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用于检测细胞角蛋白19片段的化学发光免疫试剂盒.pdf

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用于 检测 细胞 角蛋白 19 片段 化学 发光 免疫 试剂盒
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摘要
申请专利号:

CN201610863945.5

申请日:

2016.09.29

公开号:

CN106483298A

公开日:

2017.03.08

当前法律状态:

授权

有效性:

有权

法?#19978;?#24773;: 专利权的转移 IPC(主分类):G01N 33/68登记生效日:20190212变更事项:专利权人变更前权利人:广州华弘生物科技有限公司变更后权利人:居李生物科技(?#26412;?#26377;限公司变更事项:地址变更前权利人:510530 广东省广州市高新技术产业开发区科学?#21069;?#27827;路84号自编二栋101变更后权利人:100096 ?#26412;?#24066;昌?#35282;?#22238;龙观镇科技园区回龙观中关村生命科学园路8号1号楼A座二层|||授权|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/68申请日:20160929|||公开
IPC分类号: G01N33/68; G01N33/577; G01N33/543; G01N21/76 主分类号: G01N33/68
申请人: 广州华弘生物科技有限公司
发明人: 陈立国; 邹伟权; 张亚丽; 李庆祥; 母润红; 王涛; 苏焱
地址: 510530 广东省广州市高新技术产业开发区科学?#21069;?#27827;路84号自编二栋101
优?#28909;ǎ?/td>
专利代理机构: ?#26412;?#31934;金石专利代理事务所(普通合伙) 11470 代理人: 刘晔
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法律状态
申请(专利)号:

CN201610863945.5

授权公告号:

|||||||||

法律状态公告日:

2019.03.01|||2017.08.11|||2017.04.05|||2017.03.08

法律状态类型:

专利申请权、专利权的转移|||授权|||实质审查的生效|||公开

摘要

本发明属于医疗检测领域,具体涉及一种用于检测细胞角蛋白19片段的化学发光免疫试剂盒及其制备方法。所述试剂盒包含的试剂有Cyfra21?1磁分离试剂,酶标记的Cyfra21?1抗体溶液,标准品,洗涤液以及化学发光底物溶液。

权利要求书

1.一种细胞角蛋白19片段(Cyfra21-1)的定量测定试剂盒,其包含的试剂有Cyfra21-1
磁分离试剂,酶标记的Cyfra21-1抗体溶液,标准品,洗涤液以及化学发光底物溶液。
2.根据权利要求1所述的定量测定试剂盒,其特征在于,所述Cyfra21-1磁分离试剂为
含有1mg/ml的?#21058;?#26377;抗Cyfra21-1单克隆抗体的磁性微球,0.4mg/ml的十八烷基三甲基氯
化铵,0.2mg/ml的卵磷脂,0.1mg/ml的PEG200的50mmol/L的PBS缓冲液,pH值为7.4。
3.根据权利要求1所述定量测定试剂盒,其特征在于,所述酶标记的Cyfra21-1抗体溶
液是含有1mg/ml?#22791;?#36807;氧化酶标记的抗Cyfra21-1单克隆抗体和1mg/ml BSA的50mmol/L的
PBS缓冲液,pH值为7.4。
4.根据权利要求1所述的定量测定试剂盒,其特征在于,所述的标准品为不同浓度的
Cyfra21-1标准品溶液,其分别含有0、0.1、0.5、1、2、4、8和16ng/ml的Cyfra21-1标准品的
50mmol/l PBS缓冲液,pH7.4。
5.根据权利要求1所述的定量测定试剂盒,其特征在于,洗涤液由在浓度为20mol/L、pH
为7.4的磷酸盐缓冲液中加入1%的Tween-20配制而成。
6.根据权利要求1所述的定量测定试剂盒,其特征在于,所述化学发光底物溶液分为发
光底物A溶液和发光底物B溶液;发光底物A为0.1M、pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液,且该缓冲
液中含有?#24352;?#24230;为5.0mg/mL的鲁米诺,所述发光底物B为是pH值为4.5的0.1M柠檬酸缓冲
液,且该缓冲液中含有?#24352;?#24230;为100mg/mL的过氧化氢和15mg/mL?#22791;?#36807;氧化氢酶。
7.一种权利要求1所述的定量测定试剂盒的制备方法,具体步骤如下:
1)Cyfra21-1磁分离试剂的制备:采用化学交联法将Cyfra21-1单克隆抗体和磁性微球
?#21058;?#30913;性微球?#26412;?#22312;1.0μm左右,制备后用PBS缓冲液冲洗三次,然后用1%的BSA溶液封闭
3小时,磁性分离微球,用PBS缓冲液冲洗三次,然后用50mmol/L的PBS缓冲液重新悬浮,加入
?#24352;?#24230;0.4mg/ml的十八烷基三甲基氯化铵,0.2mg/ml的卵磷脂和0.1mg/ml的PEG200,调pH
值至7.4即得;
2)酶标记的Cyfra21-1抗体溶液的制备:采用NaIO4法标记Cyfra21-1单克隆抗体,反应
后透析纯化,然后用20mmol/L的PBS缓冲液溶解,加入?#24352;?#24230;1mg/ml BSA,调pH值至7.4即
得;
3)常规方法配置标准品、洗涤液和化学底物溶液。

说明书

用于检测细胞角蛋白19片段的化学发光免疫试剂盒

技术领域

本发明属于医疗检测领域,具体涉及一种用于检测细胞角蛋白19片段的化学发光
免疫试剂盒及其制备方法。

背景技术

?#20255;?#26159;威胁人类健康的常见恶性肿瘤,其发病率以每年3%的速度上升。近年来对
?#20255;?#30340;治疗虽然取得很大进展,但效果仍不理想,其5年生存率仍在20%~30%,而中晚期
癌治疗效果更差。研究表明,早期诊?#19979;?#26159;提高生存率的关键所在,而目前所用标志物在敏
?#34892;浴?#29305;异性方面还不能达到要求。

细胞角蛋白19片段(cyfra21-1)是一分子量为40×103的酸性蛋白?#21097;?#26159;上皮细胞
骨架的一部分,在恶性上皮细胞中,激活的蛋白酶加速了细胞角蛋白的?#20064;?#20351;得大量细胞
角蛋白片段释放入血,尤其是cyfra21-1在?#20255;?#20013;含量丰富,其与CEA和NSE联合检测对?#20255;?br />的鉴别诊断,病情监测有重要价值。Cyfra21-1对乳腺癌,膀胱癌,卵巢癌也是很好的辅助诊
断和治疗监测指标。还应与其他有关的肿瘤标志物联合检测,以同时提高临床诊断的特异
性和灵敏度。

对Cyfra21-1的定量分析,目前常用的是放射免疫分析(RIA)和酶联免疫吸附分析
(ELISA),其中RIA必须用I等放射性元素标记,检测设备复杂,必须用专门的仪器测定,其放
射性核素的半衰期短,不能长期保存,同?#24065;?#32473;实验操作人员带来了放射性伤害。ELISA检
测灵敏度?#36824;?#39640;,检测?#27573;?#31364;,影响因素较多,易造成假阴性和假阳性?#28909;?#28857;也不能满足临
床的要求,因此,化学发光免疫分析方法(CLIA)应运而生。

磁性微球作为体外诊断的固相载体,起到识别、捕获、控制与运输目标待检分子的
载体作用。由于其在整个反应过程中均是悬浮在待检样本中,与传统的多孔板载体相比,其
整个反应基本处于液态或准液态状态,载体与待检物之间发生分?#20248;?#25758;的几率大大增加。
另外,由于磁性微球?#27927;?#30340;表面积提高了负载目标待检分子的效?#21097;?#22240;而使得其生物反应
效?#24335;洗?#32479;多孔板方式大为提高;一般多孔板上的生物反应需要在1~3小时之间,而基于
磁性微球的生物反应仅需十几?#31181;印?#21478;外,由于磁性微球卓越的超顺磁特性,使得采用全自
动磁性分离方式与检测可以轻松地实现。

专利CN200710121167公开一种细胞角蛋白19片段的化学发光免疫分析方法,但是
其仍然是将相关抗体固定在传统的多孔板上进行相关检测。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种细胞角蛋白19片段(Cyfra21-1)的定量测定试剂
盒,其包含的试剂有Cyfra21-1磁分离试剂,酶标记的Cyfra21-1抗体溶液,标准品,洗涤液
以及化学发光底物溶液。

所述Cyfra21-1磁分离试剂为含有1mg/ml的?#21058;?#26377;抗Cyfra21-1单克隆抗体的磁
性微球,0.4mg/ml的十八烷基三甲基氯化铵,0.2mg/ml的卵磷脂,0.1mg/ml的PEG200的
50mmol/L的PBS缓冲液,pH值为7.4。

所述酶标记的Cyfra21-1抗体溶液是含有1mg/ml?#22791;?#36807;氧化酶标记的抗Cyfra21-
1单克隆抗体和1mg/ml BSA的50mmol/L的PBS缓冲液,pH值为7.4。

所述标准品为不同浓度的Cyfra21-1标准品溶液,其分别含有0、0.1、0.5、1、2、4、8
和16ng/ml的Cyfra21-1标准品的50mmol/l PBS缓冲液,pH7.4。

洗涤液由在浓度为20mol/L、pH为7.4的磷酸盐缓冲液中加入1%的Tween-20配制
而成。

所述化学发光底物溶液分为发光底物A溶液和发光底物B溶液;发光底物A为0.1M、
pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液,且该缓冲液中含有?#24352;?#24230;为5.0mg/mL的鲁米诺,所述发光底
物B为是pH值为4.5的0.1M柠檬酸缓冲液,且该缓冲液中含有?#24352;?#24230;为100mg/mL的过氧化氢
和15mg/mL?#22791;?#36807;氧化氢酶。

本发明的另一个目的是提供所述试剂盒的制备方法,具体步骤如下:

1)Cyfra21-1磁分离试剂的制备:采用化学交联法将Cyfra21-1单克隆抗体和磁性
微球?#21058;?#30913;性微球?#26412;?#22312;1.0μm左右,制备后用PBS缓冲液冲洗三次,然后用1%的BSA溶液
封闭3小时,磁性分离微球,用PBS缓冲液冲洗三次,然后用50mmol/L的PBS缓冲液重新悬浮,
加入?#24352;?#24230;0.4mg/ml的十八烷基三甲基氯化铵,0.2mg/ml的卵磷脂和0.1mg/ml的PEG200,
调pH值至7.4即得;

2)酶标记的Cyfra21-1抗体溶液的制备:采用NaIO4法标记Cyfra21-1单克隆抗体,
反应后透析纯化,然后用20mmol/L的PBS缓冲液溶解,加入?#24352;?#24230;1mg/ml BSA,调pH值至7.4
即得;

3)常规方法配置标准品、洗涤液和化学底物溶液。

具体实施方式

下面将进一步的来举例说明本发明。需要指出的是,以?#28388;?#26126;仅仅是对本发明要
求保护的技术方案的举例说明,并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护?#27573;?#20197;所
附权利要求书记载的内容为准。

实施例1试剂盒制备

1)Cyfra21-1磁分离试剂的制备:

采用0.05mol/L的PBS缓冲液将聚苯乙烯磁性微球悬浮,磁性微球?#26412;?#22312;1.0μm左
右,磁性微球的质量分数为2.5%;然后向微球溶液中添加?#24352;?#24230;为1mg/ml的Cyfra21-1单
克隆抗体(所述单克隆抗体与下述酶标记用Cyfra21-1单克隆抗体为配对抗体,购自上海领
潮生物科技有限公司),摇匀10?#31181;櫻?#28982;后向体系中加入3.5mg/ml碳亚二胺,摇床反应20小
时,PBS缓冲液清洗三次,磁性分离获得微球,然后用1%的BSA溶液封闭3小时,磁性分离微
球,用PBS缓冲液冲洗三次,磁性分离,然后将?#21058;?#26377;抗Cyfra21-1单克隆抗体的磁性微球分
散在0.4mg/ml的十八烷基三甲基氯化铵,0.2mg/ml的卵磷脂,0.1mg/ml的PEG200的50mmol/
L的PBS缓冲液中,调pH值为7.4,从而获得Cyfra21-1磁分离试剂。

2)酶标记的Cyfra21-1抗体溶液的制备:采用本领域常规NaIO4法获得?#22791;?#36807;氧化
物酶标记的Cyfra21-1单克隆抗体,反应后透析纯化,然后用50mmol/L的PBS缓冲液溶解,加
入?#24352;?#24230;1mg/ml BSA,调pH值至7.4即得;

3)常规方法配置标准品、洗涤液和化学底物溶液。

制备后试剂盒组成如下:

Cyfra21-1磁分离试剂为含有1mg/ml的?#21058;?#26377;抗Cyfra21-1单克隆抗体的磁性微
球,0.4mg/ml的十八烷基三甲基氯化铵,0.2mg/ml的卵磷脂,0.1mg/ml的PEG200的50mmol/L
的PBS缓冲液,pH值为7.4。

酶标记的Cyfra21-1抗体溶液是含有1mg/ml?#22791;?#36807;氧化酶标记的抗Cyfra21-1单
克隆抗体和1mg/ml BSA的50mmol/L的PBS缓冲液,pH值为7.4。

标准品为不同浓度的Cyfra21-1标准品溶液,其分别含有0、0.1、0.5、1、2、4、8和
16ng/ml的Cyfra21-1标准品的50mmol/l PBS缓冲液,pH7.4。

洗涤液由在浓度为20mol/L、pH为7.4的磷酸盐缓冲液中加入1%的Tween-20配制
而成。

所述化学发光底物溶液分为发光底物A溶液和发光底物B溶液;发光底物A为0.1M、
pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液,且该缓冲液中含有?#24352;?#24230;为5.0mg/mL的鲁米诺,所述发光底
物B为是pH值为4.5的0.1M柠檬酸缓冲液,且该缓冲液中含有?#24352;?#24230;为100mg/mL的过氧化氢
和15mg/mL?#22791;?#36807;氧化氢酶。

实施例2试剂盒检测方法

a.向微孔板分别加入血清样本和Cyfra21-1标准品,每孔20μl;

b.依次向每?#20934;?#20837;酶标记的Cyfra21-1抗体溶液和Cyfra21-1磁分离试剂各50μl,
振荡30s后,置37℃水浴30?#31181;印?br />

c.采用磁分离器,沉淀2?#31181;印?#32531;慢的倒转分离器倒出上清液,把倒转的微孔板连
同分离器一起放在滤纸上,用力拍击分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴。

d.加200μl洗涤液至每孔中,振荡混匀30s,磁分离去洗涤液,重复三次。

e.加发光底物A、B每孔各50μl,充分混匀,立刻加入化学发光仪中检测信号值。

实施例3Cyfra21-1磁分离试剂的稳定性考察

采用不同的溶液组成的磁分离试剂,在37℃下以60转/?#31181;右?#21160;放置一个月,采用
实施例2的方法测定Cyfra21-1标准品(浓度4ng/ml),其他检测试剂同实施例1,计算不同放
置时间测定的化学信号?#28068;?天时测定的化学信号值的百分?#21462;?#21508;组磁分离试剂组成如下:

组1?#21644;?#23454;施例1

组2:Cyfra21-1磁分离试剂为含有1mg/ml的?#21058;?#26377;抗Cyfra21-1单克隆抗体的磁
性微球,0.2mg/ml的卵磷脂,0.1mg/ml的PEG200的50mmol/L的PBS缓冲液,pH值为7.4。

组3:Cyfra21-1磁分离试剂为含有1mg/ml的?#21058;?#26377;抗Cyfra21-1单克隆抗体的磁
性微球,0.4mg/ml的十八烷基三甲基氯化铵,0.1mg/ml的PEG200的50mmol/L的PBS缓冲液,
pH值为7.4。

组4:Cyfra21-1磁分离试剂为含有1mg/ml的?#21058;?#26377;抗Cyfra21-1单克隆抗体的磁
性微球,0.4mg/ml的十八烷基三甲基氯化铵,0.2mg/ml的卵磷脂的50mmol/L的PBS缓冲液,
pH值为7.4。

具体结果如下:

N=5
组1
组2
组3
组4
5天
99.1%
82.4%
91.6%
89.3%
15天
98.8%
72.7%
83.3%
78.2%
30天
98.2%
64.1%
71.9%
68.7%

另外,需要说明的是将整个试剂盒置于37℃下保存一个月后,试剂盒性能没有明
显改变。与0天测定值相比差别<2%。

实施例4Cyfra21-1试剂盒性能考察

采用实施例1制备的Cyfra21-1检测试剂盒进行下列测定:

1)分别取Cyfra21-1标准品溶液,分别含有0、0.1、0.5、1、2、4、8和16ng/ml的
Cyfra21-1标准品;按照实施例2的方法进行测定,以化学发光值(RLU)为Y轴,以标准品浓度
为x轴,绘制标?#35760;?#32447;;结果表明:本发明实施例1试剂盒线性良好,线性方程为y=29821X+
945;线性系数R>0.999。

2)对20次零标准品的测定,取其2倍的平均偏差,其在标?#35760;?#32447;上所对应的浓度即
为分析灵敏度,结果表明实施例1试剂盒灵敏度为0.03ng/ml

实施例5实施例1试剂盒其他性能指标

精密性?#21495;?#20869;变异CV%≤4.3%;批间变异CV%≤4.7%

线性系数:r≥0.9990

线性?#27573;В?.10-16ng/ml

特异性?#27827;隒EA、AFP、CA199等常规肿瘤标志物交叉反应?#23454;?#20110;0.2%。

本发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案,其中一个或更多个技
术方案中所记载的技术特征可以与?#25105;?#30340;一个或多个技术方案相组合,这些经组合而得到
的技术方案也在本申请保护?#27573;?#20869;,就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开
内容中具体记载一样。

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