平码五不中公式规律
  • / 7
  • 下载费用:30 金币  

一种猪瘟病毒抗体竞争化学发光定量检测试剂盒.pdf

关 键 ?#21097;?/dt>
一种 猪瘟 病毒 抗体 竞争 化学 发光 定量 检测 试剂盒
  专利查询网所有?#35797;?#22343;是用户自行?#27927;?#20998;享,仅供网友学习交流,未经?#27927;?#29992;户书面授权,请勿作他用。
摘要
申请专利号:

CN201610564286.5

申请日:

2016.07.18

公开号:

CN106483286A

公开日:

2017.03.08

当前法律状态:

实审

有效性:

审中

法?#19978;?#24773;: 实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/569申请日:20160718|||专利申请权的转移IPC(主分类):G01N 33/569登记生效日:20170302变更事项:申请人变更前权利人:洛阳莱普生信息科技有限公司变更后权利人:中国兽医药品监察所变更事项:地址变更前权利人:471000 河南省洛阳?#26032;?#40857;科技园区?#26723;?#22823;道西N3号变更后权利人:100081 ?#26412;?#24066;海淀区中关村?#27927;?#34903;8号变更事项:申请人变更后权利人:洛阳莱普生信息科技有限公司|||著录事项变更IPC(主分类):G01N 33/569变更事项:发明人变更前:李秀梅 王琴 刘玉宝 徐璐 耿玉静 任雪建 李莹变更后:徐璐 王琴 李秀梅 赵启祖 任雪建 杨劲松 张乾义 朱元源 邹兴启 李翠|||公开
IPC分类号: G01N33/569; G01N21/76 主分类号: G01N33/569
申请人: 洛阳莱普生信息科技有限公司
发明人: 李秀梅; 王琴; 刘玉宝; 徐璐; 耿玉静; 任雪建; 李莹
地址: 471000 河南省洛阳?#26032;?#40857;科技园区?#26723;?#22823;道西N3号
优?#28909;ǎ?/td>
专利代理机构: 洛阳公信知识产权事务所(普通合伙) 41120 代理人: 程茗
PDF完整版下载: PDF下载
法律状态
申请(专利)号:

CN201610564286.5

授权公告号:

|||||||||

法律状态公告日:

2017.04.05|||2017.03.22|||2017.03.22|||2017.03.08

法律状态类型:

实质审查的生效|||专利申请权、专利权的转移|||著录事项变更|||公开

摘要

本发明涉及一种猪瘟病毒抗体竞争化学发光定量检测试剂盒,该试剂盒包括包被抗原包被板、酶标抗体、校准品、浓缩洗涤液、发光底物A、发光底物B;所述抗原包被板,将纯化的猪瘟病毒E2蛋白作为包被抗原;酶标抗体为酶标抗体由辣根过氧化物酶标记的猪瘟病毒单克隆抗体;所述校准品,将活疫苗免疫的高免血清采用校准品稀释液分别稀释到浓度为0?NU/mL、2NU/mL、5?NU/mL、10?NU/mL、30?NU/mL和60NU/mL;所述发光底物A中含有鲁米诺,羟基香豆素、没食子酸和Tris?Hcl缓冲液;本发明试剂盒具有检测时间短,检测信号大大增强,灵敏度高等优点。

权利要求书

1.一种猪瘟病毒抗体竞争化学发光定量检测试剂盒,包括抗原包被板、酶标抗体、校准
品、浓缩洗涤液、发光底物A和发光底物B,其特征在于:
所述抗原包被板,将纯化的猪瘟病毒E2蛋白作为包被抗原,使用PH9.6的碳酸盐缓冲液
将猪瘟病毒E2蛋白包被在不透明聚苯乙烯板上;
所述酶标抗体为酶标抗体由辣根过氧化物酶标记的猪瘟病毒单克隆抗体;采用戊二醛
方法进行标记,即将猪瘟病毒单克隆抗体、戊二醛和辣根过氧化物酶加入容器中进行交联,
所?#27809;?#21512;物,进行透析除去过量的戊二醛;在透析后的混合物?#26657;?#21152;入等体积的甘油,置于-
20℃保存;
所述校准品,将活疫苗免疫的高免血清采用校准品稀释液分别稀释到浓度为0 NU/mL、
2NU/mL、5 NU/mL、10 NU/mL、30 NU/mL和60NU/mL;
所述剂量单位NU/mL的建立方法为,根据血清的细胞中和试验结果,挑选效价分别为全
阴血清、1:2、1:20、1:80、1:960、1:2560的血清,建立起和中和试验血清效价相对应的线性
关系,并且建立起和中和试验血清效价分别为全阴血清、1:2、1:20、1:80、1:960、1:2560相
对应的校准品,校准品分别为0、2、5、10、30、60,并且建立剂量单位NU/ml;
所述浓缩洗涤液,为含有0.05%的Tween-20的PBS缓冲液,使用时采用蒸馏水进行稀释;
所述发光底物A中含有鲁米诺0.15mmol/L,羟基香豆素0.59mmol/L、没食子酸
0.35mmol/L和Tris-Hcl缓冲液0.2mol/L,余量为水;
所述发光底物B中含有?#34987;?#37240;氧化酶0.85mmol/L,吐温-20 体积浓度为.8%, DTPA
0.5mmol/L、维生素C 0.12mmol/L和乙酸-乙酸盐缓冲液0.2mol/L,余量为水。
2.如权利要求1所述猪瘟病毒抗体竞争化学发光定量检测试剂盒,其特征在于:所述校
准品稀释液为每1000mL PBS缓冲液中加入10g牛血清白蛋白,再加入质量浓度为0.5‰的
NaN3。
3.如权利要求1所述猪瘟病毒抗体竞争化学发光定量检测试剂盒检测猪瘟病毒抗体的
方法,其特征在于:包括以下?#34903;瑁?br />
(1)加样 取出抗原包被板,每块板可检测样本90份,设校准品6孔;样本孔每?#20934;?#20837;50μ
l的样本,校准品孔每孔各加入50μl,再向以上各孔中立即加入50μl酶结合物;
(2)孵育 置37℃恒温培养箱内孵育30±1?#31181;櫻?br />(3)洗板 采用蒸馏水进行对浓缩洗涤液进行稀释得到洗涤液;将各孔的液体弃入废液
筒,每?#20934;?#20837;洗涤液28±20μl,浸泡约30秒,弃去洗涤液,连续洗涤5次;在最后一次洗涤液
弃去后,将孔中残留的洗涤液在吸水纸上拍干;
(4)加入发光底物、测定 每?#20934;?#20837;50μl发光底物A和50μl发光底物B,18~26℃避光
5min后在发光仪上测定;
(5)结果判定 以校准品发光值为纵坐标,对应的校准品浓度为横坐标,绘制校准品的
四参数标准曲线,四参数模式为Y=(a-d)/[1+(x/c)b]+d;将样本的发光值代入标准曲线?#26657;?br />从校准曲线上?#33519;?#35835;出样品中猪瘟病毒抗体的含量,剂量值≥2.5 NU/mL,判定为阳性;剂
量值<2.5 NU/mL,判定为阴性。
4.如权利要求1所述猪瘟病毒抗体竞争化学发光定量检测试剂盒检测猪瘟病毒抗体的
方法,其特征在于:所述?#34903;瑁?)中每?#20934;?#20837;50μl发光底物A和50μl发光底物B可替换为,发
光底物A和发光底物B等体积比混匀后,添加洗涤液补充至100μl。

说明书

一种猪瘟病毒抗体竞争化学发光定量检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种试剂盒,具体的说是一种猪瘟病毒抗体竞争化学发光定量检测试
剂盒。

背景技术

猪瘟?#32622;?#38669;乱,我国俗称俗称“烂肠瘟?#20445;?#26159;由猪瘟病毒引起猪的一种高度接触性
传染病,会出?#20013;?#34880;管壁变性、内脏器官多发性出血、坏死和梗死。该病传播快、流行广、发
病率高和死亡率高,危害极大。世界卫生组织将其列为法定的报告动物疫病,我国2008年修
订的《一、二、三类动物疫病病种记录》将其列为一类动物疫病。我国猪瘟特征是以非典型猪
瘟或温和型猪瘟以及妊娠母猪繁殖?#20064;?#20026;主要表?#20013;?#24335;,持续感染、隐性感染、混合感?#31454;?br />免疫失败现象普遍存在。目前我国的防?#26410;?#26045;中以疫苗免疫为主,对疫苗免疫效果的评价
主要通过猪瘟抗体水平的检测。

因此猪瘟病毒抗体快速检测成为了控制和消灭该病的前提。目前的猪瘟诊断技
术,主要有补体结合试验、琼脂免疫扩散试验、病毒中和试验等方法。但是,传统的检测方法
都需要较长时间的诊断过程,以及一定的实验技能和仪器设备,一般只适用实验室的诊?#31232;?br />近年来,ELISA诊断技术取得了很大的进步,有许多敏?#34892;?#39640;、特异性好的ELISA方法已经运
用到疫苗免疫群体的大规模血清学检验当?#26657;?#36825;些方法主要是间接ELISA和阻断ELISA。这
些方法虽然灵敏度高、特异性强,但存在内源性酶干扰、底物大部分有毒或为致癌物?#23454;热?br />点。开发一种安全、灵敏、高效的检测诊断方法十分必要。

化学发光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay, CLIA)是近十年来在世界
范围内发展非常迅速的非放射性免疫分析,是继放射免疫分析和?#35813;?#30123;分析之后发展起来
的一种超高灵敏度的微量测定技术。化学发光免疫分析将抗原与杭体的高特异性免疫反应
与高灵敏的化学发光检测技术相结合,将化学发光物质标记杭原或杭体,再进行免疫结合
反应,?#32431;?#36827;行定性、定量测定。该方法具有高灵敏度、检测范围宽、操作简便快速、标记物
稳定、无污染、仪器简单经济等优点。如果将两种方法有效的结合在一起,就可以使口蹄疫
的检测更快速、更灵敏、更准确、更安全。

发明内容

本发明目的是为解决上述技术问题的不足,提供一种猪瘟病毒抗体竞争化学发光
定量检测试剂盒,其具有检测时间短,检测信号大大增强,灵敏度高等优点,且实?#33267;?#29482;瘟
病毒抗体定量检测。

本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案是:

一种猪瘟病毒抗体竞争化学发光定量检测试剂盒,包括抗原包被板、酶标抗体、校准
品、浓缩洗涤液、发光底物A、发光底物B;

所述抗原包被板,将纯化的猪瘟病毒E2蛋白作为包被抗原,使用PH9.6的碳酸盐缓冲液
将猪瘟病毒E2蛋白包被在不透明聚苯乙烯板上;

所述酶标抗体为酶标抗体由辣根过氧化物酶标记的猪瘟病毒单克隆抗体;采用戊二醛
方法进行标记,即将猪瘟病毒单克隆抗体、戊二醛和辣根过氧化物酶加入容器中进行交联,
所?#27809;?#21512;物,进行透析除去过量的戊二醛;在透析后的混合物?#26657;?#21152;入等体积的甘油,置于-
20℃保存;

所述校准品,将活疫苗免疫的高免血清采用校准品稀释液分别稀释到浓度为0 NU/mL、
2NU/mL、5 NU/mL、10 NU/mL、30 NU/mL和60NU/mL;

所述剂量单位NU/mL的建立方法为,根据血清的细胞中和试验结果,挑选效价分别为全
阴血清、1:2、1:20、1:80、1:960、1:2560的血清,建立起和中和试验血清效价相对应的线性
关系,并且建立起和中和试验血清效价分别为全阴血清、1:2、1:20、1:80、1:960、1:2560相
对应的校准品,校准品分别为0、2、5、10、30、60,并且建立剂量单位NU/ml;

所述浓缩洗涤液,为含有0.05%的Tween-20的PBS缓冲液,使用时采用蒸馏水进行稀释;

所述发光底物A中含有鲁米诺0.15mmol/L,羟基香豆素0.59mmol/L、没食子酸
0.35mmol/L和Tris-Hcl缓冲液0.2mol/L,余量为水;

所述发光底物B中含有?#34987;?#37240;氧化酶0.85mmol/L,吐温-20 体积浓度为.8%, DTPA
0.5mmol/L、维生素C 0.12mmol/L和乙酸-乙酸盐缓冲液0.2mol/L,余量为水;

所述校准品稀释液为每1000mL PBS缓冲液中加入10g牛血清白蛋白,再加入质量浓度
为0.5‰的NaN3(三氮化钠)。

所述猪瘟病毒抗体竞争化学发光定量检测试剂盒检测猪瘟病毒抗体的方法,包括
以下?#34903;瑁?br />

(1)加样 取出抗原包被板,每块板可检测样本90份,设校准品6孔;样本孔每?#20934;?#20837;50μ
l的样本,校准品孔每孔各加入50μl,再向以上各孔中立即加入50μl酶结合物;

(2)孵育 置37℃恒温培养箱内孵育30±1?#31181;櫻?br />

(3)洗板 采用蒸馏水进行对浓缩洗涤液进行稀释得到洗涤液;将各孔的液体弃入废液
筒,每?#20934;?#20837;洗涤液28±20μl,浸泡约30秒,弃去洗涤液,连续洗涤5次;在最后一次洗涤液
弃去后,将孔中残留的洗涤液在吸水纸上拍干;

(4)加入发光底物、测定 每?#20934;?#20837;50μl发光底物A和50μl发光底物B,18~26℃避光
5min后在发光仪上测定;

(5)结果判定 以校准品发光值为纵坐标,对应的校准品浓度为横坐标,绘制校准品的
四参数标准曲线,四参数模式为Y=(a-d)/[1+(x/c)b]+d;(其中a--吸光度上限值,b-吸光度
增长速率参数,相当于曲线的斜?#21097;籧--吸光度增长速度开始发生变化的浓度值,相当于半
数反应浓度(EC50);d--吸光度下限值;y-发光值,x-最终得到的实际含量;)将样本的发光
值代入标准曲线?#26657;?#20174;校准曲线上?#33519;?#35835;出样品中猪瘟病毒抗体的含量,剂量值≥2.5 NU/
mL,判定为阳性;剂量值<2.5 NU/mL,判定为阴性。

所述?#34903;瑁?)中每?#20934;?#20837;50μl发光底物A和50μl发光底物B可替换为,发光底物A和
发光底物B等体积比混匀后,添加洗涤液补充至100μl。

有益效果是:

1、本发明试剂盒,可检测0~2000万的发光值,线性范围大,30min可检出结果;传统酶
免分析法,可检测0~3.5的OD值,线性范围小,75min可检出结果;化学发光实?#33267;?#26816;测时间
短,检测信号大大增强;敏?#34892;?#26816;验结果显示其具有检测更为准确灵敏。

2、根据血清中和试验的不同血清效价如全阴血清、1:2、1:20、1:80、1:960、和1:
2560等建立起相应的校准品浓度及单位,建立起和中和试验血清效价相对应的线性关系,
并且建立新的剂量单位NU/mL,在大分?#30001;?#39318;先实?#33267;?#29482;瘟病毒抗体定量检测,并可以快速
的定量检测大批样本,快速准确,具有技术上的显著进步。酶标单抗隆抗体的制备,实?#33267;?br />一步法30min出结果,血清不需要稀释?#33519;?#21152;样,缩短了反应时间,简化了操作过程。采用发
光底物,相?#27927;?#32479;的显色底物,加入发光底物后无需终止可以?#33519;?#35835;值,缩短了操作时间,
致癌性和危害性较小,更为安全无污染。

具体实施方式

一种猪瘟病毒抗体竞争化学发光定量检测试剂盒,包括抗原包被板、酶标抗体、校
准品、浓缩洗涤液、发光底物A、发光底物B;

所述抗原包被板,将纯化的猪瘟病毒E2蛋白作为包被抗原,使用PH9.6的碳酸盐缓冲液
将猪瘟病毒E2蛋白包被在不透明聚苯乙烯板上;

所述酶标抗体为酶标抗体由辣根过氧化物酶标记的猪瘟病毒单克隆抗体;采用戊二醛
方法进行标记,即将猪瘟病毒单克隆抗体、戊二醛和辣根过氧化物酶加入容器中进行交联,
所?#27809;?#21512;物,进行透析除去过量的戊二醛;在透析后的混合物?#26657;?#21152;入等体积的甘油,置于-
20℃保存;

所述校准品,将活疫苗免疫的高免血清采用校准品稀释液分别稀释到浓度为0 NU/mL、
2NU/mL、5 NU/mL、10 NU/mL、30 NU/mL和60NU/mL;

所述剂量单位NU/mL的建立方法为,根据血清的细胞中和试验结果,挑选效价分别为全
阴血清、1:2、1:20、1:80、1:960、1:2560的血清,建立起和中和试验血清效价相对应的线性
关系,并且建立起和中和试验血清效价分别为全阴血清、1:2、1:20、1:80、1:960、1:2560相
对应的校准品,校准品分别为0、2、5、10、30、60,并且建立剂量单位NU/ml;剂量单位NU/mL建
立,首先实?#33267;?#23450;量、快速检测,可以快速的定量检测大批样本。

所述浓缩洗涤液,为含有0.05%的Tween-20的PBS缓冲液,使用时采用蒸馏水进行
稀释;

所述发光底物A中含有鲁米诺0.15mmol/L,羟基香豆素0.59mmol/L、没食子酸
0.35mmol/L和Tris-Hcl缓冲液0.2mol/L,余量为水;

所述发光底物B中含有?#34987;?#37240;氧化酶0.85mmol/L,吐温-20 体积浓度为.8%, DTPA
0.5mmol/L、维生素C 0.12mmol/L和乙酸-乙酸盐缓冲液0.2mol/L,余量为水;

所述校准品稀释液为每1000mL PBS缓冲液中加入10g牛血清白蛋白,再加入质量浓度
为0.5‰的NaN3。

所述猪瘟病毒抗体竞争化学发光定量检测试剂盒检测猪瘟病毒抗体的方法,包括
以下?#34903;瑁?br />

1、加样 取出抗原包被板,每块板可检测样本90份,设校准品6孔。样本孔每?#20934;?#20837;50μl
的样本,校准品孔每?#20934;?#20837;S1~S6各50μl,再向以上各孔中立即加入50μl酶结合物。

2、孵育 置37℃恒温培养箱内孵育30?#31181;櫻ā??#31181;櫻?br />

3、洗板 将各孔的液体弃入废液筒,每?#20934;?#20837;洗涤液280μl(±20μl),浸泡约30秒,
弃去洗涤液,连续洗涤5次。在最后一次洗涤液弃去后,将孔中残留的洗涤液在吸水纸上拍
干。

4、加入发光底物、测定 每?#20934;?#20837;50μl发光底物A和50μl发光底物(也可发光底物
A、B等比例混匀后加100μl),18~26℃避光5min后在发光仪上测定。

5、结果判定 以校准品发光值为纵坐标,对应的校准品浓度为横坐标,绘制校准品
的四参数拟合曲线,四参数模式为Y=(a-d)/[1+(x/c)b]+d。将样本的发光值代入标准曲线
?#26657;?#20174;标准曲线上?#33519;?#35835;出样品中猪瘟病毒抗体实际含量。

剂量值≥2.5 NU/mL,判定为阳性;

剂量值<2.5 NU/mL,判定为阴性。

相关实验

一、特异性检验

按照说明书操作要求测定猪丹毒、猪伪狂犬、副猪嗜血?#21496;?#29482;?#19981;发?#22411;、猪繁殖与呼
吸?#20064;?#32508;合征病毒(PRRSV)阳性血清,检验结果为猪丹毒、猪伪狂犬、副猪嗜血?#21496;?#29482;?#19981;?br />Ⅱ型、猪繁殖与呼吸?#20064;?#32508;合征病毒(PRRSV)阳性血清的浓度值均小于2.5 NU/mL,无特异
性反应。数据如下:


二、敏?#34892;?#26816;验

敏?#34892;?#20197;阳性检出率来表示,选择30份猪血清(其中10份阴性、10份弱阳、10份强阳),
以中和试验为金标准,数据如下:


中和试验效价大于1:10为阳性,效价小于1:10为阴性;本试剂盒剂量值大于等于
2.5NU/mL为阳性,剂量值小于2.5NU/mL为阴性;有数据可知本试剂盒和中和试验的阳性符
?#19979;?#20026;100%,说明本试剂盒有较好的敏?#34892;浴?br />

[email protected] 2017-2018 zhuanlichaxun.net网站版权所有
经营许可证编号:粤ICP备17046363号-1 
 


收起
展开
平码五不中公式规律 炸金花可提现1元1金币 北京赛车pk10全能计划 极速11选5开奖 qq分分彩票 北京pc28开奖结果查询 北京赛车机器人总代理 澳洲幸运5开奖 快乐飞艇直播 白山棋牌游戏官网 北京pk10开奖直播