平码五不中公式规律
  • / 13
  • 下载费用:30 金币  

一种高直链淀粉各组分含量的分析方法.pdf

关 键 ?#21097;?/dt>
一种 直链 淀粉 各组 含量 分析 方法
  专利查询网所有资源均是用户自行上传分享,仅供网友学习交流,未经上传用户书面授权,请勿作他用。
摘要
申请专利号:

CN201611012536.0

申请日:

2016.11.17

公开号:

CN106706527A

公开日:

2017.05.24

当前法律状态:

实审

有效性:

审中

法?#19978;?#24773;: 实质审查的生效IPC(主分类):G01N 21/31申请日:20161117|||公开
IPC分类号: G01N21/31; G01N21/78; G01N1/28 主分类号: G01N21/31
申请人: 扬州大学
发明人: 韦存虚; 林令尚; 张龙
地址: 225009 江苏省扬州市大学?#19979;?8号
优?#28909;ǎ?/td>
专利代理机构: 南京禹为知识产权代理事务所(特殊普通合伙) 32272 代理人: 王晓东
PDF完整版下载: PDF下载
法律状态
申请(专利)号:

CN201611012536.0

授权公告号:

|||

法律状态公告日:

2017.06.16|||2017.05.24

法律状态类型:

实质审查的生效|||公开

摘要

本发明公开了一种高直链淀粉各组分含量的分析方法,该方法包括淀粉溶液的制备、淀粉各组分的琼脂糖凝胶层析柱分离、各组分含量的测定等步骤。该测定方法简单、方便,结果重现性好,并能用少量淀粉同时定量测定淀粉中直链淀粉、中间组分和支链淀粉的含量,也能够分离和富集淀粉不同组分,为高直链淀粉分子结构的研究提供技术支持。

权利要求书

1.一种高直链淀粉各组分含量的分析方法,其特征在于:
将高直链淀粉制备成溶液并冷却,过滤后上样到琼脂糖凝胶层析柱,用淋洗液清洗后,
恒流速通入淋洗液并?#21451;?#36890;过蒽酮-硫酸法和碘比色法测定样品,计算其中支链淀粉组
分、中间组分及直链淀粉组分的含量;
所述淋洗液包括24~26mmol/L NaCl与0.8~1.2mmol/L NaOH的混合液。
2.如权利要求1所述高直链淀粉各组分含量的分析方法,其特征在于:所述高直链淀粉
制备成溶液,其是取高直链淀粉向其中加入蛋白酶溶液,混匀后在35~40℃、300~400rpm
条件下孵育25~35min,混匀离心,去除上清液后加入亚硫酸氢钠溶液,混匀后在37℃、300
~400rpm条件下反应25~35min,混匀离心去除上清液,快速加入溴化锂/二甲基?#29756;浚?#28151;
匀,在75~85℃、300~400rpm条件下8~10h,取出冷却至室温,离心8~12min,去除上清液
加底物体积3~5倍的无水乙醇,离心8~12min后去除上清液,吸水纸?#31245;?~12min,用60~
80℃的水溶解样品,制成0.1~0.3%浓度的溶液,沸水浴25~35min后,得到高直链淀粉溶
液。
3.如权利要求1或2所述高直链淀粉各组分含量的分析方法,其特征在于:所述琼脂糖
凝胶层析柱,其是将琼脂糖CL-2B作为填料,装柱后用所述淋洗液冲洗柱子20~28h,淋洗速
度为0.4~0.6mL/min。
4.如权利要求1所述高直链淀粉各组分含量的分析方法,其特征在于:所述碘比色法,
其中,淀粉的碘吸收光谱测定方法包括将样品、碘液及水混合,反应8~12min,用分光光度
计测OD630nm处吸光度为淀粉碘吸收值,分析每管样品最大吸收峰的峰值对应的波长。
5.如权利要求2所述高直链淀粉各组分含量的分析方法,其特征在于:所述蛋白酶溶液
pH为7.0~8.0,?#23500;?#20026;2.0~3.0U/mL,其添加量为每?#37327;?#25152;述高直链淀粉添加0.04~
0.06mL。
6.如权利要求5所述高直链淀粉各组分含量的分析方法,其特征在于:所述蛋白酶溶液
是用缓冲液溶解的,其中缓冲液的制作方法包括,将N-甘氨酸添加到水中,并将其pH调至
7.0~8.0。
7.如权利要求2所述高直链淀粉各组分含量的分析方法,其特征在于:所述亚硫酸氢钠
溶液其添加量为每?#37327;?#25152;述高直链淀粉添加0.04~0.06mL,其中,亚硫酸氢钠与溶液的质
量体积比为0.004~0.005:1。
8.如权利要求2所述高直链淀粉各组分含量的分析方法,其特征在于:所述溴化锂/二
甲基?#29756;浚?#20854;添加量为每?#37327;?#25152;述高直链淀粉添加0.12~0.18mL,其中,溴化锂占二甲基亚
砜的质量分数为0.4~0.6%。
9.如权利要求1或4所述高直链淀粉各组分含量的分析方法,其特征在于:所述琼脂糖
凝胶层析柱,其柱长为50cm,柱内径为1.6cm。
10.如权利要求1所述高直链淀粉各组分含量的分析方法,其特征在于:所述恒流速通
入淋洗液,其通入流速为0.4~0.6mL/min。

说明书

一种高直链淀粉各组分含量的分析方法

技术领域

本发明属于淀粉组分检测技术领域,具体涉及一种高直链淀粉各组分含量的分析
方法。

背景技术

淀粉主要由直链淀粉、中间组分和支链淀粉组成,其中中间组?#31181;?#35201;存在于高直
链淀粉中。直链淀粉主要是由α-1,4糖苷键相连的线性葡萄糖聚合物;支链淀粉除了α-1,4
糖苷键外,还有α-1,6糖苷键形成的高度?#31181;?#30340;葡萄糖聚合物;中间组分的分子量与直链淀
粉相似,但有许多侧链,并?#20063;?#38142;长度比支链淀粉侧链长。淀粉各组分的含量和分子结构是
评价淀粉?#20998;?#30340;主要依据和重要指标,决定淀粉的用途。

直链淀粉含量的提高影响淀粉的特性和用途,如高直链淀粉的作物籽粒富含抗性
淀粉,而抗性淀粉可?#28304;?#36827;人体胆固醇和血脂质的代谢、控制膳后血糖值、减少肠机能失调
及结肠癌发病?#30465;?#25511;制体重和能量?#33014;狻?#20419;进矿物质的吸收、增加营养,能?#26723;?#19968;些慢性病
(如糖尿病、大肠癌、肥胖等)的发病风险,具有提高人体健康功能的特性。另外,高直链淀粉
由于拥有难糊化、易老化和成膜性高等特点,也具有特殊的工业用途。因此高直链淀粉的研
究受到人们的普遍关注。

淀粉按各组分含量的不同分为糯性淀粉、普通淀粉和高直链淀粉,其中糯性淀粉
主要含有支链淀粉组分;普通淀粉主要包含支链淀粉和直链淀粉,中间组分的含量较少;而
高直链淀粉除了包含支链淀粉和直链淀粉外,还含有很高的中间组分,并且其含量和分子
结构在不同来源的高直链淀粉中差异极大,对淀粉?#20998;?#21644;用途也有显著影响。而目前现有
的测定方法仅适用于对糯性淀粉和普通淀粉各组分的测定,而对高直链淀粉中的中间组分
无法分析。鉴于高直链淀粉普遍受到人们的重视,因此亟需建立一种准确、快速,大多数实
验室有能力完成的并且能够分离和分析高直链淀粉各组分含量的方法,为高直链淀粉各组
分的含量测定和分子结构研究提供技术支持。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施
例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部
分、说明书摘要和发明名称的目的模糊,而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述和/或现有高直链淀粉各组分测定的技术空白,提出了本发明。

因此,本发明目的是解决现有技术中的不足,提供一种高直链淀粉各组分含量的
分析方法。

为解决上述技术问题,本发明提供了如下技术方案:一种高直链淀粉各组分含量
的分析方法,将高直链淀粉制备成溶液并冷却,过滤后上样到琼脂糖凝胶层析柱,用淋洗液
清洗后,恒流速通入淋洗液并?#21451;?#36890;过蒽酮-硫酸法和碘比色法测定样品,计算其中支链
淀粉组分、中间组分及直链淀粉组分的含量;所述淋洗液包括24~26mmol/L NaCl与0.8~
1.2mmol/L NaOH的混合液。

作为本发明所述高直链淀粉各组分含量的分析方法的一种优选方案,其中:所述
高直链淀粉制备成溶液,其是取高直链淀粉向其中加入蛋白酶溶液,混匀后在35~40℃、
300~400rpm条件下孵育25~35min,混匀离心,去除上清液后加入亚硫酸氢钠溶液,混匀后
在37℃、300~400rpm条件下反应25~35min,混匀离心去除上清液,快速加入溴化锂/二甲
基?#29756;浚?#28151;匀,在75~85℃、300~400rpm条件下8~10h,取出冷却至室温,离心8~12min,去
除上清液加底物体积3~5倍的无水乙醇,离心8~12min后去除上清液,吸水纸?#31245;?~
12min,用60~80℃的水溶解样品,制成0.1~0.3%浓度的溶液,沸水浴25~35min后,得到
高直链淀粉溶液。

作为本发明所述高直链淀粉各组分含量的分析方法的一种优选方案,其中:所述
琼脂糖凝胶层析柱,其是将琼脂糖CL-2B作为填料,装柱后用所述淋洗液冲洗柱子20~28h,
淋洗速度为0.4~0.6mL/min。

作为本发明所述高直链淀粉各组分含量的分析方法的一种优选方案,其中:所述
碘比色法,其中,淀粉的碘吸收光谱测定方法包括将样品、碘液及水混合,反应8~12min,用
分光光度计测OD630nm处吸光度为淀粉碘吸收值,分析每管样品最大吸收峰的峰值对应的
波长。

作为本发明所述高直链淀粉各组分含量的分析方法的一种优选方案,其中:所述
蛋白酶溶液pH为7.0~8.0,?#23500;?#20026;2.0~3.0U/mL,其添加量为每?#37327;?#25152;述高直链淀粉添加
0.04~0.06mL。

作为本发明所述高直链淀粉各组分含量的分析方法的一种优选方案,其中:所述
蛋白酶溶液是用缓冲液溶解的,其中缓冲液的制作方法包括,将N-甘氨酸添加到水中,并将
其pH调至7.0~8.0。

作为本发明所述高直链淀粉各组分含量的分析方法的一种优选方案,其中:所述
亚硫酸氢钠溶液其添加量为每?#37327;?#25152;述高直链淀粉添加0.04~0.06mL,其中,亚硫酸氢钠
与溶液的质量体积比为0.004~0.005:1。

作为本发明所述高直链淀粉各组分含量的分析方法的一种优选方案,其中:所述
溴化锂/二甲基?#29756;浚?#20854;添加量为每?#37327;?#25152;述高直链淀粉添加0.12~0.18mL,其中,溴化锂
占二甲基?#29756;?#30340;质量分数为0.4~0.6%。

作为本发明所述高直链淀粉各组分含量的分析方法的一种优选方案,其中:所述
琼脂糖凝胶层析柱,其柱长为50cm,柱内径为1.6cm。

作为本发明所述高直链淀粉各组分含量的分析方法的一种优选方案,其中:所述
恒流速通入淋洗液,其通入流速为0.4~0.6mL/min。

本发明所具有的有益效果:

(1)整个操作和分析过程简单、方便,不需要复杂的仪器设备。

(2)成本低廉、分离效果好,测量结果较准确。

(3)所需样品量较小,比较适于微量样品的检测,结果重现性较好。

(4)能够测得淀粉中直链淀粉、支链淀粉和中间组分的含量,也可以满足对淀粉各
组分的富集和研究,为淀粉各组分含量测定和分子结构的研究提供技术支持。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用
的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本
领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动性的前提下,还可以根据这些附图获得其它
的附图。其中:

图1为实施例1中高直链玉米淀粉各组分分布。

图2为实施例4中高直链水稻淀粉各组分分布。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂,下面结合具体实施例对
本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体?#38468;?#20197;便于充分理解本发明,但是本发明还可以
采用其他不同于在此描述的其它方式?#35789;?#26045;,本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的
情况下做类似推广,因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次,此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方
式中的特定特征、结?#22815;?#29305;性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指
同一个实施例,也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

实施例1

琼脂糖凝胶层析柱的制备,主要步骤为:

(1)填料的选取:选取琼脂糖CL-2B(Sigma公司CL2B300)做为填料。

(2)淋洗液的制备:称量2.925g NaCl和0.08g NaOH,用去离子水溶解并定容至2L,
配成25mM NaCl和1mM NaOH的水溶液。

(3)装柱:按常规琼脂糖凝胶层析柱的装柱方法装柱,其柱长为50cm,柱内径为
1.6cm。

(4)洗柱:淋洗液冲洗柱子24h(0.5mL/min),?#28304;?#21040;稳定的柱子条件。

淀粉溶液的制备,主要步骤为:

(1)称取高直链玉米淀粉(Sigma公司产品S4180)10±0.03mg到2mL离心管;

(2)加入0.5mL蛋白酶溶液(pH 7.5,2.5U/mL,用缓冲液溶解)(蛋白酶为Sigma公司
产品P5147),用?#34892;?#28151;合器混匀,转移至恒温混匀仪,37℃350rpm孵育30min(蛋白酶储存
于-20℃冰箱中;缓冲液保存于4℃冰箱);

缓冲液(250mM,pH 7.5)的配制:

a.加44.8g N-甘氨酸到1L去离子水;

b.配制1M NaOH:4g NaOH溶于100mL的去离子水;

c.用b调a的pH到7.5。

(3)?#34892;?#28151;匀,4000g离心10min,用移液枪小心吸掉上清液;

(4)加入0.5mL亚硫酸氢钠溶液(0.45%,W/V),用?#34892;?#28151;合器混匀,转移至恒温混
匀仪,37℃350rpm反应30min(破坏二硫键);

(5)?#34892;?#28151;匀,4000g离心10min,倒去上清液;

(6)快速加入1.5mL LiBr/DMSO(0.5%,W/W),颠?#22815;?#21248;;

(7)转移至恒温混合仪,80℃350rpm过夜。

(8)取出冷却至室温,4000g离心10min,吸取上清加4倍无水酒精(6mL)沉淀淀粉,
4000g,离心10min,去掉上清,沉淀再用酒精清洗一次,倒扣吸水纸上?#31245;?0min。

(9)预先准备好热的去离子水,用5mL移液枪吸取5mL?#20154;?#28342;解样品,抽打至完全溶
解,制备成0.2%浓度的溶液,沸水浴30min。

淀粉各组分琼脂糖凝胶层析柱的分离,主要步骤为:

(1)淀粉溶液冷却至室温,用5μm针式滤器过滤至10mL离心管。

(2)打开止水钳,待柱内淋洗液与柱面相切时,关闭止水钳,用移液枪吸取2mL样品
沿着层析柱内壁缓缓加到柱面。

(3)打开止水钳,将下管口放到量筒内,待样品流至填料内(即与柱面相切时),用
淋洗液清洗层析柱管口两次,每次200μL,沿着上样的部位清洗。

(4)等到量筒内淋洗液达到20mL时立刻启动全自动部分收集器,将管口转移至部
分收集器的卡口,定时?#21451;?#23558;层析柱淋洗液洗脱下来的样品收集到2mL离心管,设定时间
为3min,1.5mL/管(之前大量实验已确定前20mL不会有样品流出,证明外水体积大于20mL),
每个样品另外接55管。

淀粉各组分的测定与分析,主要步骤为:

(1)将每管收集的样品颠?#22815;?#21248;,其中的1mL用硫酸-蒽酮法来测定各管的淀粉含
量;淀粉的碘吸收光谱测定如下:0.4mL样品+1.56mL去离子水+0.04mL碘液(0.2%I2和2%
KI,W/V),将混合液颠倒摇匀,室温避光反应10min,用分光光度计测OD 630nm处吸光度为淀
粉碘吸收值,分析每管样品最大吸收峰的峰值对应的波长(λmax)。

(2)通过蒽酮-硫酸法和碘比色法测得高直链玉米淀粉分子量分布如图1所示。
630nm处的吸光度被称为碘蓝值,反应淀粉与碘的亲和力;最大吸收波长λmax反应淀粉的平
均链长;F1(17~29管)为支链淀粉组分,F2(30~42管)为中间组分,F3(43~70管)为直链淀
粉组分。图1高直链玉米淀粉中F1、F2和F3的含量?#30452;?#20026;49.7%、12.1%和38.2%。

实施例2

琼脂糖凝胶层析柱的制备,主要步骤为:

(1)填料的选取:选取琼脂糖CL-2B(Sigma公司CL2B300)做为填料。

(2)淋洗液的制备:称量2.925g NaCl和0.08g NaOH,用去离子水溶解并定容至2L,
配成25mM NaCl和1mM NaOH的水溶液。

(3)装柱:按常规琼脂糖凝胶层析柱的装柱方法装柱,其柱长为50cm,柱内径为
1.6cm。

(4)洗柱:淋洗液冲洗柱子24h(0.5mL/min),?#28304;?#21040;稳定的柱子条件。

淀粉溶液的制备,主要步骤为:

(1)称取高直链玉米淀粉(Sigma公司产品S4180)10±0.03mg到2mL离心管;

(2)加入0.5mL蛋白酶溶液(pH 7.5,2.5U/mL,用缓冲液溶解)(蛋白酶为Sigma公司
产品P5147),用?#34892;?#28151;合器混匀,转移至恒温混匀仪,37℃350rpm孵育30min(蛋白酶储存
于-20℃冰箱中;缓冲液保存于4℃冰箱);

缓冲液(250mM,pH 7.5)的配制:

a.加44.8g N-甘氨酸到1L去离子水;

b.配制1M NaOH:4g NaOH溶于100mL的去离子水;

c.用b调a的pH到7.5。

(3)?#34892;?#28151;匀,4000g离心10min,用移液枪小心吸掉上清液;

(4)加入0.5mL亚硫酸氢钠溶液(0.45%,W/V),用?#34892;?#28151;合器混匀,转移至恒温混
匀仪,37℃350rpm反应30min(破坏二硫键);

(5)?#34892;?#28151;匀,4000g离心10min,倒去上清液;

(6)快速加入1.5mL LiBr/DMSO(0.5%,W/W),颠?#22815;?#21248;;

(7)转移至恒温混合仪,80℃350rpm过夜。

(8)取出冷却至室温,4000g离心10min,吸取上清加4倍无水酒精(6mL)沉淀淀粉,
4000g,离心10min,去掉上清,沉淀再用酒精清洗一次,倒扣吸水纸上?#31245;?0min。

(9)预先准备好热的去离子水,用5mL移液枪吸取5mL?#20154;?#28342;解样品,抽打至完全溶
解,制备成0.2%浓度的溶液,沸水浴30min。

淀粉各组分琼脂糖凝胶层析柱的分离,主要步骤为:

(1)淀粉溶液冷却至室温,用5μm针式滤器过滤至10mL离心管。

(2)打开止水钳,待柱内淋洗液与柱面相切时,关闭止水钳,用移液枪吸取2mL样品
沿着层析柱内壁缓缓加到柱面。

(3)打开止水钳,将下管口放到量筒内,待样品流至填料内(即与柱面相切时),用
淋洗液清洗层析柱管口两次,每次200μL,沿着上样的部位清洗。

(4)等到量筒内淋洗液达到20mL时立刻启动全自动部分收集器,将管口转移至部
分收集器的卡口,定时?#21451;?#23558;层析柱淋洗液洗脱下来的样品收集到2mL离心管,设定时间
为3min,1.5mL/管(之前大量实验已确定前20mL不会有样品流出,证明外水体积大于20mL),
每个样品另外接55管。

淀粉各组分的测定与分析,主要步骤为:

(1)将每管收集的样品颠?#22815;?#21248;,其中的1mL用硫酸-蒽酮法来测定各管的淀粉含
量;淀粉的碘吸收光谱测定如下:0.4mL样品+1.56mL去离子水+0.04mL碘液(0.2%I2和2%
KI,W/V),将混合液颠倒摇匀,室温避光反应10min,用分光光度计测OD 630nm处吸光度为淀
粉碘吸收值,分析每管样品最大吸收峰的峰值对应的波长(λmax)。

(2)通过蒽酮-硫酸法和碘比色法测得高直链玉米淀粉分子量分布。630nm处的吸
光度被称为碘蓝值,反应淀粉与碘的亲和力;最大吸收波长λmax反应淀粉的平均链长;F1
(17~29管)为支链淀粉组分,F2(30~42管)为中间组分,F3(43~70管)为直链淀粉组分。实
施例2中高直链玉米淀粉中F1、F2和F3的含量?#30452;?#20026;50.5%、11.0%和38.5%。

实施例3

琼脂糖凝胶层析柱的制备,主要步骤为:

(1)填料的选取:选取琼脂糖CL-2B(Sigma公司CL2B300)做为填料。

(2)淋洗液的制备:称量2.925g NaCl和0.08g NaOH,用去离子水溶解并定容至2L,
配成25mM NaCl和1mM NaOH的水溶液。

(3)装柱:按常规琼脂糖凝胶层析柱的装柱方法装柱,其柱长为50cm,柱内径为
1.6cm。

(4)洗柱:淋洗液冲洗柱子24h(0.5mL/min),?#28304;?#21040;稳定的柱子条件。

淀粉溶液的制备,主要步骤为:

(1)称取高直链玉米淀粉(Sigma公司产品S4180)10±0.03mg到2mL离心管;

(2)加入0.5mL蛋白酶溶液(pH 7.5,2.5U/mL,用缓冲液溶解)(蛋白酶为Sigma公司
产品P5147),用?#34892;?#28151;合器混匀,转移至恒温混匀仪,37℃350rpm孵育30min(蛋白酶储存
于-20℃冰箱中;缓冲液保存于4℃冰箱);

缓冲液(250mM,pH 7.5)的配制:

a.加44.8g N-甘氨酸到1L去离子水;

b.配制1M NaOH:4g NaOH溶于100mL的去离子水;

c.用b调a的pH到7.5。

(3)?#34892;?#28151;匀,4000g离心10min,用移液枪小心吸掉上清液;

(4)加入0.5mL亚硫酸氢钠溶液(0.45%,W/V),用?#34892;?#28151;合器混匀,转移至恒温混
匀仪,37℃350rpm反应30min(破坏二硫键);

(5)?#34892;?#28151;匀,4000g离心10min,倒去上清液;

(6)快速加入1.5mL LiBr/DMSO(0.5%,W/W),颠?#22815;?#21248;;

(7)转移至恒温混合仪,80℃350rpm过夜。

(8)取出冷却至室温,4000g离心10min,吸取上清加4倍无水酒精(6mL)沉淀淀粉,
4000g,离心10min,去掉上清,沉淀再用酒精清洗一次,倒扣吸水纸上?#31245;?0min。

(9)预先准备好热的去离子水,用5mL移液枪吸取5mL?#20154;?#28342;解样品,抽打至完全溶
解,制备成0.2%浓度的溶液,沸水浴30min。

淀粉各组分琼脂糖凝胶层析柱的分离,主要步骤为:

(1)淀粉溶液冷却至室温,用5μm针式滤器过滤至10mL离心管。

(2)打开止水钳,待柱内淋洗液与柱面相切时,关闭止水钳,用移液枪吸取2mL样品
沿着层析柱内壁缓缓加到柱面。

(3)打开止水钳,将下管口放到量筒内,待样品流至填料内(即与柱面相切时),用
淋洗液清洗层析柱管口两次,每次200μL,沿着上样的部位清洗。

(4)等到量筒内淋洗液达到20mL时立刻启动全自动部分收集器,将管口转移至部
分收集器的卡口,定时?#21451;?#23558;层析柱淋洗液洗脱下来的样品收集到2mL离心管,设定时间
为3min,1.5mL/管(之前大量实验已确定前20mL不会有样品流出,证明外水体积大于20mL),
每个样品另外接55管。

淀粉各组分的测定与分析,主要步骤为:

(1)将每管收集的样品颠?#22815;?#21248;,其中的1mL用硫酸-蒽酮法来测定各管的淀粉含
量;淀粉的碘吸收光谱测定如下:0.4mL样品+1.56mL去离子水+0.04mL碘液(0.2%I2和2%
KI,W/V),将混合液颠倒摇匀,室温避光反应10min,用分光光度计测OD 630nm处吸光度为淀
粉碘吸收值,分析每管样品最大吸收峰的峰值对应的波长(λmax)。

(2)通过蒽酮-硫酸法和碘比色法测得高直链玉米淀粉分子量分布。630nm处的吸
光度被称为碘蓝值,反应淀粉与碘的亲和力;最大吸收波长λmax反应淀粉的平均链长;F1
(17~29管)为支链淀粉组分,F2(30~42管)为中间组分,F3(43~70管)为直链淀粉组分。实
施例3中高直链玉米淀粉中F1、F2和F3的含量?#30452;?#20026;89.5%、12.7%和38.8%。

实施例4

琼脂糖凝胶层析柱的制备,主要步骤为:

(1)填料的选取:选取琼脂糖CL-2B(Sigma公司CL2B300)做为填料。

(2)淋洗液的制备:称量2.925g NaCl和0.08g NaOH,用去离子水溶解并定容至2L,
配成25mM NaCl和1mM NaOH的水溶液。

(3)装柱:按常规琼脂糖凝胶层析柱的装柱方法装柱。

(4)洗柱:淋洗液冲洗柱子24h(0.5mL/min),?#28304;?#21040;稳定的柱子条件。

淀粉溶液的制备,主要步骤为:

(1)称取高直链水稻淀粉(扬州大学农学院利用基因工程方法?#31181;?#28096;粉?#31181;?#37238;1和
3基因表达培育出的高直链淀粉水稻株系TRS)10±0.03mg到2mL离心管;

(2)加入0.5mL蛋白酶溶液(pH 7.5,2.5U/mL,用缓冲液溶解)(蛋白酶为Sigma公司
产品P5147),用?#34892;?#28151;合器混匀,转移至恒温混匀仪,37℃350rpm孵育30min(蛋白酶储存
于-20℃冰箱中;缓冲液保存于4℃冰箱);

缓冲液(250mM,pH 7.5)的配制:

a.加44.8g N-甘氨酸到1L去离子水;

b.配制1M NaOH:4g NaOH溶于100mL的去离子水;

c.用b调a的pH到7.5。

(3)?#34892;?#28151;匀,4000g离心10min,用移液枪小心吸掉上清液;

(4)加入0.5mL亚硫酸氢钠溶液(0.45%,W/V),用?#34892;?#28151;合器混匀,转移至恒温混
匀仪,37℃350rpm反应30min(破坏二硫键);

(5)?#34892;?#28151;匀,4000g离心10min,倒去上清液;

(6)快速加入1.5mL LiBr/DMSO(0.5%,W/W),颠?#22815;?#21248;;

(7)转移至恒温混合仪,80℃350rpm过夜。

(8)取出冷却至室温,4000g离心10min,吸取上清加4倍无水酒精(6mL)沉淀淀粉,
4000g,离心10min,去掉上清,沉淀再用酒精清洗一次,倒扣吸水纸上?#31245;?0min。

(9)预先准备好热的去离子水,用5mL移液枪吸取5mL?#20154;?#28342;解样品,抽打至完全溶
解,制备成0.2%浓度的溶液,沸水浴30min。

淀粉各组分琼脂糖凝胶层析柱的分离,主要步骤为:

(1)淀粉溶液冷却至室温,用5μm针式滤器过滤至10mL离心管。

(2)打开止水钳,待柱内淋洗液与柱面相切时,关闭止水钳,用移液枪吸取2mL样品
沿着层析柱内壁缓缓加到柱面。

(3)打开止水钳,将下管口放到量筒内,待样品流至填料内(即与柱面相切时),用
淋洗液清洗层析柱管口两次,每次200μL,沿着上样的部位清洗。

(4)等到量筒内淋洗液达到20mL时立刻启动全自动部分收集器,将管口转移至部
分收集器的卡口,定时?#21451;?#23558;层析柱淋洗液洗脱下来的样品收集到2mL离心管,设定时间
为3min,1.5mL/管(之前大量实验已确定前20mL不会有样品流出,证明外水体积大于20mL),
每个样品另外接55管。

淀粉各组分的测定与分析,主要步骤为:

(1)将每管收集的样品颠?#22815;?#21248;,其中的1mL用硫酸-蒽酮法来测定各管的淀粉含
量;淀粉的碘吸收光谱测定如下:0.4mL样品+1.56mL去离子水+0.04mL碘液(0.2%I2和2%
KI,W/V),将混合液颠倒摇匀,室温避光反应10min,用分光光度计测OD 630nm处吸光度为淀
粉碘吸收值,分析每管样品最大吸收峰的峰值对应的波长(λmax)。

(2)通过蒽酮-硫酸法和碘比色法测得高直链水稻淀粉分子量分布如图2所示。
630nm处的吸光度被称为碘蓝值,反应淀粉与碘的亲和力;最大吸收波长λmax反应淀粉的平
均链长;F1(17~29管)为支链淀粉组分,F2(30~42管)为中间组分,F3(43~70管)为直链淀
粉组分。图2高直链水稻淀粉中F1、F2和F3的含量?#30452;?#20026;33.7%、16.4%和49.9%。

实施例5

琼脂糖凝胶层析柱的制备,主要步骤为:

(1)填料的选取:选取琼脂糖CL-2B(Sigma公司CL2B300)做为填料。

(2)淋洗液的制备:称量2.925g NaCl和0.08g NaOH,用去离子水溶解并定容至2L,
配成25mM NaCl和1mM NaOH的水溶液。

(3)装柱:按常规琼脂糖凝胶层析柱的装柱方法装柱。

(4)洗柱:淋洗液冲洗柱子24h(0.5mL/min),?#28304;?#21040;稳定的柱子条件。

淀粉溶液的制备,主要步骤为:

(1)称取高直链玉米淀粉(Sigma公司产品S4180)10±0.03mg到2mL离心管;

(2)加入0.5mL蛋白酶溶液(pH 7.5,2.5U/mL,用缓冲液溶解)(蛋白酶为Sigma公司
产品P5147),用?#34892;?#28151;合器混匀,转移至恒温混匀仪,37℃350rpm孵育30min(蛋白酶储存
于-20℃冰箱中;缓冲液保存于4℃冰箱);

缓冲液(250mM,pH 7.5)的配制:

a.加44.8g N-甘氨酸到1L去离子水;

b.配制1M NaOH:4g NaOH溶于100mL的去离子水;

c.用b调a的pH到7.5。

(3)?#34892;?#28151;匀,4000g离心10min,用移液枪小心吸掉上清液;

(4)加入0.5mL亚硫酸氢钠溶液(0.45%,W/V),用?#34892;?#28151;合器混匀,转移至恒温混
匀仪,37℃350rpm反应30min(破坏二硫键);

(5)?#34892;?#28151;匀,4000g离心10min,倒去上清液;

(6)快速加入1.5mL LiBr/DMSO(0.5%,W/W),颠?#22815;?#21248;;

(7)转移至恒温混合仪,80℃350rpm过夜。

(8)取出冷却至室温,4000g离心10min,吸取上清加4倍无水酒精(6mL)沉淀淀粉,
4000g,离心10min,去掉上清,沉淀再用酒精清洗一次,倒扣吸水纸上?#31245;?0min。

(9)预先准备好热的去离子水,用5mL移液枪吸取5mL?#20154;?#28342;解样品,抽打至完全溶
解,制备成0.2%浓度的溶液,沸水浴30min。

淀粉各组分琼脂糖凝胶层析柱的分离,主要步骤为:

(1)淀粉溶液冷却至室温,用5μm针式滤器过滤至10mL离心管。

(2)打开止水钳,待柱内淋洗液与柱面相切时,关闭止水钳,用移液枪吸取2mL样品
沿着层析柱内壁缓缓加到柱面。

(3)打开止水钳,将下管口放到量筒内,待样品流至填料内(即与柱面相切时),用
淋洗液清洗层析柱管口两次,每次200μL,沿着上样的部位清洗。

(4)等到量筒内淋洗液达到20mL时立刻启动全自动部分收集器,定时?#21451;?br />

淀粉各组分的富集,主要步骤为:

(1)支链淀粉的富集:将管口立即转移到第一个500mL烧杯,将层析柱淋洗液洗脱
下来的样品收集到500mL烧杯,设定时间为39min,体积约为19.5mL,为支链淀粉,加80mL无
水乙醇,混匀静置15min以上。

(2)中间组分的富集:将管口立即转移到第二个500mL烧杯,将层析柱淋洗液洗脱
下来的样品收集到500mL烧杯,设定时间为39min,体积约为19.5mL,为中间组分,加80mL无
水乙醇,混匀静置15min以上。

(3)直链淀粉的富集:将管口立即转移到第三个500mL烧杯,将层析柱淋洗液洗脱
下来的样品收集到500mL烧杯,设定时间为84min,体积约为42mL,为直链淀粉,加170mL无水
乙醇,混匀静置15min以上。

(4)各组分的收集、保存:将烧杯中的淀粉悬液,6000g离心10min获得沉淀,将沉淀
浸没于无水乙醇中进行脱水,用磁力搅拌器缓慢搅拌10min,脱水后6000g离心10min,倒去
上清,沉淀40℃烘干,用研钵磨成淀粉粉末,过100?#21487;福?#31216;量其干重,?#31245;?#22120;保存备用。

实施例5中高直链玉米淀粉中支链淀粉、中间组分和直链淀粉的质量三次重复结
果见表1。

表1高直链玉米淀粉各组?#31181;?#37327;



实际应用中样?#20998;?#30340;杂质容易对进液口以及凝胶孔径有堵塞作用,并且经研究发
现,杂质与高直链淀粉中存在很大程度的交联,其中尤其是高直链淀粉中的支链结构与蛋
白的交联。蛋白的空间构象主要靠静电作用、二硫键作用、氢键作用、疏水作用和?#25216;?#20316;用
来维持,而支链结构末端与蛋白极性末端通过氢键来紧密连接,中性末端通过范德华力相
互作用。同时这种交联将会给除杂过程带来问题,从而造成分离效?#23454;汀?#25928;果不好甚至将层
析柱进液口及凝胶孔径堵塞。本发明通过优选优化预处理条件和处理试?#31890;?#23558;蛋?#33258;?#36136;完
全去除,为后一步提高分离效?#23454;?#23450;良好基础。

注管内径多少会对层析分离的效果产生较大影响,内径太小,会发生管壁效应,即
柱管中心部分的组分移动慢,而管壁周围的移动快。柱越长,分离效果?#33014;茫?#20294;柱过长,柱分
离时间长,样品稀释度大,分离效果反而不好。同时作为琼脂糖凝胶柱,还必须满足层析柱
要均匀,不能有断层、纹路或气泡。

综上可见,本发明提供的分离分析方法,能够实现高直链淀粉中组分的100%分
离,分离效率极高。整个操作和分析过程简单、方便,不需要复杂的仪器设备;成本低廉、分
离效果好,测量结果较准确;所需样品量较小,比较适于微量样品的检测,结果重现性较好;
能够测得淀粉中直链淀粉、支链淀粉和中间组分的含量,也可以满足对淀粉各组分的富集
和研究,为淀粉各组分含量测定和分子结构的研究提供技术支持。

应说明的是,以上实施例仅用?#36816;?#26126;本发明的技术方案而非限制,尽管参照较佳
实施例对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术
方?#38468;?#34892;修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的精神和范围,其均应涵盖在本发
明的权利要求范围当中。

关于本文
本文标题:一种高直链淀粉各组分含量的分析方法.pdf
链接地址:http://www.pqiex.tw/p-6079844.html
关于我们 - 网站声明 - 网?#38236;?#22270; - 资源地图 - 友情链接 - 网?#31350;?#26381; - 联系我们

[email protected] 2017-2018 zhuanlichaxun.net网站版权所有
经营许可证编号:粤ICP备17046363号-1 
 


收起
展开
平码五不中公式规律 福彩最近一起号码查询 东方财富股票融资买入的步骤 pk10牛牛棋牌游戏下载 大乐透蓝球出球顺序一览表 幸运农场开奖结果走势图 吉林十一选五遗漏一定牛 安徽11选5走势分布图 宁夏11选5走势图新 大富豪棋牌2 全球股票指数一览