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植物病理血清学测定方法.pdf

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植物 病理 血清学 测定 方法
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摘要
申请专利号:

CN201610854011.5

申请日:

2016.09.27

公开号:

CN106483287A

公开日:

2017.03.08

当前法律状态:

实审

有效性:

审中

法?#19978;?#24773;: 实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/569申请日:20160927|||公开
IPC分类号: G01N33/569 主分类号: G01N33/569
申请人: 中国烟草总公司广东省公司
发明人: 陈泽鹏
地址: 510610 广东省广州市天河区林和东路128号
优?#28909;ǎ?/td>
专利代理机构: 佛山帮专知识产权代理事务所(普通合伙) 44387 代理人: 颜春艳
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法律状态
申请(专利)号:

CN201610854011.5

授权公告号:

|||

法律状态公告日:

2017.04.05|||2017.03.08

法律状态类型:

实质审查的生效|||公开

摘要

本发明提出了植物病理血清学测定方法,包括以下步骤:(1)取烟草畸形叶样品0.1g,用研杵捣碎,加入1mL的抗原包被缓冲液,转入离心管中离心;(2)加入200uL酶联板包被抗原;(3)倒掉包被缓冲液,用PBST。洗板3次;(4)在不同酶标板上分别加入黄瓜花叶病毒、烟草花叶病毒、烟草曲叶病毒的抗血清特异性IgG,每孔150ul,37℃,温育2h;(5)倒掉溶液,用PBST。洗板3次;(6)加入酶标样抗兔IgG,每孔100ul,37℃下温育2h;(7)倒掉溶液,用PBST。洗板3次,每次3min;(8)加入底物浴液,每孔150ul,室温20~30min,每孔加1滴2mol/L的H2SO4终止反应;(9)用450型酶标仪测OD495值,重复三次;该方法更加适合烟草染病原因的测定,提高了测定结果的准确性与可靠性。

权利要求书

1.植物病理血清学测定方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)取烟草畸形叶样品0.1g,用研杵捣碎,加入1mL的抗原包被缓冲液,转入离心管中离
心;
(2)加入200uL酶联板包被抗原,37℃下,2h;
(3)倒掉包被缓冲液,用PBST洗板3次,每次3min;
(4)在不同酶标板上分别加入黄瓜花叶病毒、烟草花叶病毒、烟草曲叶病毒的抗血清特
异性IgG,每孔150ul,37℃,温育2h;
(5)倒掉溶液,用PBST洗板3次,每次3min;
(6)加入酶标样抗兔IgG,每孔100ul,37℃下温育2h;
(7)倒掉溶液,用PBST洗板3次,每次3min;
(8)加入底物浴液,每孔150ul,室温20~30min,每孔加1滴2mol/L的H2SO4终止反应;
(9)用450型酶标仪测OD495值,重复三次。
2.如权利要求1中所述植物病理血清学测定方法,其特征在于:所述包被缓冲液为采用
每1000mL中含1.59g Na2CO3,2.93g NaHCO3,0.2g NaN3,调节pH值至9.6。
3.如权利要求1中所述植物病理血清学测定方法,其特征在于:所述PBST采用1000mL
中,含2.2g Na2HPO4.12H2O、0.2g KH2PO4、8.0g NaCl、0.2g KCl、0.2g NaN3,调节pH至7.3;加
0.5mLTween-20。

说明书

植物病理血清学测定方法

技术领域

本发明涉及生物检测领域,特别是指植物病理血清学测定方法。

背景技术

近年来,广东省部分烟草生产地区出现烟草畸形生长现象,大田表现为整块田发
生,却畸形症状整齐一致。广东烟区、湖南烟区及江西烟区相继出现烟叶畸形现象,且有进
一步扩展蔓延的趋势,严重影响烤烟的产量和质量以及烟农的经济收入。

解决烟草畸形生长的问题,首先要解决的,即是了解导致烟草畸形的原因,这需要
科学,准确,可靠的研究分析方法进行确定,在现有的一些测定方法中,如血清学测定方法,
一般为囊括范围?#27927;?#30340;统一性的测定方法,虽然具有一定的指导意义,但在对具体的种类
操作中,则可能会出现一定的差异,导致测定结果不准确,甚至不可行,而测定结果的不准,
直接对治理烟草畸形将产生非常大的影响,因此,如何针对烟草进一步提高检测的准确度,
如何根据烟草的特性进行测定方法的优化,成为解决问题的关键。

发明内容

本发明提出一种植物病理血清学测定方法,解决了现有技术中针对烟草畸形的病
因测定方法中,常规血清学测定方法针对性不强,导致结果不准的问题。

本发明的技术方案是这样实现的:植物病理血清学测定方法,包括以下步骤:

(1)取烟草畸形叶样品0.1g,用研杵捣碎,加入1mL的抗原包被缓冲液,转入离心管
中离心;

(2)加入200uL酶联板包被抗原,37℃下,2h;

(3)倒掉包被缓冲液,用PBST。洗板3次,每次3min;

(4)在不同酶标板上分别加入黄瓜花叶病毒、烟草花叶病毒、烟草曲叶病毒的抗血
清特异性IgG,每孔150ul,37℃,温育2h;

(5)倒掉溶液,用PBST。洗板3次,每次3min;

(6)加入酶标样抗兔IgG,每孔100ul,37℃下温育2h;

(7)倒掉溶液,用PBST。洗板3次,每次3min;

(8)加入底物浴液,每孔150ul,室温20~30min,每孔加1滴2mol/L的H2SO4终止反
应;

(9)用450型酶标仪测OD495值,重复三次。

进一步,所述包被缓冲液为采用每1000mL中含1.59g Na2CO3,2.93gNaHCO3,
0.2gNaN3,调节pH值至9.6,这些?#38382;?#30340;设置,为发明人根据血清学的检测理论,结合多年的
烟草种植经验,以及多次的实验结果,设定的适用于烟草血清学检测的被缓冲液。

进一步,所述PBST采用1000mL中,含2.2g Na2HPO4.12H2O、0.2g KH2PO4、8.0g NaCl、
0.2g KCl、0.2g NaN3,调节pH至7.3;加0.5mL Tween-20,同理所述PBST?#38382;?#30340;设定,也是根
据理论与实践的结合,以及反复的实验验证得到的最佳?#38382;?#35774;置。

本发明的所述植物病理血清学测定方法,在常规的血清学测定的基础上,结合烟
草种植与染病的实?#26159;?#20917;,进行了创新性的调整,使测定的过程,采用的实?#21097;问?#30340;控制
等,更加适合烟草染病原因的测定,提高了测定结果的准确性与可靠性。

具体实施方式

下面将结合本发明的实施例,对本发明实施例中的技术方?#38468;?#34892;清楚、完整地描
述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明
中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施
例,?#38469;?#20110;本发明保护的范围。

实施例1

广东?#20998;?#20116;华烟田进行植物病理血清学测定,过程如下:

(1)取烟草畸形叶样品0.1g,用研杵捣碎,加入1mL的抗原包被缓冲液(每1000mL中
含1.59g Na2CO3,2.93gNaHCO3,0.2g NaN3,调节pH值至9.6),转入1.5mL离心管中,2700g离
心;

(2)加入200uL酶联板包被抗原,37℃下,2h;

(3)倒掉包被缓冲液,用PBST(每1000mL中,含2.2g Na2HPO4.12H2O、0.2g KH2PO4、
8.0g NaCl、0.2g KCl、0.2g NaN3,调节pH至7.3;加0.5mL Tween-20)。洗板3次,每次3min;

(4)在不同酶标板上分别加入黄瓜花叶病毒、烟草花叶病毒、烟草曲叶病毒的抗血
清特异性IgG,每孔150ul,37℃,温育2h;

(5)倒掉溶液,用PBST(每1000mL中,含2.2g Na2HPO4.12H2O、0.2g KH2PO4、
8.0gNaCl、0.2g KCl、0.2g NaN3,调节pH至7.3;加0.5mL Tween-20)。洗板3次,每次3min;

(6)加入酶标样抗兔IgG,每孔100ul(工作浓度1:1000),37℃下温育2h;

(7)倒掉溶液,用PBST(每1000mL中,含2.2g Na2HPO4.12H2O、0.2g KH2PO4、
8.0gNaCl、0.2g KCl、0.2g NaN3,调节pH至7.3;加0.5mL Tween-20)。洗板3次,每次3min;

(8)加入底物浴液,每孔150ul,室温20~30min,每孔加1滴2mol/L的H2SO4终止反
应;

(9)用450型酶标仪测OD495值,重复三次。

测定结果:采用三?#26893;?#27602;(黄瓜花叶病毒、烟草花叶病毒、烟草曲叶病毒)的抗血清
对烟草畸形叶标样进行血清学测定实验。结果显示畸形叶标样的OD值与健康烟草标样的OD
值都在0.045~0.056间,二者之间没有超过2倍。这表明烟草畸形叶标样与上述三?#26893;?#27602;没
有血清学反应,即畸形叶标样体内?#32531;?#26377;上述三?#26893;?#27602;。

实施例2

河南内乡县烟田进行植物病理血清学测定,过程如下:

(1)取烟草畸形叶样品0.1g,用研杵捣碎,加入1mL的抗原包被缓冲液(每1000mL中
含1.59g Na2CO3,2.93gNaHCO3,0.2g NaN3,调节pH值至9.6),转入1.5mL离心管中,2700g离
心;

(2)加入200uL酶联板包被抗原,37℃下,2h;

(3)倒掉包被缓冲液,用PBST(每1000mL中,含2.2g Na2HPO4.12H2O、0.2g KH2PO4、
8.0g NaCl、0.2g KCl、0.2g NaN3,调节pH至7.3;加0.5mL Tween-20)。洗板3次,每次3min;

(4)在不同酶标板上分别加入黄瓜花叶病毒、烟草花叶病毒、烟草曲叶病毒的抗血
清特异性IgG,每孔150ul,37℃,温育2h;

(5)倒掉溶液,用PBST(每1000mL中,含2.2g Na2HPO4.12H2O、0.2g KH2PO4、
8.0gNaCl、0.2g KCl、0.2g NaN3,调节pH至7.3;加0.5mL Tween-20)。洗板3次,每次3min;

(6)加入酶标样抗兔IgG,每孔100ul(工作浓度1:1000),37℃下温育2h;

(7)倒掉溶液,用PBST(每1000mL中,含2.2g Na2HPO4.12H2O、0.2g KH2PO4、
8.0gNaCl、0.2g KCl、0.2g NaN3,调节pH至7.3;加0.5mL Tween-20)。洗板3次,每次3min;

(8)加入底物浴液,每孔150ul,室温20~30min,每孔加1滴2mol/L的H2SO4终止反
应;

(9)用450型酶标仪测OD495值,重复三次。

测定结果:采用三?#26893;?#27602;(黄瓜花叶病毒、烟草花叶病毒、烟草曲叶病毒)的抗血清
对烟草畸形叶标样进行血清学测定实验。结果显示畸形叶标样的OD值与健康烟草标样的OD
值都在0.086~0.103间,二者之间超过2倍。这表明烟草畸形叶标样与上述三?#26893;?#27602;有血清
学反应,即畸形叶标样体内含有上述三?#26893;?#27602;。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精
神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。

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