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用于测定活化部分促凝血酶原激酶时间的试剂、试剂盒及方法.pdf

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用于 测定 活化 部分 凝血酶原 激酶 时间 试剂 试剂盒 方法
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摘要
申请专利号:

CN201610786662.5

申请日:

2016.08.31

公开号:

CN106483305A

公开日:

2017.03.08

当前法律状态:

撤回

有效性:

无权

法?#19978;?#24773;: 发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):G01N 33/86申请公布日:20170308|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/86申请日:20160831|||公开
IPC分类号: G01N33/86; C12Q1/56 主分类号: G01N33/86
申请人: 希森美康株式会社
发明人: 吉田行辉; 井关藏吉; 熊野穰
地址: 日本兵库县
优?#28909;ǎ?/td> 2015.08.31 JP 2015-170786
专利代理机构: 中国国际贸易促进委员会专利商标事务所 11038 代理人: 郑天松
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法律状态
申请(专利)号:

CN201610786662.5

授权公告号:

||||||

法律状态公告日:

2018.08.28|||2017.04.05|||2017.03.08

法律状态类型:

发明专利申请公布后的视为撤回|||实质审查的生效|||公开

摘要

本发明提供下列技术方案:APTT测定用试剂,其含鞣花酸化合物、磷脂和聚乙烯醇化合物、APTT测定用试剂盒,其含有包含鞣花酸化合物、磷脂和聚乙烯醇化合物的第1试剂和含钙盐的第2试剂、以及APTT的测定法,其包括:将血液待测样品、鞣花酸化合物、磷脂和聚乙烯醇化合物混合而得到样品的第1混合工序;将第1混合工序中得到的样品和钙盐混合而得到测定样品的第2混合工序;及测定第2混合工序中得到的测定样品的APTT的工序。

权利要求书

1.活化部分促凝血酶原激酶时间测定用试剂,其含鞣花酸化合物、磷脂和聚乙烯醇化
合物。
2.权利要求1所述的试剂,其中所述聚乙烯醇化合物的皂化度是72~89mol%。
3.权利要求1所述的试剂,其中所述聚乙烯醇化合物的聚合度是300~500。
4.权利要求1所述的试剂,其中所述聚乙烯醇化合物的含量是0.025~0.2质量%。
5.权利要求1所述的试剂,其中每100质量份所述鞣花酸化合物的所述聚乙烯醇化合物
的量是10~50质量份。
6.权利要求1所述的试剂,其还含金属离?#26377;?#25104;化合物。
7.权利要求6所述的试剂,其中所述金属离?#26377;?#25104;化合物是
锌离?#26377;?#25104;化合物与铝离?#26377;?#25104;化合物的混合物,或
锰离?#26377;?#25104;化合物与铝离?#26377;?#25104;化合物的混合物。
8.权利要求1所述的试剂,其还含芳香族氨基酸化合物。
9.权利要求1所述的试剂,其中基本上不含有酚。
10.活化部分促凝血酶原激酶时间测定用试剂盒,其含:
第1试剂,其含鞣花酸化合物、磷脂和聚乙烯醇化合物,及
第2试剂,其含钙盐。
11.权利要求10所述的试剂盒,其中所述聚乙烯醇化合物的皂化度是72~89mol%。
12.权利要求10所述的试剂盒,其中基本上不含有酚。
13.活化部分促凝血酶原激酶时间的测定方法,其包括:
将血液待测样品、鞣花酸化合物、磷脂和聚乙烯醇化合物混合而得到样品的第1混合工
序;
将上述第1混合工序中得到的样品和钙盐混合而得到测定样品的第2混合工序;及
测定上述第2混合工序中得到的测定样品的活化部分促凝血酶原激酶时间的工序。
14.权利要求13所述的方法,其中所述聚乙烯醇化合物的皂化度是72~89mol%。
15.权利要求13所述的方法,其中所述聚乙烯醇化合物的聚合度是300~500。
16.权利要求13所述的方法,其中每100质量份所述鞣花酸化合物的所述聚乙烯醇化合
物的量是10~50质量份。
17.权利要求13所述的方法,其中还含金属离?#26377;?#25104;化合物。
18.权利要求17所述的方法,其中所述金属离?#26377;?#25104;化合物是
锌离?#26377;?#25104;化合物与铝离?#26377;?#25104;化合物的混合物,或
锰离?#26377;?#25104;化合物与铝离?#26377;?#25104;化合物的混合物。
19.权利要求13所述的方法,其中还含芳香族氨基酸化合物。
20.权利要求13所述的方法,其中基本上不含有酚。
21.下列试剂用于制造活化部分促凝血酶原激酶时间测定用试剂盒的用途:
第1试剂,其含鞣花酸化合物、磷脂和聚乙烯醇化合物、及
第2试剂,其含钙盐。

说明书

用于测定活化部分促凝血酶原激酶时间的试剂、试剂盒及方法

【技术领域】

本发明涉及活化部分促凝血酶原激酶时间测定用试剂、活化部分促凝血酶原激酶
时间测定用试剂盒及活化部分促凝血酶原激酶时间的测定方法。

【背景技术】

有含有作为凝固的活化剂的鞣花酸和作为抑制鞣花酸的沉淀的物质的酚的活化
部分促凝血酶原激酶时间(以下也称为“APTT”)测定用试剂。但是,由于对作为给环境造成
负担的物质的酚的使用的规定变?#24076;?#20174;而期望基本上不含有酚,抑制鞣花酸的沉淀的APTT
测定用试剂。作为这样的APTT测定用试剂,特开2013-205087号公报中记载的试剂被提议。
特开2013-205087号公报中记载的试剂含鞣花酸和作为抑制鞣花酸的沉淀的物质有芳香环
的氨基酸。

本发明提供在基本上不含酚的APTT测定用试剂中由新颖的方法抑制鞣花酸的沉
淀的APTT测定用试剂、含其的APTT测定用试剂盒、使用这些APTT的测定方法。

【发明内容】

本发明的范围仅由随附的权利要求定义,不受此发明概述部分的任何影响。

本发明提供以下技术方案。

(1)活化部分促凝血酶原激酶时间测定用试剂,其含鞣花酸化合物、磷脂和聚乙烯
醇化合物。

(2)(1)所述的试剂,其中所述聚乙烯醇化合物的皂化度是72~89mol%。

(3)(1)或(2)所述的试剂,其中所述聚乙烯醇化合物的聚合度是300~500。

(4)(1)~(3)之?#25105;?#39033;所述的试剂,其中所述聚乙烯醇化合物的含量是0.025~
0.2质量%。

(5)(1)~(4)之?#25105;?#39033;所述的试剂,其中上述鞣花酸化合物每100质量份的所述聚
乙烯醇化合物的量是10~50质量份。

(6)(1)~(5)之?#25105;?#39033;所述的试剂,其还含金属离?#26377;?#25104;化合物。

(7)(6)所述的试剂,其中上述金属离?#26377;?#25104;化合物是锌离?#26377;?#25104;化合物与铝离子
形成化合物的混合物或锰离?#26377;?#25104;化合物与铝离?#26377;?#25104;化合物的混合物。

(8)(1)~(7)之?#25105;?#39033;所述的试剂,其还含芳香族氨基酸化合物。

(9)(1)~(8)之?#25105;?#39033;所述的试剂,其基本上不含有酚。

(10)活化部分促凝血酶原激酶时间测定用试剂盒,其含:

含鞣花酸化合物、磷脂和聚乙烯醇化合物的第1试剂,及

含钙盐的第2试剂。

(11)(10)所述的试剂盒,其中所述聚乙烯醇化合物的皂化度是72~89mol%。

(12)(10)或(11)所述的试剂盒,其基本上不含有酚。

(13)活化部分促凝血酶原激酶时间的测定方法,其包括:

将血液待测样品、鞣花酸化合物、磷脂和聚乙烯醇化合物混合而得到样品的第1混
合工序;

将上述第1混合工序中得到的样品和钙盐混合而得到测定样品的第2混合工序;及

测定上述第2混合工序中得到的测定样品的活化部分促凝血酶原激酶时间的工
序。

(14)(13)所述的方法,其中所述聚乙烯醇化合物的皂化度是72~89mol%。

(15)(13)或(14)所述的方法,其中所述聚乙烯醇化合物的聚合度是300~500。

(16)(13)~(15)之?#25105;?#39033;所述的方法,其中上述鞣花酸化合物每100质量份的所
述聚乙烯醇化合物的量是10~50质量份。

(17)(13)~(16)之?#25105;?#39033;所述的方法,其还含金属离?#26377;?#25104;化合物。

(18)(17)所述的方法,其中上述金属离?#26377;?#25104;化合物是锌离?#26377;?#25104;化合物与铝离
?#26377;?#25104;化合物的混合物或锰离?#26377;?#25104;化合物与铝离?#26377;?#25104;化合物的混合物。

(19)(13)~(18)之?#25105;?#39033;所述的方法,其还含芳香族氨基酸化合物。

(20)(13)~(19)之?#25105;?#39033;所述的方法,其基本上不含有酚。

(21)含鞣花酸化合物、磷脂和聚乙烯醇化合物的第1试剂、及含钙盐的第2试剂用
于制造活化部分促凝血酶原激酶时间测定用试剂盒的用途。

【发明效果】

由本发明可提供在基本上不含有酚的APTT测定用试剂中由新颖的方法抑制鞣花
酸的沉淀的APTT测定用试剂、含其的APTT测定用试剂盒、使用这些APTT的测定方法。

【附图说明】

【图1】是APTT测定用试剂盒的构成图。

【图2】是在参考例1、2、比较例6及7中,显示研究APTT比的结果的坐标图。

【实施方式】

1.APTT测定用试剂

本实施方式涉及的APTT测定用试剂(以下,也简称为“试剂”)含鞣花酸化合物、磷
脂和聚乙烯醇化合物。在本实施方式涉及的试剂中,鞣花酸化合物、磷脂及聚乙烯醇化合物
通常是溶解于水系溶剂。

在本说明书中,“鞣花酸化合物”是指鞣花酸、鞣花酸的盐及鞣花酸的金属鳌合化
合物的总称。鞣花酸被知是与内源性凝固途径相关的接触因子的活化剂。作为接触因子,例
如,可举出前激肽释放酶、高分子激肽原、第XII因子、第XI因子等,但不特别限定。鞣花酸可
为天然来源的鞣花酸,?#37096;?#20026;合成的鞣花酸。作为鞣花酸的盐,例如,可举出鞣花酸的碱金
属盐等,但不特别限定。作为碱金属盐,例如,可举出钠盐、钾盐等,但不特别限定。鞣花酸通
过经配位键与金属离?#26377;?#25104;金属鳌合化合物,显示对于与内源性凝固途径相关的接触因子
强力的活化作用。从而,在本实施方式涉及的试剂中,鞣花酸化合物优选为鞣花酸的金属鳌
合化合物。金属离子优选为锌离子与铝离子的混合物及锰离子与铝离子的混合物。

本实施方式涉及的试剂中的鞣花酸化合物的量可根据APTT的测定条件等适宜确
定。本实施方式涉及的试剂中的鞣花酸化合物的量通常优选为0.01~0.5mM、更优选为0.05
~0.2mM。

在本实施方式涉及的试剂中,作为与内源性凝固途径相关的接触因子的活化剂,
?#37096;?#36824;含鞣花酸化合物以外的活化剂。作为涉及的活化剂,例如,可举出氧化硅、高岭土、硅
藻土(例如,硅藻土公司制、商品名:硅藻土(注册商标)等)等,但不特别限定。此时,本实施
方式涉及的试剂中的鞣花酸化合物与鞣花酸化合物以外的活化剂的合计量,自充分地确保
作为接触因子的活化剂的效果的观点来看,优选为0.05mM以上、更优选为0.1mM以上,自确
保良好的试剂灵敏度的观点来看,优选为0.2mM、更优选为0.11mM以下。

在本说明书中,“聚乙烯醇化合物”是指聚乙烯醇及其衍生物的总称。另外,在本说
明书中,“聚乙烯醇的衍生物”是指在聚乙烯醇的侧链有修饰基的化合物。修饰基是不妨碍
由聚乙烯醇的鞣花酸的分散能力的官能团即可。作为修饰基,例如,可举出甲基、乙基、丙基
等的碳原子数1~3的烷基等,但不特别限定。

聚乙烯醇化合物的皂化度,自充分地确保?#36816;?#31995;溶剂的溶解性的观点来看,优选
为72mol%以上、更优选为78mol%以上,经更长期间抑制沉淀的发生,自使长期保存稳定性
提高的观点来看,优选为89mol%以下,更优选为80mol%以下。其中,聚乙烯醇化合物的皂
化度是通过基于JIS K6726-1994中规定的聚乙烯醇试验方法算出而求出的值。

聚乙烯醇化合物的聚合度,自充分地确保分散效果的观点来看,优选为200以上、
更优选为300以上,自抑制粘性增加的观点来看,优选为500以下,更优选为400以下。

鞣花酸有难以溶解于以往的APTT测定用试剂中使用的水系溶剂、容易发生沉淀的
性质。当发生鞣花酸的沉淀时,凝固?#20174;?#31995;统中的鞣花酸不足,凝固?#20174;?#30340;进行变迟。因此,
有凝固时间过度延长的情况。从而,以往的APTT测定用试剂通过作为鞣花酸的沉淀防止剂
配合酚,抑制鞣花酸的沉淀。但是,自对环境的负担的?#26723;?#30340;观点来看,期望避免使用酚。与
此相比,在本实施方式涉及的试剂中,可由聚乙烯醇化合物防止鞣花酸的沉淀。因此,本实
施方式涉及的试剂?#37096;?#22522;本上不含有酚。即,本实施方式涉及的试剂是含鞣花酸化合物和
作为鞣花酸化合物的沉淀防止剂的聚乙烯醇化合物,但基本上不含有酚的试剂。其中,“基
本上不含有酚”是指未向本实施方式涉及的试剂?#23435;?#37197;合酚,用惯用的检测手段不能检测。

本实施方式涉及的试剂中的聚乙烯醇化合物的含量,自抑制沉淀的发生的观点来
看,优选为0.025质量%以上、更优选为0.05质量%以上,自抑制粘性的增加的观点来看,优
选为0.2质量%以下,更优选为0.1质量%以下。鞣花酸每100质量份的聚乙烯醇化合物的
量,自确保充分的分散效力的观点来看,优选为10质量份以上、更优选为15质量份以上,自
确保充分的分散效力的观点来看,优选为50质量份以下,更优选为40质量份以下。

磷脂促进血液的凝固?#20174;Α?#30967;脂是在分子结构中有磷酸酯部位的脂质。磷脂可为
天然来源磷脂,可为合成磷脂。作为天然来源磷脂,例如,可举出兔、牛、猪、鸡、人等的动物、
大豆等的植物来源的磷脂等,但不特别限定。作为动物来源的磷脂,例如,可举出兔脑、牛
脑、卵黄、人胎盘等来源的磷脂等,但不特别限定。作为磷脂,具体而言,例如,可举出磷脂酰
乙?#21450;貳?#30967;脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰?#35270;?#31561;,但不特别限定。在这些磷脂之中,由于
血液的凝固?#20174;?#26377;效?#23454;?#36827;行,优选为磷脂酰乙?#21450;貳?#30967;脂酰胆碱及磷脂酰丝氨酸。这些磷
脂可单独使用,?#37096;?#23558;2种以上混合而使用。作为磷脂所具有的脂肪酸侧链,例如,可举出棕
榈酰基、油酰基、硬脂酰基等,但不特别限定。这些脂肪酸侧链可在不妨碍血液的凝固?#20174;?br />的范围内适宜选择。

本实施方式涉及的试剂中的磷脂的量可根据磷脂的种类、APTT的测定条件等适宜
确定。本实施方式涉及的试剂中的磷脂的量,通常,优选为30~2000μg/mL、更优选为100~
600μg/mL。磷脂是磷脂酰乙?#21450;?#26102;,本实施方式涉及的试剂中的磷脂的量,通常,优选为10
~700μg/mL、更优选为30~300μg/mL。磷脂是磷脂酰胆碱时,本实施方式涉及的试剂中的磷
脂的量通常是,优选为20~1000μg/mL、更优选为30~500μg/mL。磷脂是磷脂酰丝氨酸时,本
实施方式涉及的试剂中的磷脂的浓度通常是,优选为3~300μg/mL、更优选为5~150μg/mL。
磷脂是磷脂酰?#35270;?#26102;,本实施方式涉及的试剂中的磷脂的量通常是,优选为3~300μg/mL、
更优选为5~150μg/mL。

水系溶剂可自在血液凝固性的临?#24067;?#26597;中通常使用的水系溶剂适宜选择。作为水
系溶剂,例如,可举出水、生理盐水等,但不特别限定。

本实施方式涉及的试剂的pH优选为6~8、更优选为7~7.6。本实施方式涉及的试
剂的pH可由APTT测定用试剂中通常使用的缓冲液成分适?#35828;?#25972;。缓冲液成分优选为在pH5
~9、优选为pH6~8的范围有缓冲作用的缓冲液成分。作为缓冲液成分,例如,可举出2-[4-
(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸(HEPES)、2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇(Tris)、3-吗啉代
丙磺酸(MOPS)等,但不特别限定。

本实施方式涉及的试剂优选为还含金属离?#26377;?#25104;化合物。金属离?#26377;?#25104;化合物是
在本实施方式涉及的试剂中形成金属离子的化合物即可。当本实施方式涉及的试剂作为防
腐剂含氨基糖苷系抗生物质时,金属离?#26377;?#25104;化合物优选为选自锌离?#26377;?#25104;化合物、锰离
?#26377;?#25104;化合物及铝离?#26377;?#25104;化合物的?#25105;?#30340;组合。就是在其中,锌离?#26377;?#25104;化合物与铝离
?#26377;?#25104;化合物的混合物、及锰离?#26377;?#25104;化合物与铝离?#26377;?#25104;化合物的混合物,在从有效抑
制由氨基糖苷系抗生物?#23454;?#33268;的凝固时间的过度的延长的观点是优选的。作为锌离?#26377;?#25104;
化合物,例如,可举出氯化?#24247;?#30340;卤化?#24247;齲?#20294;不特别限定。作为锰离?#26377;?#25104;化合物,例如,
可举出氯化锰等的卤化锰等,但不特别限定。作为铝离?#26377;?#25104;化合物,例如,可举出氯化铝
等的卤化铝等,但不特别限定。

本实施方式涉及的试剂中的金属离?#26377;?#25104;化合物的量通常是,自使接触因子的活
化作用提高的观点来看,优选为1μM以上、更优选为10μM以上,自抑制沉淀物的发生的观点
来看,优选为1mM以下,更优选为500μM以下。本实施方式涉及的试剂中的金属离?#26377;?#25104;化合
物是锌离?#26377;?#25104;化合物与铝离?#26377;?#25104;化合物的混合物、或者锰离?#26377;?#25104;化合物与铝离?#26377;?br />成化合物的混合物时,本实施方式涉及的试剂中的金属离?#26377;?#25104;化合物的量,自有效抑制
由氨基糖苷系抗生物?#23454;?#33268;的凝固时间的过度的延长的观点来看,优选为10~500μM。

本实施方式涉及的试剂优选为还含芳香族氨基酸化合物。此时,可由芳香族氨基
酸化合物更有效抑制鞣花酸化合物的沉淀。在本说明书中,“芳香族氨基酸化合物”是指芳
香族氨基酸、及芳香族氨基酸的衍生物的总称。芳香族氨基酸是侧链上有芳香环的氨基酸。
作为芳香环,例如,可举出?#20132;貳?#31264;环?#20132;貳?#38750;苯芳香环、芳香杂环等,但不特别限定。芳香族
氨基酸化合物中的芳香环的数可为1个,?#37096;?#20026;多个。在芳香族氨基酸化合物有多个芳香环
时,多个芳香环?#19978;?#21516;,可互相不同。芳香族氨基酸是α-氨基酸。芳香族氨基酸优选为选自
在蛋白质中发现的种类的氨基酸及其衍生物的至少1种。作为芳香族氨基酸,例如,可举出
苯丙氨酸、?#37326;?#37240;、色氨酸、组氨酸等,但不特别限定。芳香族氨基酸的衍生物是指芳香族氨
基酸中所含的芳香?#20998;?#30340;氢原子或羟基进一步?#25105;?#22320;被适宜的取代基取代的化合物。取代
基是不妨碍血液凝固?#20174;?#21450;鞣花酸的增溶或分散化的取代基即可。在芳香族氨基酸化合物
之中,优选为苯丙氨酸及?#37326;?#37240;,更优选为苯丙氨酸。再者,芳香族氨基酸化合物可为L-体、
D-体及它们的混合物的任何。另外,芳香族氨基酸化合物可为天然来源的化合物,可为合成
的化合物。

本实施方式涉及的试剂中的芳香族氨基酸化合物的量可根据芳香族氨基酸化合
物的种类、本实施方式涉及的试剂中所含的鞣花酸化合物的量等适宜确定。本实施方式涉
及的试剂中的芳香族氨基酸化合物的量通常是,从充分地确保分散效力的观点来看,优选
为0.001w/v%以上、更优选为0.01w/v%以上,自确保?#36816;?#31995;溶剂的充分的溶解性的观点来
看,优选为10w/v%以下,更优选为1.0w/v%以下。

本实施方式涉及的试剂?#37096;?#36824;含添加剂。作为添加剂,例如,可举出防腐剂、抗氧
化剂、稳定化剂等,但不特别限定。作为防腐剂,例如,可举出氨基糖苷系抗生物?#23454;?#30340;抗生
物质、叠氮化钠等,但不特别限定。作为抗氧化剂,例如,可举出3-t-丁基-4-羟基苯甲醚等,
但不特别限定。作为稳定化剂,例如,可举出聚乙二醇、聚乙烯基?#37327;?#28919;酮等,但不特别限
定。

本实施方式涉及的试剂,例如,可通过将水系溶剂、磷脂及聚乙烯醇化合物和鞣花
酸化合物混合,将得到的混合物的pH调整到适宜的pH等来制造。再者,向得到的试剂,根据
需要,?#37096;苫固?#21152;金属离?#26377;?#25104;化合物、芳香族氨基酸化合物、添加剂等。

本实施方式涉及的试剂,在一般的APTT的测定条件下,与钙盐的溶液一同适?#35828;?br />使用时,可得到与以往的APTT测定用试剂同程度的测定结果。更具体而言,使用本实施方式
涉及的试剂,测定指定的正常血浆〔例如,Sysmex(株)制的商品名:CoagtrolIX〕的APTT时,
优选为APTT处于25~35秒钟的范围内。另外,测定指定的异常血浆〔例如,Sysmex(株)制、商
品名:CoagtrolIIX〕的APTT时,优选为APTT处于60~100秒钟的范围内。

本实施方式涉及的试剂可在APTT的测定及LA的检测中适?#35828;?#20351;用。本实施方式涉
及的试剂的使用方法与以往的APTT测定用试剂同样。

2.APTT测定用试剂盒

本实施方式涉及的APTT测定用试剂盒(以下,也简称为“试剂盒”)的特征在于含:
含鞣花酸化合物、磷脂和聚乙烯醇化合物的第1试剂,和含钙盐的第2试剂。

作为本实施方式涉及的试剂盒的一例,可举出图1所示的试剂盒10等,但不特别限
定。图1所示的试剂盒10含第1试剂容器11和第2试剂容器12。第1试剂容器11收容含鞣花酸
化合物、磷脂和聚乙烯醇化合物的第1试剂。第2试剂容器12收容含钙盐的第2试剂。本实施
方式涉及的试剂盒?#37096;?#36824;含附带文书。附带文书?#37096;?#21547;使用本实施方式涉及的试剂盒进行
APTT的测定的操作顺序等的记载。

在第1试剂中使用的鞣花酸化合物、磷脂及聚乙烯醇化合物是与前述的本实施方
式涉及的APTT测定用试剂中使用的鞣花酸、磷脂及聚乙烯醇化合物同样。另外,第1试剂中
的鞣花酸化合物、磷脂及聚乙烯醇化合物各自的量是与前述的本实施方式涉及的APTT试剂
中的鞣花酸、磷脂及聚乙烯醇化合物各自的量同样。第1试剂?#37096;?#36866;?#35828;?#21547;水系溶剂、添加
剂等。水系溶剂及添加剂是与前述的本实施方式涉及的APTT测定用试剂中使用的水系溶剂
及添加剂同样。第1试剂是优选为前述的本实施方式涉及的APTT测定用试剂。

再者,在本实施方式涉及的试剂盒中,鞣花酸化合物、磷脂及聚乙烯醇化合物?#37096;?br />被收容到不同的容器中。此时,可通过将收容到不同的容器的鞣花酸化合物、磷脂及聚乙烯
醇化合物各自在使用时混合来调制第1试剂。

第2试剂含钙盐。钙盐是在测定APTT时使用的测定样?#20998;行?#25104;钙离子的盐即可。作
为钙盐,可举出氯化钙、硫酸钙、亚硝酸钙、碳酸钙、乳酸钙、酒石酸钙等,但不特别限定。这
些钙盐可单独使用,?#37096;?#23558;2种以上混合而使用。第2试剂中的钙盐的量优选为2.5~40mM、
更优选为10~30mM。第2试剂?#37096;?#36866;?#35828;?#21547;水系溶剂、添加剂等。水系溶剂及添加剂是与前
述的本实施方式涉及的APTT测定用试剂中使用的水系溶剂及添加剂同样。

本实施方式涉及的试剂盒?#37096;?#26681;据需要,还含稀释用的水系溶剂、对照血浆等。水
系溶剂与前述的本实施方式涉及的APTT测定用试剂中使用的水系溶剂同样。作为对照血
浆,例如,可举出正常血浆、精度管理用血浆、缺乏各种凝血因子的血浆、LA阳性血浆等,但
不特别限定。作为精度管理用血浆,例如,可举出Sysmex(株)制的商品名:CoagtrolIX、
Sysmex(株)制的商品名:CoagtrolIIX等,但不特别限定。

使用本实施方式涉及的试剂盒,例如,检测LA时,可用稀释用的水系溶剂将第1试
剂稀释至期望的稀释?#21097;?#35843;制磷脂浓度互相不同的2种第1试剂。

本实施方式涉及的试剂盒可在APTT的测定及LA的检测中适?#35828;?#20351;用。本实施方式
涉及的试剂盒的使用方法与以往的APTT测定用试剂盒同样。

3.APTT的测定方法

本实施方式涉及的APTT的测定方法(以下,也简称为“测定方法”)的特征在于包
括:将血液待测样品、鞣花酸化合物、磷脂和聚乙烯醇化合物混合而得到样品的第1混合工
序;将上述第1混合工序中得到的样品和钙盐混合而得到测定样品的第2混合工序;及测定
上述第2混合工序中得到的测定样品的APTT的工序。由本实施方式涉及的测定方法即使在
使用含第IX因子的血液待测样品时?#37096;?#20197;充分的灵敏度测定APTT。

再者,在本说明书中,“样品”是指血液待测样品、鞣花酸化合物、磷脂和聚乙烯醇
化合物的混合物。另外,“测定样品”是指血液待测样品、鞣花酸化合物、磷脂、聚乙烯醇化合
物和钙盐的混合物。

在第1混合工序中,将血液待测样品、鞣花酸化合物、磷脂和聚乙烯醇化合物混合
而得到样品。再者,在第1混合工序之前,?#37096;?#23558;血液待测样品加温到对于进行凝固?#20174;?#36866;
宜的温度。此时,血液待测样品的加温温度,通常优选为30~45℃、更优选为36~38℃。

作为血液待测样品,例如,可举出血液、自血液得到的血浆等,但不特别限定。在本
实施方式涉及的测定方法中,作为血液待测样品,可使用自被检者的血液得到的血浆、前述
的对照血浆及它们的混合物等。就血浆而言,例如,通过不使血液溶血地进行离心分离而血
除去细胞成分等而得到。另外,?#37096;?#22312;血液中添加在血液凝固性的临?#24067;?#26597;中通常使用的
公知的抗凝固剂。作为抗凝固剂,例如,可举出柠檬酸钠等,但不特别限定。在本实施方式涉
及的测定方法中,作为对照血浆,可使用正常血浆、精度管理用血浆、缺乏各种的凝血因子
的血浆、LA阳性血浆等。正常血浆可为自健康者的血液得到的血浆,可为市售的正常血浆。

在将LA的检测作为目的时,作为血液待测样品,优选还使用有存在LA的可能性的
血浆与正常血浆的混合物。在被检者缺损凝血因子时,通过被检者的血浆与正常血浆的混
合而防止凝固时间的延长,检查的灵敏度提高。再者,被验血浆/正常血浆(体积比),通常,
优选为8/2~2/8、特别优选为5/5。

在第1混合工序中,血液待测样品、鞣花酸化合物、磷脂与聚乙烯醇化合物的混合
的顺序不特别限定。

在第1混合工序中,与血液待测样品混合的鞣花酸化合物的量是测定样?#20998;?#30340;鞣
花酸化合物的浓度达指定浓度的量即可。测定样?#20998;?#30340;鞣花酸化合物的浓度,通常,优选为
3.5~150μM、更优选为10~50μM。

与血液待测样品混合的磷脂的量是测定样?#20998;?#30340;磷脂的浓度达指定浓度的量即
可。测定样?#20998;?#30340;磷脂的浓度可根据磷脂的种类适宜设定。磷脂是磷脂酰乙?#21450;?#26102;,测定样
?#20998;?#30340;磷脂的浓度,通常,优选为1~150μg/mL、更优选为5~50μg/mL。磷脂是磷脂酰胆碱
时,测定样?#20998;?#30340;磷脂的浓度,通常,优选为1~100μg/mL、更优选为5~80μg/mL。磷脂是磷
脂酰丝氨酸时,测定样?#20998;?#30340;磷脂的浓度,通常,优选为0.1~50μg/mL、更优选为1~10μg/
mL。磷脂是磷脂酰二醇时,测定样?#20998;?#30340;磷脂的浓度,通常,优选为0.1~50μg/mL、更优选为
1~10μg/mL。磷脂是2种以上的磷脂的混合物时,测定样?#20998;?#30340;各磷脂的浓度的合计,通常,
优选为5~400μg/mL、更优选为20~100μg/mL。

再者,在第1混合工序中,代替分别使用鞣花酸化合物、磷脂和聚乙烯醇化合物,可
使用前述的本实施方式涉及的APTT测定用试剂或前述的本实施方式涉及的APTT测定用试
剂盒的第1试剂。再者,将LA的检测作为目的时,优选为稀释APTT测定用试剂或第1试剂而调
制有互相不同的磷脂浓度的2种APTT测定用试剂或第1试剂而使用。在血液待测样品与APTT
测定用试剂或第1试剂混合时,[血液待测样品]/[APTT测定用试剂或第1试剂](体积比),通
常,优选为8/2~2/8、更优选为6/4~4/6、特别优选为5/5。

第1混合工序中的加温温度是对于进行血液的凝固?#20174;?#36866;宜的温度即可。加温温
度,通常,优选为25~45℃、更优选为35~38℃。另外,加温时间,通常,优选为1~10分钟、更
优选为3~5分钟。

在第2混合工序中,将第1混合工序中得到的样品和钙盐混合而调制测定样品,测
定测定样品的APTT。

在第2混合工序中,在向样品添加钙盐之前,?#37096;?#23558;样品加温到对于进行凝固?#20174;?br />适宜的温度。样品的加温温度,从凝固?#20174;?#30340;?#20174;?#24615;的观点来看,优选为30℃以上、更优选
为36℃以上,自蛋白质的稳定性的观点来看,优选为45℃以下,更优选为38℃以下。此时,加
温时间,从凝固?#20174;?#30340;?#20174;?#24615;的观点来看,优选为1分钟以上、更优选为2分钟以上,自蛋白
质的稳定性的观点来看,优选为6分钟以下,更优选为5分钟以下。

与样品混合的钙盐的量是测定样?#20998;?#30340;钙盐的浓度达指定浓度的量即可。测定样
?#20998;?#30340;钙盐的浓度优选为2~20mM、更优选为4~10mM。

再者,在第2混合工序中,作为钙盐,可使用前述的本实施方式涉及的试剂盒的第2
试剂。在第1混合工序中得到的样品与第2试剂混合时,血液待测样品/第2试剂(体积比),通
常,优选为8/2~5/5、更优选为7/3~6/4、特别优选为2/1。

第2混合工序中的加温温度是与第1混合工序中的加温温度同样。

测定样品的APTT可基于凝固信息研究。作为凝固信息,例如,可举出向测定样品照
射光时的透射光或散射光的变化、测定样品的粘度的变化等,但不特别限定。此时,测定样
品的APTT可通过向测定样品照射光,监测来自透过测定样品的透射光或测定样品的散射光
的变化,监测测定样品的粘度的变化等而研究。在APTT的测定中,使用在一般的APTT的测定
中使用的测定装置。作为测定装置,例如,可举出具备光学信息检测部的市售的血液凝固测
定装置等,但不特别限定。作为测定装置的具体例,可举出Sysmex(株)制的商品名:CS-
2000i、商品名:CS-2100i等。再者,在本说明书中,APTT是自向在第1混合工序中得到的样品
的钙盐的添加开始时起至血浆凝固的时间。血浆的凝固,例如,可以来自照射光的测定样品
的光的变化消失、测定样品的粘度的变化消失等作为指标判?#31232;?br />

将LA的检测作为目的时,优选分别对于检查对象的血浆(以下也称为?#27688;?#26816;血浆”)
及正常血浆使用APTT测定用试剂及稀释其的试剂和钙盐。另外,LA的检测优选比较基于各
自使用APTT测定用试剂及稀释其的试剂、从被检血浆得到的APTT而得到的值和阈?#25285;?#22522;于
比较结果进行。再者,?#37096;?#20195;替使用APTT测定用试剂而使用APTT测定用试剂盒的第1试剂。

作为阈?#25285;?#20363;如,使用相对于正常血浆的APTT的被检血浆的APTT之比等。作为阈值
的具体例,可举出狼疮比(以下也称为“LR值”)、Rosner指数等,但不特别限定。

其中,LR值是指根据式(I):

[LR值]=(b/a)/(d/c)=bc/ad (I)

(式中,a表示使用被检血浆和第1试剂而得到的APTT、b表示使用被检血浆和稀释
的APTT测定用试剂而得到的APTT、c表示使用正常血浆和APTT测定用试剂而得到的APTT、d
表示使用正常血浆和稀释的APTT测定用试剂而得到的APTT)

算出的值。正常血浆的情况,LR值是1左右。另外,来源于血液凝血因子缺损患者、
华法?#36136;?#29992;患者或肝素施用患者的血浆的情况,LR值成为1左右。与此相比,来源于LA阳性
患者的血浆的情况,LR?#24403;?大。从而,从被检血浆的LR值与正常血浆的LR值的比较结果,可
检测被检血浆中的LA。

【实施例】

在下文中,各缩?#26434;?#30340;含意如下所述。再者,“重量平均分子量”是由凝胶渗透层析
法求出的值。

<缩?#26434;?gt;

PVA:聚乙烯醇

HEPES:2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸

Tris:2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇

PVP:聚乙烯基?#37327;?#28919;酮(岸田化学(株)制、聚乙烯基?#37327;?#28919;酮K-30)

PEG6000:聚乙二醇6000(重量平均分子量:7300~9300)

PE:磷脂酰乙?#21450;?br />

PC:磷脂酰胆碱

PS:磷脂酰丝氨酸

PG:磷脂酰?#35270;?br />

BHA:3-t-丁基-4-羟基苯甲醚

另外,在下文中,使用的聚乙烯醇的特性如表1所示。

【表1】



(实施例1~12及比较例1)

将表2所示的缓冲液成分、活化剂、金属离?#26377;?#25104;化合物、聚乙烯醇化合物、添加剂
及水混合成表2所示的组成,得到不含有酚的试剂(实施例1~12)。另外,将表2所示的缓冲
液成分、活化剂、金属离?#26377;?#25104;化合物、添加剂及水混合至表2所示的组成而得到试剂(比较
例1)。

【表2】



将实施例1~12及比较例1的试剂各自于60℃保存。通过用肉眼观察自保存开?#35745;?br />经过6天时及经过12天时沉淀的有无,评价实施例1~12及比较例1的试剂各自的长期保存
稳定性。结果示于表3。再者,长期保存稳定性的评价基准如下所述。

<评价基准>

AA:经过12天时观察不到沉淀,有优良的长期保存稳定性

A:经过6天时观察不到沉淀,有良好的长期保存稳定性

NG:经过6天时观察到沉淀,无长期保存稳定性

【表3】



从表3所示的结果知,在用含鞣花酸和聚乙烯醇化合物的实施例1~12的试剂时,
在自保存开?#35745;?#32463;过6天时,观察不到沉淀。从而得知,实施例1~12的试剂有良好的长期保
存稳定性。另外,在用含皂化度是72~89的聚乙烯醇化合物的实施例5~12中得到的试剂
时,在自保存开?#35745;?2天经过时,观察不到沉淀。从而得知,实施例5~12的试剂有优良的长
期保存稳定性。一方面,在用不含聚乙烯醇化合物的比较例1的试剂时,在自保存开?#35745;?天
经过时观察到沉淀。

这些结果提示,通过向含鞣花酸的APTT测定用试剂还配合聚乙烯醇化合物,可抑
制长期保存时的沉淀的发生。另外得知,从长期保存时的稳定性的方面来看,聚乙烯醇化合
物的皂化度优选为72~89。

(实施例13~15及比较例2)

(1)试剂的调制及热处理

将表4所示的缓冲液成分、活化剂、金属离?#26377;?#25104;化合物、磷脂、聚乙烯醇化合物、
添加剂及水混合成表4所示的组成,得到不含有酚的试剂(实施例13~15)。另外,将表4所示
的缓冲液成分、活化剂、金属离?#26377;?#25104;化合物、磷脂、添加剂及水混合成表4所示的组成而得
到试剂(比较例2)。将得到的试剂于45℃保存2周。

【表4】



(2)APTT的测定

将被检血浆50μL于30℃加温1分钟。接下来,将加温后的被验血浆和第1试剂50μL
混合。将得到的混合物于37℃加温3分钟。将加温后的混合物和第2试剂50μL混合,使用全自
动血液凝固分析装置〔Sysmex(株)制、商品名:CS-2100i〕测定APTT。再者,作为被检血浆,使
用正常血浆〔Sysmex(株)制的商品名:CoagtrolIX〕、正常血浆〔Precision BioLogic
Incorporated制、商品名:CRYOcheck Normal Reference Plasma〕、异常血浆〔Sysmex(株)
制的商品名:CoagtrolIIX〕、肝素添加血浆〔Precision BioLogic Incorporated制、商品
名:CRYOcheck Heparin Control〕或阳性对照〔Precision BioLogic Incorporated制、商
品名:CRYOcheck Lupus Positive Control〕。另外,作为第1试剂,使用实施例13、14、15或
比较例2的试剂。作为第2试剂,使用25mM氯化钙水溶液。APTT的测定对于各被检血浆各进行
2次。结果示于表5。

【表5】



异常血浆〔Sysmex(株)制的商品名:CoagtrolIIX〕及肝素添加血浆〔Precision
BioLogic Incorporated制、商品名:CRYOcheck Heparin Control〕各自的APTT的规格范围
通常是60~100秒钟。从表5所示的结果得知,在使用实施例13~15中得到的试剂时,异常血
浆〔Sysmex(株)制的商品名:CoagtrolIIX〕及肝素添加血浆〔Precision BioLogic
Incorporated制、商品名:CRYOcheck Heparin Control〕各自的APTT与通常的APTT的规格
范围同样地是60~100秒钟。另外,含聚乙烯醇化合物的试剂抑制用不含聚乙烯醇化合物的
试剂(比较例2)确认的异常血浆的APTT的缩短及鞣花酸的沉淀。再者,通过对于规格范围内
的APTT,得知使用一般的异常域对照样品(异常血浆)凝固时间测定时的精度管理是可能
的。另外得知,在鞣花酸的沉淀和异常血浆的APTT的缩短现象之间有因果关系。从而,从这
些结果得知,实施例13~15中得到的试剂在实施热处理时?#37096;?#30830;保充分的灵敏度,并?#39029;?br />期保存稳定性优良。

(实施例16、比较例3~5)

(1)试剂调制

将表6所示的缓冲液成分、活化剂、金属离?#26377;?#25104;化合物、磷脂、聚乙烯醇化合物、
添加剂及水混合成表6所示的组成,得到不含有酚的试剂(实施例16)。另外,将表6所示的缓
冲液成分、活化剂、金属离?#26377;?#25104;化合物、磷脂、添加剂及水混合成表6所示的组成而得到试
剂(比较例3)。

【表6】



将市售的APTT测定用试剂〔Siemens Healthcare Diagnostics制、商品名:ACTIN-
FS〕作为比较例4的试剂使用,将市售的APTT测定用试剂〔Siemens Healthcare
Diagnostics制、商品名:ACTIN-FSL〕作为比较例5的试剂使用。

(2)APTT的基准范围的测定

将被检血浆50μL于30℃加温1分钟。接下来,将加温后的被验血浆和第1试剂50μL
混合。将得到的混合物于37℃加温3分钟。将加温后的混合物和第2试剂50μL混合,使用全自
动血液凝固分析装置〔Sysmex(株)制、商品名:CS-2100i〕测定APTT。再者,作为被检血浆,使
用正常血浆49个待测样品。另外,作为第1试剂,使用实施例16、比较例3、4或5的试剂。作为
第2试剂,使用25mM氯化钙水溶液。APTT的测定对于各被检血浆各进行1次。自APTT的测定值
求出平均值、SD、基准范围上限及基准范围下限。结果示于表7。

【表7】


实施例16(sec)
比较例3(sec)
比较例4(sec)
比较例5(sec)
平均值
28.4
27.5
24.5
25.0
SD
1.7
1.5
1.5
1.6
基准范围下限(平均值-2.01SD)
25.0
24.4
21.6
21.8
基准范围上限(平均值+2.01SD)
31.8
30.5
27.4
28.2

(3)第IX因子灵敏度试验

将正常血浆〔Precision BioLogic Incorporated制、商品名:CRYOcheck Normal
Reference Plasma〕和IX因子缺乏血浆〔Sysmex国际试剂(株)制、商品名:第IX因子缺乏血
浆〕混合成正常血浆/IX因子缺乏血浆(体积比)达3/7而得到被检血浆。

将被检血浆50μL于30℃加温1分钟。接下来,将加温后的被验血浆和第1试剂50μL
混合。将得到的混合物于37℃加温3分钟。将加温后的混合物和第2试剂50μL混合,使用全自
动血液凝固分析装置〔Sysmex(株)制、商品名:CS-2100i〕测定APTT。再者,作为第1试剂,使
用实施例16、比较例3、4或5的试剂。作为第2试剂,使用25mM氯化钙水溶液。APTT的测定对于
各被检血浆各进行5次。自APTT的测定值求出APTT的平均值及APTT的平均值与平均基准范
围上限的差。APTT的平均值与平均基准范围上限的差根据式(II):

[APTT的平均值与平均基准范围上限的差]=[平均基准范围上限]-[APTT的平均
值] (II)

求出。结果示于表8。

【表8】


实施例16(sec)
比较例3(sec)
比较例4(sec)
比较例5(sec)
APTT的平均值
32.9
29.9
27.8
26.5
与基准范围上限的差
1.14
-0.63
0.36
-1.73

从表8所示的结果得知,使用含鞣花酸和聚乙烯醇化合物的实施例16的试剂时,测
定的APTT的平均?#24403;?#22522;准范围上限大。另外得知,实施例16的试剂中得到的APTT的平均值
与基准范围上限的差比比较例4的试剂中得到的APTT的平均值与基准范围上限的差大。另
一方面得知,在用不含聚乙烯醇化合物的比较例3及5的试剂时,测定的APTT的平均?#24403;?#22522;
准范围上限小。认为APTT的平均?#24403;?#22522;准范围上限大表明可区分正常待测样品和第IX因子
7成缺损的待测样品。从而得知,由含鞣花酸和聚乙烯醇化合物的APTT测定用试剂可以高灵
敏度检测IX因子。

(参考例1、2、比较例6及7)

将表9所示的缓冲液成分、活化剂、金属离?#26377;?#25104;化合物、磷脂、添加剂及水混合成
表9所示的组成,得到不含有酚的试剂(参考例1及2)。参考例1的试剂是配合了作为锌离子
形成化合物的氯化锌和作为铝离?#26377;?#25104;化合物的氯化铝。另外,参考例2的试剂是配合了作
为锰离?#26377;?#25104;化合物的氯化锰和作为铝离?#26377;?#25104;化合物的氯化铝。

【表9】



将含铜离?#26377;?#25104;化合物和?#21015;?#25104;化合物的市售的APTT测定用试剂〔Sysmex(株)
制、商品名:ThromboCheckAPTT-SLA〕作为比较例6的试剂使用,将含铜离?#26377;?#25104;化合物的市
售的APTT测定用试剂〔Sysmex(株)制、商品名:ThromboCheckAPTT〕作为比较例7的试剂使
用。

将被检血浆50μL于30℃加温1分钟。接下来,将加温后的被验血浆和第1试剂50μL
混合。将得到的混合物于37℃加温3分钟。将加温后的混合物和第2试剂50μL混合,使用全自
动血液凝固分析装置〔Sysmex(株)制、商品名:CS-2100i〕测定APTT。再者,作为被检血浆使
用被检血浆A〔Sysmex(株)制、商品名:CoagtrolI〕、或者被检血浆B〔Sysmex(株)制的商品
名?#21512;駽oagtrolI添加妥布霉素至其浓度成10μg/mL而得到的混合物〕。另外,作为第1试剂,
使用参考例1、2、比较例6或7的试剂。作为第2试剂,使用25mM氯化钙水溶液。自APTT的测定
?#25285;?#26681;据式(III):

[APTT比]=[被检血浆B的APTT]/[被检血浆A的APTT](III)

算出APTT比。将APTT的测定值示于表10、APTT比示于图2。

【表10】


参考例1
参考例2
比较例6
比较例7
被检血浆A的APTT(sec)
28.9
29.1
25.9
26.5
被检血浆B的APTT(sec)
31.8
32.1
31.5
66.7

从表10及图2所示的结果知,在用参考例1及2的试剂时,APTT比是1.1。与此相比,
在用比较例6及7的试剂时,APTT比是1.2~2.5。APTT比的容许范围通常是1.2。自这些结果
得知,由参考例1及2的试剂可进一步抑制妥布霉素等的氨基糖苷系抗生物?#23454;?#33268;的APTT的
过度的延长。从而,自这些结果提示,在含鞣花酸化合物和磷脂和聚乙烯醇化合物的APTT试
剂中,在还配合锌离?#26377;?#25104;化合物或锰离?#26377;?#25104;化合物和铝离?#26377;?#25104;化合物时,也与参考
例1及2的试剂同样地,可进一步抑制氨基糖苷系抗生物?#23454;?#33268;的APTT的过度的延长。

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