞。
3.如权利要求1-2任一项所述的试剂盒,其特征在于?#26680;?#36848;核酸适体序列如SEQ ID No:
1-18任一所示。
4.一种检测人成熟骨髓间充质干细胞的方法,其特征在于利用权利要求1所述的试剂
盒。
5.SEQ ID No:1-18任一所示的适体在制备用于人成熟骨髓间充质干细胞检测的试剂
盒中的应用。
6.一种核酸适体,其特征在于?#30418;?#21015;如SEQ ID No:1-18任一所示。

说明书

一种用于人成熟骨髓间充质干细胞检测的试剂盒

技术领域

本申请涉及生物检测领域,具体涉及人成熟骨髓间充质干细胞的检测。

背景技术

干细胞即为起源细胞。干细胞是具有增殖和分化潜能的细胞,具有自我更新复制
的能力(Self-renewing),能够产生高度分化的功能细胞。简单来讲,它是一类具有多向分
化潜能和自我复制能力的原始的未分化细胞,是形成哺乳类动物的各组织器官的原始细
胞。干细胞在形态上具有共性,通常?#35797;?#24418;或椭圆形,细胞体积小,核相对较大,细胞核多为
常染色质,并具有?#32454;?#30340;端粒酶活性。干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞。

干细胞是自我复制还是分化功能细胞,主要由于细胞本身的状态和微环境因素所
决定。包括调节细胞周期的各种周期素(Cyclin)和周期素?#35272;?#28608;酶(Cyclin-Dependent
Kinase)、基因转?#23478;?#23376;、影响细胞不对称分裂的细胞质因子。微环境因素,包括干细胞与周
围细胞,干细胞与外基质以及干细胞与各种可溶性因子的相互作用。人体内的干细胞分两
种类型,一种是全功能干细胞,可直接克隆人体;另一种是多功能干细胞,可直接复制各种
脏器和修复组织。人类寄希望于利用干细胞的分离和体外培养,在体外繁育出组织或器官,
并最终通过组织或器官移植,实现对临床疾病的治疗。

最新的研究表明,组织特异性干细胞同样具有分化成其他细胞或组织的潜能,这
为干细胞的应用开创了更广泛的空间。

间充质干细胞(MSC,mesenchymal stem cells)是干细胞家族的重要成员,来源于
发育早期的中胚层和外胚层,属于多能干细胞,MSC最初在骨髓中发现,因其具有多向分化
潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而?#25214;?#21463;到人们的关注。如
间充质干细胞在体内或体外特定的诱?#32487;?#20214;下,可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、
神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞,连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能,可
作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。

骨髓间充质干细胞是来源于骨髓来源的间充质干细胞,骨髓间充质干细胞具有较
强的自我更新?#20197;?#27542;能力以及向分化潜能。骨髓间充质干细胞由于其来源广?#28023;?#26131;于分离
培养,并且具有较强的分化潜能和可自体移植等优点,越来越受到学者们的青睐,被认为是
不久即将被引入临床治疗的最优干细胞。

但是在现有技术中,鉴定时候筛选得到性能优良的骨髓间充质干细胞一直是一个
难题。现有技术中CN104215773A公开了一种鉴定骨髓间充质干细胞活性的方法,其中首次
发现了GAPDH蛋白在骨髓间充质干细胞中的表达分布水?#25509;?#39592;髓间充质干细胞活性的关
系,所提供的方法可以快速地鉴定出?#32422;?#30149;治疗效果好、增殖能力强的骨髓间充质干细胞,
从而可用于骨髓间充质干细胞的高通?#21487;?#36873;。

但是所述的鉴定方法需要鉴定GAPDH蛋白的水平,所述的鉴定一般需要制备GAPDH
抗体,所述方法还是较为复杂,实际应用中成本很高,仍然不利于推广使用。

发明内容

本发明提供一种用于快速鉴定?#32422;?#30149;治疗效果好、增殖能力强的骨髓间充质干细
胞的试剂盒,以及相应的鉴定用的适配子。

按照CN103421740A中公开的人骨髓间充质干细胞体外培养扩增方法,获得成熟、
活性高的人骨髓间充质干细胞,所述细胞为阳性表达:CD73,CD90,而阴性表达:CD34、CD45。

本发明的目的是提供一种人骨髓间充质干细胞的核酸适配体序列。

本发明中,所述的人骨髓间充质干细胞的核酸适配体(序列1-18)能够特异结合人
骨髓间充质干细胞。

本发明的进一步的目的是提供所述核酸适配体序列的用途。本发明中根据对该序
列应用,可进一步用于制备特异性分离人骨髓间充质干细胞的试剂盒。

从体外合成的随机寡聚DNA文库,5’-TGGACAGACGTAAGACGTAA(N36)
TGAGATGCCAGTAGTGACGA-3’。中筛选出与人骨髓间充质干细胞特异结合的核酸适配体;将筛
选出的序列用引物F(5’-FAM-TGGACAGACGTAAGACGTAA-3’)和R(5’-biotin-
TCGTCACTACTGGCATCTCA-3’)进行扩增并进行TA克隆入pMD19-T载体(购自上海生工生物公
司),转化DH5a细菌(购自上海生工生物公司);挑去白色菌落进行PCR确定阳性克隆后,抽提
质粒并测序反应,上测序仪测序。

本发明采用核酸适配体的体外筛选(SELEX)技术,以人骨髓间充质干细胞为正筛
靶标,以人脂肪来源间充质干细胞和人肌肉来源的间充质干细胞为反筛靶标,筛选与人骨
髓间充质干细胞特异结合的核酸适配体,制得具有特异结合人骨髓间充质干细胞的序列,
本发明中命名为适配体BMMSC-1~18。序列如下:

本发明的适配子可以用于构建试剂盒,该试剂盒可以用于特异性的分离人成熟的
骨髓间充质干细胞,所述方法比采用GAPDH分离的方法具有分离成本低,时间更加简便等优
点。

本公开的适配子分子可用作将靶标结合或固定至固相载体的捕获试剂。固相载体
可以由具有通常与过滤器、晶片、晶圆芯片、膜和薄膜有关的结构和组成的基底组成。然而,
预期固相载体可由这样的基底组成,其包括但不限于树脂、亲和树脂、磁珠或聚合物珠子或
?#39759;?#29992;于捕获或固定用于诊断、检测或定量研宄的试剂的诊断性检测试剂。

固相载体可以基于所需的用?#26223;?#21547;?#39759;?#26448;料,包括但不限于:玻璃、金属表面,以
及诸如?#26893;摹?#38518;瓷材料或聚合物材料如聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺和聚偏二氟乙烯等的材料,
或以上的组合。

本发明的有益效果?#21644;?#36807;制备特异性的结合人骨髓间充质干细胞的适配体以及相
应的试剂盒可以用于实现特异性分离纯化人骨髓间充质干细胞,所述方法制备简单,成本
低廉,可以用于批量制备所述的试剂盒。

具体实施方式

实施例1:人骨髓间充质干细胞成熟细胞的制备

按照CN103421740A中公开的人骨髓间充质干细胞体外培养扩增方法,获得成熟、
活性高的人骨髓间充质干细胞,所述细胞为阳性表达:CD73,CD90,而阴性表达:CD34、CD45。
按照CN104215773A一种鉴定骨髓间充质干细胞活性的方法?#36816;?#36848;细胞进行鉴定,选择活性
高的细胞作为后续使用。

实施例2核酸适配体筛选

从体外合成的随机寡聚DNA文库,5’-TGGACAGACGTAAGACGTAA(N36)

TGAGATGCCAGTAGTGACGA-3’。

富集所用引物:

F:5’-FAM-TGGACAGACGTAAGACGTAA-3’

R:5’-biotin-TCGTCACTACTGGCATCTCA-3’

将寡聚DNA文库测定OD260后,离心干燥;用300ul结合缓冲液(PBS中含4.5g/L葡萄
糖,5mM MgCl2,2mg/mL BSA,0.2mg/mL酵母tRNA)溶解文库,取250pmol(第一轮10nmol),95
℃5min,迅速置冰上,稍后快速离心。

反筛:将250pmol的文库吸入含有人脂肪来源间充质干细胞和人肌肉来源的间充
质干细胞的?#26412;?cm培养皿中,细胞浓度为2.0×106个/ml。用结合缓冲液补足到1mL;4℃摇
床振荡3h;取上清液。

正筛:将反?#24178;?#28165;液加入到含有实施例1制备的人骨髓间充质干细胞培养皿中,细
胞浓度为2.0×106个/ml,4℃摇床振荡1h;弃上清?#28023;?#29992;洗涤缓冲液(PBS中含4.5g/L葡萄
糖,5mM MgC12)洗涤人骨髓间充质干细胞细胞三遍;用1mL洗涤缓冲液将人骨髓间充质干细
胞转移到EP管中,95℃5min,迅速置冰上。待变冷后,10000rpm离心5min;上清转移到一干净
的EP管中。

富集:配置PCR体系(总体积1000ul):H20 740ul,10XPCR缓冲液100ul,dNTP 80ul,
引物混合物25ul(F:100uM,100uM),DNA模板(正?#24178;?#28165;)50ul,Taq HS酶5ul。

按如下条件在PCR仪上扩增:94℃加热预变性2min后,94℃变性30s,58℃退火20s,
72。。?#30001;?0s,20个循环,72℃?#30001;?min,4℃保温<lh。

纯化:纯化柱用MilliQ水洗一遍,PBS洗两遍,加入150ul GE的
StreptavidinSepharose后PBS洗两遍,加入PCR产物,摇床振荡20min,放出液体,PBS洗两遍
后,加0.5mLNaOH静置2-3min后放出液体,放出液上脱盐柱,待液体从脱盐柱几乎流尽时加
1mL MilliQ水洗脱,同时开始接洗脱液lmL,该洗脱液即为富集了的寡聚DNA文库。将富集了
的寡聚DNA文库进行常规的TA克隆,而后进行菌落PCR与测序。测序结果为SEQ ID NO:1-18
所示。

实施例3适配子结合特性验证

取人骨髓间充质干细胞分别与不同浓度0、25nM、50nM、100nM、150nM、200nM、
250nM、300nM、500nM、800nM、1000nM)的适配子BMMSC-(1~18)孵育20min,洗涤后进行流式
细胞术实验,结果发现,随着适配?#20248;?#24230;的增加,其?#22253;?#32454;胞的结合力就越强,最终结合趋
于饱和。当适配子与细胞结?#19979;?#36798;到50%时,此时所需的适配子的浓度就是其平衡解离常
数Kd,由?#23435;?#20204;可以得到适配子各自与细胞的结合力常数分别如下:





实施例4所述适配子特异性分析

将50nM的FITC标记的适配子BMMSC-1~18分别与成熟的人骨髓间充质干细胞、人
脂肪来源间充质干细胞、人肌肉来源的间充质干细胞、红细胞结合20min,洗涤,4%的多聚
甲醛固定后进行共聚焦显微镜实验,结果发现,对于人骨髓间充质干细胞来说,适配子
BMMSC-1~18均能很好的与其结?#24076;以?#32454;胞膜上可以看到很明显的荧光,而对于人脂肪来
源间充质干细胞、人肌肉来源的间充质干细胞、红细胞来说,适配子BMMSC-1~18均没有明
显地与其结?#24076;?#25152;以在荧光场中基本看不?#25509;?#20809;。

通过上述实验得出以下结论:本发明的适配?#26377;?#21015;均能很好的与靶细胞结?#24076;?#32780;
且靶向性也很好。

实施例5分析细胞实验

将本发明的适配子分别?#21058;?#30913;珠,将培养的成熟人骨髓间充质干细胞到无菌离心
管中,取1mL细胞悬浮液经流式细胞仪计数其中的人骨髓间充质干细胞个数,其数量为4.5X
105。分别将?#21058;?#26377;磁珠的适配子与等量的细胞悬浮液(每mL中加入1000个人红细胞)混合
孵育20?#31181;櫻?#32780;后磁分离,即可获得相应的分离的细胞,通过检测剩余的细胞个数,按照
(4.5X 105-剩余的个数)/4.5X 105*100%得到了相应的分离效率如下。





分别将每一个分离得到的成熟人骨髓间充质干细胞通过流式细胞仪以及电镜分
析,发现所述的细胞均为人成熟骨髓间充质干细胞。这说明,本发明的适配子可以用于很好
的分离人成熟骨髓间充质干细胞。

实施例6成像效果检测

按照本领域常规的方法将已经标记有磁珠的适配子BMMSC-1与叠氮-荧光量子点
复合物相室温孵育?#21058;?h,形成相应的复合物。其?#26800;?#27694;-荧光量子点复合物的量为细胞摩
尔量的20倍。而后,将所述?#21058;?#29289;与混合有人成熟骨髓间充质干细胞、人脂肪来源间充质干
细胞、人肌肉来源的间充质干细胞和红细胞的细胞混合液混合1h,进行荧光成像,通过成像
发现,所述的人成熟骨髓间充质干细胞分布比较均?#21462;?#36890;过磁性分离,采用细胞标志物鉴定
发现,所述的细胞均为人成熟骨髓间充质干细胞。

采用适配子BMMSC-2~18也采用上述的成像效果检测,通过成像发现,其效果与适
配子BMMSC-1的效果一?#38534;?br />

实施例7分离的人成熟骨髓间充质干细胞分化研究

?#34903;?:将实施例5分离得到的人成熟骨髓间充质干细胞培养并传代,细胞数调整
为5*105/ml,接种在T25培养瓶中,用含10%FBS的DMEM高糖培养液进?#20449;?#20859;;

?#34903;?:待细胞贴壁后,用DMEM高糖培养液润洗细胞表面残留的培养基,将配置好
的软骨细胞诱导分化培养?#30418;?#24515;的加入培养瓶中,?#31185;?ml,放入37℃、5%C02的培养箱内
进?#20449;?#20859;。

其中,?#34903;?中所用到的软骨细胞诱导分化培养液的配方如下:

以DMEM高糖培养液为基础,含有10%胎牛血清,lOOμg/ml青霉素,lOOμg/ml链霉
素,?#22815;?#34880;酸50ug/ml、100nmol/L地塞米松、100μg/ml丙酮酸盐、40μg/ml脯氨酸、50mg/ml
ITS+Premix和TGF-β310ng/ml。

将诱导分化后的细胞采用流式细胞仪检测传代培养后的MSCs细胞表型:常规流式
方法测定MSCs特异性表达标记,该流式细胞检测所需试剂为:

Collagenll(abeamab79127)、CD44、CD45、CD29、CD34、CD271。检测的结果为特异性
标记物CD44表达率为99.32%,CD29表达率为97.26%,两者的表达量均明?#28304;?#20110;90%;其造
血细胞标记CD34和CD45表达率分别为2.11%和2.01%,两者表达呈阴性。由此证明了实施
例5分离纯化的人骨髓间充质干细胞具有分化特性可以用于相应的特性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的
限制,其他的?#39759;?#26410;背离本发明的精神实质与原理?#28388;?#20316;的改变、修饰、替代、组合、简化,
均应为等效的置换方式,?#21450;?#21547;在本发明的保护范围之内。

序列表

〈110〉魏乃东

〈120〉一种用于人成熟骨髓间充质干细胞检测的试剂盒

〈210〉1

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉BMMSC-1

TGGACAGACGTAAGACGTAAATTCACATCACACATCATTCACACCCCCCCTTCCAATGAGATGCCAGTAGTGACGA

〈210〉2

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉BMMSC-2

TGGACAGACGTAAGACGTAACCTACACATCCCTCAACTCACATTAATACATCTTATTGAGATGCCAGTAGTGACGA

〈210〉3

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉BMMSC-3

TGGACAGACGTAAGACGTAAATTATTTTACTACTACTATCTTACTAACCCCCTCTTTGAGATGCCAGTAGTGACGA

〈210〉4

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉BMMSC-4

TGGACAGACGTAAGACGTAACTTTCTTATCAACCATTACTAAACCTATATTAACATTGAGATGCCAGTAGTGACGA

〈210〉5

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉BMMSC-5

TGGACAGACGTAAGACGTAACCAACTCCTCCCAATCTACATCTCTCTTAATATTACTGAGATGCCAGTAGTGACGA

〈210〉6

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉BMMSC-6

TGGACAGACGTAAGACGTAAACAAAACACCCATCCCTACTCAATTTAATACTAATATGAGATGCCAGTAGTGACGA

〈210〉7

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉BMMSC-7

TGGACAGACGTAAGACGTAACCCCAACACCCCTAATATTATATCCTCTTCTTCATATGAGATGCCAGTAGTGACGA

〈210〉8

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉BMMSC-8

TGGACAGACGTAAGACGTAATTTTAACCTCATCTAATATTACATTCCCAATATTCTTGAGATGCCAGTAGTGACGA

〈210〉9

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉BMMSC-9

TGGACAGACGTAAGACGTAACTATACATATATACTCTTTTACCAATTTAATCTAAATGAGATGCCAGTAGTGACGA

〈210〉10

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉BMMSC-10

TGGACAGACGTAAGACGTAATCTTTTCTCTCCTCATTTCCATATTCTCCTTCCCCATGAGATGCCAGTAGTGACGA

〈210〉11

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉BMMSC-11

TGGACAGACGTAAGACGTAAAATTACCTCCATCTATCCTCCATTTCATTTACTAACTGAGATGCCAGTAGTGACGA

〈210〉12

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉BMMSC-12

TGGACAGACGTAAGACGTAAACCATAACTCTTCCCATCAATCTCACCATAACTTTTTGAGATGCCAGTAGTGACGA

〈210〉13

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉BMMSC-13

TGGACAGACGTAAGACGTAAAACTCTCCTTATCCCAATTTTCTCTTCAACATAAACTGAGATGCCAGTAGTGACGA

〈210〉14

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉BMMSC-14

TGGACAGACGTAAGACGTAAATCCTCTCTCAACACTTACTCCCAACCTCACTATCCTGAGATGCCAGTAGTGACGA

〈210〉15

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉BMMSC-15

TGGACAGACGTAAGACGTAATTCTTACACTATCTCCCTACTTCCTATTACTTTTCTTGAGATGCCAGTAGTGACGA

〈210〉16

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉BMMSC-16

TGGACAGACGTAAGACGTAACTCTCTCATACTCTAACTACAACTCCTCTCTACAACTGAGATGCCAGTAGTGACGA

〈210〉17

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉BMMSC-17

TGGACAGACGTAAGACGTAACCTATACATACTTCTCCTTAACTCTTCTTCAACTCATGAGATGCCAGTAGTGACGA

〈210〉18

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉BMMSC-18

TGGACAGACGTAAGACGTAATATAACTACTAAATCAAAACATCTACTTACCTCACTTGAGATGCCAGTAGTGACGA

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