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一种高通量快速检测汉滩病毒中和抗体效价的方法.pdf

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一种 通量 快速 检测 病毒 中和 抗体 方法
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摘要
申请专利号:

CN201611128631.7

申请日:

2016.12.09

公开号:

CN106706582A

公开日:

2017.05.24

当前法律状态:

实审

有效性:

审中

法?#19978;?#24773;: 实质审查的生效IPC(主分类):G01N 21/64申请日:20161209|||公开
IPC分类号: G01N21/64; G01N33/569 主分类号: G01N21/64
申请人: 中国人民解放军第四军医大学
发明人: 张芳琳; 马宏炜; 雷迎峰; 张亮; 程林峰; 陈何嵩; 石静琦; 韩佩君; 叶伟; 吴兴安; 徐志凯
地址: 710032 陕西省西安市长乐西路169号
优?#28909;ǎ?/td>
专利代理机构: 西安智大知识产权代理事务所 61215 代理人: 刘国智
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法律状态
申请(专利)号:

CN201611128631.7

授权公告号:

|||

法律状态公告日:

2017.06.16|||2017.05.24

法律状态类型:

实质审查的生效|||公开

摘要

本发明公开了一种高通量快速检测汉滩病毒中和抗体效价的方法。本发明的特征在于利用In??cell??Western(ICW)法简便、直观地检测被HTNV感染的细胞。该方法检测灵敏度高(可检测5g的目的蛋白)、周期短(72小时)、结果判?#37327;?#35266;、可重复性好、高通量、方法可标准化,便于实验室间推广,特别可针对无细胞病变效应病毒检测其感染力。本发明同时公布了上述方法在HTNV感染力测定(TCID50)、HTNV中和抗体效价测定、抗HTNV分子筛选和鉴定、人HTNV疫苗免疫保护性评价等方面的应用。

权利要求书

1.一种高通量快速检测汉滩病毒中和抗体效价的方法,其特征在于,包括以下操作:
1)将A549细胞均匀接种于ICW用微孔板中,培养至80~90%的细胞汇合度;
2)待步骤1)中细胞汇合度达到70~80%时,采用固定病毒稀释样本的方法进行混合液
的制备:将待测样本等比梯度稀释,每个稀释比例的待测样本?#30452;?#19982;等体积的HTNV混合,于
37℃孵箱中孵育2h,期间轻柔地颠倒混匀数次;
3)吸弃步骤1)微孔板中的培养液,每?#20934;?#20837;DPBS洗涤1-2次,然后将步骤(2)中孵育完
成的混合液加入微孔板,每个稀释梯度设多个重复样,加样顺序按照从低到高进行;同时设
置病毒阴性对照组、同型对照组、病毒阳性对照组、空白对照组;
4)将步骤(3)中的微孔板放入37℃孵箱孵育2.5h后吸弃混合液,每?#20934;?#20837;洗涤1-2次,
再向每?#20934;?#20837;含有2%FBS的DMEM;
5)将步骤4)中微孔板放入37℃孵箱孵育2d后取出进行ICW检测;
6)ICW检测HTNV感染细胞内的NP:首先吸弃微孔板中的培养液,加入PBS洗涤;然后向每
孔中加入4℃预冷的固定缓冲液进行固定,免摇动在室温条件下孵育;吸弃固定缓冲液,用
透膜缓冲?#21512;?#33073;细胞;吸弃透膜缓冲液,沿管壁向每?#20934;?#20837;封阻液,在摇床上缓慢上摇动室
温下孵育;吸弃封阻液,沿管壁向每?#20934;?#20837;一抗,室温下缓慢摇动孵育;吸弃一抗,加入洗涤
缓冲液,洗涤多次;吸弃洗涤缓冲液,沿管壁向每?#20934;?#20837;二抗,室温下避光缓慢摇动,孵育;
加入洗涤缓冲液,室温下避光缓慢摇动,洗涤多次;洗脱结束之后,完全去除洗脱液;最后,
洗脱后的微孔板采用近红外双色荧光?#19978;襝低?#36827;行扫描,使用700nm和800nm两个通道同时
扫描,以获取HTNV NP的红外荧光强度;
7)计算HTNV中和抗体效价:
获得每孔在700nm和800nm通道的红外荧光强度,然后计算每孔中HTNV NP红外荧光强
度相对比NIR,NIR=NP荧光值/内参蛋白荧光值;再利用Karber方法计算获得待测样本中和
滴度,即中和抗体效价。
2.如权利要求1所述的高通量快速检测汉滩病毒中和抗体效价的方法,其特征在于,所
述用Karber方法计算待测样本中和滴?#26579;?#20307;为:
1)计算各病毒稀释度阳性?#36164;?#30446;P和阴性?#36164;?#30446;N,阳性孔的判别标准为,若该孔HTNV
感染系数≥1.5,则该孔为阳性,否则为阴性;

其中,NIR本底值为本底组四个孔NIR的算术平均值,微孔板的阳性对照组HTNV感染系
数≥1.5是采用该组检测结果否则重复此板结果;
2)计算中和比值之和,每个稀释梯度的中和比值=阴性孔/复孔总数中和比值之和=
所有稀释梯度的感染比值之和
3)计算稀释组距,将梯度稀释比例换算成10的指数,以指数等差排列的公差作为稀释
组距;
4)计算中和滴度,用Karber法?#30452;?#27979;定LgPD50(半数保护量)及中和效价LgPD50=L+D
×(S-0.5);
中和效价=PD50;其中,L为最低稀释度的对数;D为稀释组距;S为中和比值之和。
3.如权利要求1所述的高通量快速检测汉滩病毒中和抗体效价的方法,其特征在于,所
述的一抗包括抗HTNV NP鼠单抗,以及抗β-actin兔多抗;所述的二抗包括Goat anti-
rabbit IRDyeTM 680和Goat anti-mouse IRDyeTM800CW,?#30452;?#29992;以检测700nm和800nm通道
的荧光强度。
4.如权利要求1所述的高通量快速检测汉滩病毒中和抗体效价的方法,其特征在于,在
A549细胞感染HTNV后第二天进行ICW检测。
5.如权利要求1所述的高通量快速检测汉滩病毒中和抗体效价的方法,其特征在于,所
述A549细胞感染HTNV的感染剂量为MOI=0.1。

说明书

一种高通量快速检测汉滩病毒中和抗体效价的方法

技术领域

本发明属于汉滩病毒检测技术领域,涉及一种高通量快速检测汉滩病毒中和抗体
效价的方法。

背景技术

汉滩病毒(Hantaan virus,HTNV)隶属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae)汉坦病毒
属(Hantavirus),是单?#31579;?#38142;RNA病毒,基因组由L、M、S三个片段组成,?#30452;?#32534;码病毒RNA依
赖的RNA聚合酶(RdRp)、包膜糖蛋白(GP)和核衣壳蛋白(NP)。该病毒的宿主动物和传染源均
为啮齿动物,主要通过动物?#21028;?#29289;污染而经由呼吸道、消化道或破损的皮肤等途径传播给
人类,引起一类自然疫源性疾病,即肾综合征出血热(Hemorrhagic fever with renal
syndrome,HFRS)。该病临床表现为发热、出血和急性肾功能损害,具有流行?#27573;?#24191;、发病人
数多、病死率高等特点。

我国是世界上HFRS疫情最严重的国家,每年发病人数占世界总发病数90%以上,
死亡率为0.1-15%。据文献报道,1950-2007年间,我国共发生1,557,622例HFRS,其中死亡
46,427例,死亡?#35797;?#20026;3%;另据中国疾病预防控制中心统计,2015年我国全年共发生10,
812例HFRS,死亡63例。由于HTNV的宿主广泛,传播途径多,且目前为止临床上尚缺乏特异有
效的治疗药物,因此其?#20048;?#20219;务十分艰巨。?#26723;?#27880;意的是,HTNV还是国?#30465;?#31105;止生物武器公
约》所列入的生物战剂,对未来军事活动构成潜在的威?#30149;?br />

开发、研制HTNV预防性疫苗被认为是预防HTNV感染所致HFRS的最根本手段,而预
防性疫苗成功与否的关键是其能否诱导有效的体?#22909;?#30123;。高滴度HTNV中和抗体可有效抵抗
外来HTNV的感染,因?#31169;?#31435;稳定、有效的疫苗评价?#20302;常?#26816;测疫苗免疫反应的保护效果,对
于疫苗的研制和质控具有重要意义。

中和试验(neutralization test)是指病毒与相应的抗体结合,抗体中和病毒使
其失去了对敏感细胞的感染力,该实验可从待检血清中检出抗体,或从病检样本中检出病
毒,从而诊断病毒性传染病,也可测定抗病毒血清中和效价,或者对新分离病毒进行鉴定和
?#20013;汀?#20854;原理是特异性的抗病毒免疫血清(中和抗体)与病毒作用,能够?#31181;?#30149;毒对敏感细
胞的吸附、穿入和脱壳,从而阻止了病毒的繁殖,失去了感染能力。?#26723;?#27880;意的是,该反应不
仅表现为质的方面,即一种病毒只能被相应的免疫血清中和;而且也表现在量的方面,即中
和一定量病毒的感染力,需要一定效价的抗体。

通过中和试验检测病毒中和抗体效价是评价疫苗保护效果的常用方法。常用的中
和试验包括简单定性法、固定样本稀释病毒法、固定病毒稀释样本法及空斑减少法。空斑减
少法是“金标准?#20445;?#21363;用系列稀释的患者血清与等量的已知滴度病毒悬液(100TCID50)混合,
在室温下作用一段时间后接种敏感细胞进?#20449;?#20859;,以能保护半数细胞培养孔不产生细胞病
变(CPE)的血清最高稀释度作为终点效价。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种高通量快速检测汉滩病毒中和抗体效价的方法,
通过In-cell Western(ICW)技术检测HTNV感染细胞内的病毒核衣壳蛋白,并基于此测定
HTNV滴度,具有测灵敏度高、周期短的优势。

本发明是通过以下技术方案来实现:

一种高通量快速检测汉滩病毒中和抗体效价的方法,包括以下操作:

1)将A549细胞均匀接种于ICW用微孔板中,培养至80~90%的细胞汇合度;

2)待步骤1)中细胞汇合度达到70~80%时,采用固定病毒稀释样本的方法进行混
合液的制备:将待测样本等比梯度稀释,每个稀释比例的待测样本?#30452;?#19982;等体积的HTNV混
合,于37℃孵箱中孵育2h,期间轻柔地颠倒混匀数次;

3)吸弃步骤1)微孔板中的培养液,每?#20934;?#20837;DPBS洗涤1-2次,然后将步骤(2)中孵
育完成的混合液加入微孔板,每个稀释梯度设多个重复样,加样顺序按照从低到高进行;同
时设置病毒阴性对照组、同型对照组、病毒阳性对照组、空白对照组;

4)将步骤(3)中的微孔板放入37℃孵箱孵育2.5h后吸弃混合液,每?#20934;?#20837;洗涤1-2
次,再向每?#20934;?#20837;含有2%FBS的DMEM;

5)将步骤4)中微孔板放入37℃孵箱孵育2d后取出进行ICW检测;

6)ICW检测HTNV感染细胞内的NP:首先吸弃微孔板中的培养液,加入PBS洗涤;然后
向每孔中加入4℃预冷的固定缓冲液进行固定,免摇动在室温条件下孵育;吸弃固定缓冲
液,用透膜缓冲?#21512;?#33073;细胞;吸弃透膜缓冲液,沿管壁向每?#20934;?#20837;封阻液,在摇床上缓慢上
摇动室温下孵育;吸弃封阻液,沿管壁向每?#20934;?#20837;一抗,室温下缓慢摇动孵育;吸弃一抗,加
入洗涤缓冲液,洗涤多次;吸弃洗涤缓冲液,沿管壁向每?#20934;?#20837;二抗,室温下避光缓慢摇动,
孵育;加入洗涤缓冲液,室温下避光缓慢摇动,洗涤多次;洗脱结束之后,完全去除洗脱液;
最后,洗脱后的微孔板采用近红外双色荧光?#19978;襝低?#36827;行扫描,使用700nm和800nm两个通
道同时扫描,以获取HTNV NP的红外荧光强度;

7)计算HTNV中和抗体效价:

获得每孔在700nm和800nm通道的红外荧光强度,然后计算每孔中HTNV NP红外荧
光强度相对比NIR,NIR=NP荧光值/内参蛋白荧光值;再利用Karber方法计算获得待测样本
中和滴度,即中和抗体效价。

所述用Karber方法计算待测样本中和滴?#26579;?#20307;为:

1)计算各病毒稀释度阳性?#36164;?#30446;P和阴性?#36164;?#30446;N,阳性孔的判别标准为,若该孔
HTNV感染系数≥1.5,则该孔为阳性,否则为阴性;


其中,NIR本底值为本底组四个孔NIR的算术平均值,微孔板的阳性对照组HTNV感
染系数≥1.5是采用该组检测结果否则重复此板结果;

2)计算中和比值之和,每个稀释梯度的中和比值=阴性孔/复孔总数

中和比值之和=所有稀释梯度的感染比值之和

3)计算稀释组距,将梯度稀释比例换算成10的指数,以指数等差排列的公差作为
稀释组距;

4)计算中和滴度,用Karber法?#30452;?#27979;定LgPD50(半数保护量)及中和效价LgPD50=
L+D×(S-0.5);

中和效价=PD50;其中,L为最低稀释度的对数;D为稀释组距;S为中和比值之和。

所述的一抗包括抗HTNV NP鼠单抗,以及抗β-actin兔多抗;所述的二抗包括Goat
anti-rabbit IRDyeTM 680和Goat anti-mouse IRDyeTM 800CW,?#30452;?#29992;以检测700nm和
800nm通道的荧光强度。

在A549细胞感染HTNV后第二天进行ICW检测。

所述A549细胞感染HTNV的感染剂量为MOI=0.1。

与现有技术相比,本发明具有以下有益的技术效果:

本发明优化了ICW检测HTNV感染细胞的最适时间、所用病毒的最适剂量,筛选了
ICW所用的抗病毒蛋白抗体,并进行了标准化。本发明可用于测定HTNV滴度(组织细胞培养
半数感染量TCID50)、检测HTNV中和抗体效价、筛选和鉴定抗HTNV分子、评价人HTNV疫苗免疫
保护性等。除HTNV外,其他无CPE或无明显CPE病毒(如丙?#36879;?#28814;病毒)的相关检测也可参考
本发明实施,但所用抗体应根据所测病毒而定。

本发明具有以下优点:1、直接检测,操作简单;2、检测周期短(72小时);3、灵敏度
高,5pg-100ng蛋白ICW所测荧光强度与蛋白量成正相关;4、可重复性好;5、结果判?#37327;?#35266;;
6、高通量;7、检测成本低;8、方法可标准化,便于实验室间推广。

附图说明

图1为ICW检测HTNV感染细胞的最适时间的选择;

图2为ICW检测HTNV感染细胞的最适病毒滴度的选择;

图3为筛选ICW所用的抗病毒蛋白抗体;

图4为本发明检测HTNV滴度及其与经典ELISA方法的对比;

图5为本发明检测患者血清中和抗体效价及其与经典ELISA方法的对比;

图6为本发明评价人HTNV疫苗免疫保护性及其与经典ELISA方法的对比;

图7为本发明检测的HTNV中和抗体效价及其与经典ELISA方法的对比;

图8为本发明筛选和鉴定抗HTNV分子。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明,所述是对本发明的解释而
不是限定。

HTNV感染并不产生明显的CPE,故难以用传统的空斑减少试验检测中和抗体效价,
同时,亦难借助CPE的产生测定HTNV毒力及滴度。目前评价HTNV中和抗体效价的方法主要是
基于ELISA技术的微量细胞培养中和试验,该方法的缺点是操作繁琐、实验周期长(约11~
12天)、结果?#25925;静?#30452;观、难以用于检测大规模临床样本的中和抗体水平。因此,亟需开发一
种灵敏度高、特异性好、周期短且能实现高通量检测的方法。

近年来,In-cell Western(ICW)技术逐渐受到关注和应用,其基本原理与免疫荧
光技术相似,可利用近红外双色荧光?#19978;襝低?#20934;确、快速、特异、高通量检测细胞内某种蛋
白的含量。

有鉴于此,本发明提供一种HTNV中和抗体效价的高通量检测方法。该方法通过ICW
技术检测感染细胞内HTNV的病毒蛋白(即核衣壳蛋白NP),?#28304;宋?#22522;础首先测定E6扩增病毒
的滴度,之后通过固定病毒稀释样本的方法检测HTNV中和抗体效价。该方法操作简便、检测
周期短(约3天)、结果直观、判?#37327;?#35266;、可重复性好、高通量、方法可标准化,便于实验室间推
广。

本发明提供一种高通量快速检测HTNV中和抗体效价方法,包括如下步骤:

步骤1:按照标准细胞培养步骤培养A549细胞至80~90%的细胞汇合度。将A549细
胞均匀接种于ICW专用微孔板中(具体以96孔板为例),接种细胞数为(2-4)×104/孔,接种
?#36164;?#24453;测样本数?#26009;?#37322;次数×复?#36164;?本说明书以4个复孔为例)。注意?#20309;?#20351;细胞贴壁更
加紧密可提前用多聚?#34507;?#37240;或者胶原蛋白处理微孔板,然后再接种细胞。

步骤2:待步骤1中细胞汇合度达到70~80%时,采用固定病毒稀释样本的方法进
行微量中和试验,即:

步骤(1)将待测样本等比梯度稀释,如,血清样本按照1:10,1:20,1:40,1:80,1:
160,1:320比例使用PBS稀释,每个稀释比例设置4个生物学重复,每个稀释比例最终稀释体
积为400ul。如表1所示。

表1:待测样本稀释方法



步骤(2)将步骤(1)中每个稀释比例的400ul待测样本?#30452;?#19982;400ul(100TCID50)
HTNV混合,于37℃孵箱中孵育2h,期间每隔0.5h轻柔地颠倒混匀数次。

步骤(3)吸弃步骤1微孔板中的培养液,每?#20934;?#20837;200ul DPBS洗涤1-2次,将步骤
(2)中孵育完成的混合液加入微孔板,每?#20934;?#20837;混合液200ul,每个稀释梯度设有4个生物学
重复,加样顺序按照1:10至1:320。设置病毒阴性对照组(每?#20934;?#20837;DPBS 200ul/孔)、同型对
照组(每?#20934;?#20837;待测样本原液100ul+DPBS 100ul)、病毒阳性对照组(每?#20934;?#20837;
100TCID50HTNV 100ul+DPBS 100ul)、空白对照组(未铺细胞,不加任?#25105;?#20307;)。注意?#20309;?#24323;液
体、加液操作可使用排枪以减少操作时间,同时避免枪?#26041;?#35302;微孔板的底部?#20048;构?#20260;细胞。
每块微孔板待测样本分布情况如图1(96孔板为例)。

步骤(4)将步骤(3)中的微孔板放入37℃孵箱孵育2.5h后吸弃混合液,每?#20934;?#20837;
200ul DPBS洗涤1-2次,再向每?#20934;?#20837;含有2%FBS的DMEM200ul。

步骤(5)将步骤(4)中微孔板放入37℃孵箱孵育2d后取出进行ICW实验。

步骤3:ICW检测HTNV感染细胞内的NP,即:

步骤(1)---洗涤?#20309;?#24323;微孔板中的培养液,每?#20934;?#20837;200ul PBS洗涤2次。注意:ICW
过程中所?#23567;?#21560;弃”步骤亦可“轻柔地将微孔板翻转以弃去孔中液体”。

步骤(2)---固定?#21512;?#27599;孔中加入4℃预冷的固定缓冲液(4%多聚甲醛)100ul进行
固定,免摇动在室温条件下孵育20min。加固定缓冲液时,小心地用移液器沿管壁加入,避免
使细胞分离。

步骤(3)---透膜?#20309;?#24323;固定缓冲液,用透膜缓冲液(1%Triton X-100)100ul/孔分
3次洗脱细胞,每次5min,以保证完全渗透细胞。注意?#22909;?#27425;洗脱最好在摇床上进行,缓慢摇
动,室温条件下5min。洗脱过程中切勿让孔变干,每次操作后快速加入透膜缓冲液。

步骤(4)---封闭?#20309;?#24323;透膜缓冲液,沿管壁向每?#20934;?#20837;150ul封阻液,在摇床上缓
慢上摇动室温下孵育1.5h。

步骤(5)---孵育一抗:

计算各液体体积:①计算一抗总体积,一抗总体积=待测?#36164;?0(ul);②计算所
需HTNV NP鼠单抗(按照单抗标准方法制备并命名为1A8,纯化后浓度定容积至10ug/ml,1:
3000稀释)体积,所需1A8单抗体积=一抗总体积/3000(ul);③计算所需抗β-actin兔多抗
(武汉三鹰,CatalogNo:23660-1-AP,1:300稀释)体积,所需抗β-actin兔多抗体积=一抗总
体积/500(ul)。④计算稀释液体积=一抗总体积-1A8单抗体积-抗β-actin兔多抗体积;所
用稀释?#20309;?4)中所述的封阻液。

将上述稀释液、HTNV NP鼠单抗、抗β-actin兔多抗混合均匀。吸弃封阻液,沿管壁
向每?#20934;?#20837;50ul一抗。室温下缓慢摇动孵育2h,或者4℃不摇动孵育过夜。注意:孵育过夜
时,为?#20048;?#32454;胞?#31245;?#21487;用保鲜膜盖住微孔板。

步骤(6)---洗涤?#20309;?#24323;一抗,沿管壁向每?#20934;?#20837;洗涤缓冲液(0.1%Tween-20),
300ul/孔,,室温下缓慢摇动5min,洗涤5?#25105;?#19978;。

步骤(7)---孵育二抗:

计算各液体体积:①计算二抗总体积,一抗总体积=待测?#36164;?0(ul);②计算所
需Goat anti-rabbit IRDyeTM 680(LI-COR Cat#926-32221)体积,所需Goat anti-rabbit
IRDyeTM 680体积=一抗总体积/5000(ul);③计算所需Goat anti-mouse IRDyeTM 800CW
(LI-COR Cat#926-32210)体积,所需Goat anti-mouse IRDyeTM 800CW体积=一抗总体积/
5000(ul)。④计算稀释液体积=一抗总体积-Goat anti-mouse IRDyeTM 800CW体积-Goat
anti-rabbit IRDyeTM 680体积体积;所用稀释?#20309;?4)中所述的封阻液。

将上述稀释液、Goat anti-mouse IRDyeTM 800CW、Goat anti-mouse IRDyeTM
800CW混合均匀。吸弃洗涤缓冲液,沿管壁向每?#20934;?#20837;二抗50ul。室温下避光缓慢摇动,孵育
1h。

步骤(8)---洗涤:沿管壁向每?#20934;?#20837;洗涤缓冲液200ul,室温下避光缓慢摇动,洗
脱5min。洗涤5?#25105;?#19978;。

步骤(9)---扫板?#30333;?#22791;/扫班后保存?#21512;?#33073;结束之后,从孔内完全去除洗脱液。翻
转微孔板底部朝上,用纸巾轻轻敲打。结果可在室温下避光保存至少1个月。

步骤(10)---上机扫板:将步骤(9)中微孔板采用Odyssey近红外双色荧光?#19978;?#31995;
统进行扫描,使用700nm和800nm两个通道同时扫膜,选择中等质量、169um?#30452;媛省?.0nm焦
距、亮度5。一台Odyssey扫描仪可同时扫描8块96孔板。

步骤4:计算HTNV中和抗体效价,即

步骤(1)利用Odyssey CLx Image Studio软件处理扫膜结果,获得每孔在700nm和
800nm通道的红外荧光强度。

步骤(2)计算每孔中HTNV NP红外荧光强度相对比(Intensity Ratio,NIR),IR=
NP荧光值/内参蛋白荧光值

步骤(3)用Karber方法计算获得待测样本中和滴度,即中和抗体效价。

所述用Karber方法计算待测样本中和滴?#26579;?#20307;为:

步骤①计算各病毒稀释度阳性?#36164;?#30446;(P)和阴性?#36164;?#30446;(N),阳性孔的判别标准
为,若该孔HTNV感染系数≥1.5,即


则该孔为阳性,否则为阴性。

注意:NIR本底值为本底组四个孔NIR的算术平均值。微孔板的阳性对照组HTNV感染系
数≥1.5(感染系数按照与标准ELISA方法对比后拟合而得),则证明该板反应体系良好;否
则需要重复此板结果。

步骤②计算中和比值之和,即

每个稀释梯度的中和比值=阴性孔/复孔总数

中和比值之和=所有稀释梯度的感染比值之和

步骤③计算稀释组距,即

将梯度稀释比例换算成10的指数(等差数列)计算稀释组距,

如:1:10=10-1,1:20=10-1.3,1:40=10-1.6,1:80=10-1.9,1:160=10-2.2,1:320=
10-2.5,稀释组距=0.3。

步骤④计算中和滴度,即

用Karber法?#30452;?#27979;定LgPD50(半数保护量)及中和效价

LgPD50=L+D×(S-0.5);

中和效价=PD50

注:L:最低稀释度的对数;D:组距;S:中和比值之和(详见实例5)。

详细计算方法见实例5。

在本发明的一些具体实施方案中,高通量检测方法中步骤1所述“ICW专用微孔板”
为使用黑管壁透明管底的微孔板;切勿使用白微孔板,因为白色管壁表面的自身荧光会产
生显著的噪音信号。ICW专用微孔板包括以下几种规格的产品:

96well format NuncTM(Part Number 161093,165305);

96well format FalconTM(Part Number 353075,353948);

384well format NuncTM(Part Number 164688,164730);

384well format FalconTM(Part Number 353961,353962)。

在本发明的一些具体实施方案中,高通量检测方法中步骤2中所述“待测样本”可
以是HFRS患者或者HTNV疫苗免疫受试者的血清,也可是科?#26800;?#20301;制备的HTNV中和/非中和
性抗体。

在本发明的一些具体实施方案中,高通量检测方法中步骤2—(2)中所述
“(100TCID50)HTNV?#20445;琀TNV扩增方法如下:取1~2d龄的KM窝鼠,处死雄鼠,保留雌鼠。在实验
台铺一块浸有3~5%?#27492;找?#32433;布,左手捏乳鼠两耳及颈部使其侧卧于纱布上,酒精消毒眼
耳连线中点处,右手持注射器刺入眼耳连线中点略偏耳侧硬脑膜下,进针2~3mm,注入HTNV
病毒悬液0.02~0.03ml,注射完毕用酒精消毒局部;将注射完的乳鼠放回笼之前,需要用酒
精棉球擦拭母鼠鼻部,以破坏其嗅觉,以免母鼠吃掉乳鼠,接种后的乳鼠?#21248;?#19982;母鼠一起喂
养。逐日观察,48小时内死亡者为非特异性死亡。在接种病毒7天后处死乳鼠取鼠脑,按照1g
鼠脑加入10ml RPMI 1640的比例?#24515;?#40736;脑,0.22um滤器过滤。T-75培养的Vero E6待到汇合
度在70%左右时接种鼠脑扩增的HTNV病毒(250ul/瓶),感染2h后弃去上清,换用含2%FBS
的培养基(DMEM);T-75继续培养3~4天后视细胞培养密度传代接种至T-175或T-300培养瓶
中,继续使用含2%FBS的培养基(DMEM),将培养瓶盖拧紧;继续培养7~10d后,将培养瓶冻
入-80℃冰箱待处理;将T-175或T-300培养瓶中的Vero E6细胞反复冻融三次(37℃/-80℃)
后将上清转移至50ml高速离心管,13000g离心×10min。上清可冻入-80℃冰箱备用。梯度稀
释E6扩增的HTNV,感染ICW专用微孔板中的A549细胞,感染2天后利用ICW方法检测细胞内的
病毒蛋白,利用Reed-Munch公式计算TCID50。

在本发明的一些具体实施方案中,高通量检测方法中步骤3—(4)所述“封阻液”为
LI-COR Odyssey封阻液或者3%BSA。

在本发明的一些具体实施方案中,高通量检测方法中步骤3—(5)所述亦可使用
GAPDH兔多抗(武汉三鹰公司,CatalogNo:10494-1-AP)或者Lamin A兔多抗(武汉三鹰,
CatalogNo:10298-1-AP)作为内参,按照抗体说明书中免疫荧光(IFA)实验所述比例稀释
(GAPDH,1:200;Lamin A,1:500)。

本发明提供的方法基于待测样本中针对人HTNV特异性中和抗体可以阻断HTNV感
染细胞而建立的。在进行中和试验之前,首先利用E6细胞扩增HTNV并利用ICW滴定病毒滴
度。梯度稀释待测样本并与等体积100TCID50的HTNV共孵育后感染A549,通过ICW检测被HTNV
感染的细胞。若待测血清中含有的HTNV特异性中和抗体,可以与病毒表面相应表位结合,从
而阻断病毒进入细胞内,导致细胞不被感染或感染细胞数量?#26723;汀?#36890;过软件判读阴性、阳性
孔,根据检测结果通过Karber法计算,可以得到样本中和抗体滴度。

本发明提供的一种高通量快速检测汉滩病毒中和抗体效价的方法中所用原料及
试剂均可由市场购得。

下面给出具体的实施例

实施例1.ICW检测HTNV感染细胞的最适时间的选择(图1)。

A549细胞感染HTNV(MOI=1)后通过ICW检测不同感染时间点细胞中病毒蛋白NP的
表达情况。左图为扫描结果,右图为软件分析结果,通过Student t检验分析发现,与未感染
组相比,在感染后第二天(2dpi)即可检测出病毒蛋白的表达。(*P<0.05,**P<0.01,***P<
0.001)

实施例2.ICW检测HTNV感染细胞的最适病毒滴度的选择(附图2)。

A549细胞按照不同MOI感染HTNV后,在2dpi通过ICW检测胞中病毒蛋白NP的表达情
况。左图为扫描结果,右图为软件分析结果,通过Student t检验分析发现,与未感染组相
比,感染剂量为MOI=0.1时可明显检测出病毒蛋白的表达。(*P<0.05,**P<0.01,***P<
0.001)

实施例3.筛选ICW所用的抗病毒蛋白抗体(图3)。

制备抗HTNV NP的鼠单抗1A8及抗HTNV GP的鼠单抗3D8及3G1。抗体制备按照标准
单抗制备方法;抗体纯化方法为硫酸铵沉淀法,具体步骤如下:

1、配制饱和硫酸铵溶液(SAS)

将767g(NH4)2SO4边搅拌边慢慢加到1L蒸馏水中。用氨水或硫酸调PH值为7.0。此
即饱和度为100%的硫酸铵溶液(4.1mol/L,25℃)。

2、沉淀

(1)样品(如腹水)20000g离心30min,除去细胞碎片;

(2)保留上清液并测量体积;

(3)边搅拌边慢慢加入等体积的SAS到上清液中,?#24352;?#24230;为1:1;

(4)将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小?#34987;?#25605;拌过夜(4℃),使蛋白?#39135;?#20998;沉淀。

3、透析

(1)蛋白质溶液10000g离心30min(4℃),弃上清保留沉淀;

(2)将沉淀溶于少量5ml PBS-0.2g/L叠氮钠中,沉淀溶解后放入透析袋对PBS--
0.2g/L叠氮钠透析过夜,每隔3-6小?#34987;?#36879;析缓冲液一次,以彻底除去硫酸铵;

(3)透析液离心,BCA法测定上清液中蛋白质含量。

纯化后抗体浓度稀释至10mg/ml。在图3中,上图为使用不同稀释倍数1A8单抗进行
ICW实验,检测对象为HTNV感染(MOI=1)2天后的A549细胞,下图为使用不同稀释倍数3D8或
3G1单抗进行ICW实验,检测对象为HTNV感染(MOI=1)2天后的A549细胞,结果显?#38236;?#27987;度的
1A8单抗(0.25×10-3mg/ml)仍可有效检测病毒NP,而ICW实验有效检测GP需较高浓度的3D8
(10-2mg/ml)或3G1(0.5×10-2mg/ml)单抗。

实施例4.本发明检测HTNV滴度及其与经典ELISA方法的对比(图4)。

同一批E6扩增病毒?#30452;?#21033;用ICW(前已叙述)和经典ELISA方法检测TCID50(按照
Reed-Munch公式计算)对比两种方法的相关性,图4A为ICW检测HTNV TCID50/ml结果(2.43×
104),图4B为ELISA检测同一批HTNV TCID50/ml结果(2.57×104),图4C为7次两种方法检测
结果对比的线性回归结果,结果提示两种方法存在良好的回归关系。(*P<0.05,**P<
0.01,***P<0.001)

实施例5.本发明检测患者血清中和抗体效价及其与经典ELISA方法的对比(图5)。

图5A为ICW检测患者血清中和抗体效价结果,患者1、2血清中和抗体效价?#30452;?#20026;1/
56和1/40,以患者1为例,其计算方法如下:

①结果判定如下表:


注释:血清倍比稀释-1∶10,四个孔HTNV感染系数均小于1.5(如图5-Patient1---
ICW第一竖排结果,?#20063;?#23545;应相对荧光强度统计图中,虚线位置为HTNV感染系数≥1.5即阳
性孔的临界值),即四个孔均为阴性孔(未检测到HTNV-NP的阳性荧光值),四个孔病毒被完
全中和,中和比值为4/4。后续中和比值计算方法同上。中和比值之和=4/4+4/4+4/4+0/4+
0/4=3。ICW、ELISA所测中和抗体的效价计算方法均按照此法进?#23567;?br />

②用Karber法?#30452;?#27979;定LgPD50(半数保护量)及中和效价

LgPD50=L+D×(S-0.5);

中和效价=PD50

注:L:最低稀释度的对数;D:组距;S:中和比值之和

本例中:

LgPD50=L+D×(S-0.5)=-1+-0.3×(3-0.5)=-1.75;

中和效价=PD50=10-1.75=1/56;

说明该待测血清中和效价是1/56.

图5B为ELISA检测患者血清中和抗体效价结果,患者1、2血清中和抗体效价?#30452;?#20026;
1/56和1/33,结果与ICW基本一致。

实施例6.本发明评价人HTNV疫苗免疫保护性及其与经典ELISA方法的对比(图6)。

图6A为ICW检测人HTNV疫苗免疫后受试者血清HTNV中和抗体效价,其中受试者1免
疫策略为按说明书规定剂量注射HTNV灭活疫苗,一年后增强一次,在增强后1周取血;受试
者2免疫策略为按说明书规定剂量注射HTNV灭活疫苗,一年后不增强直接取血。受试者1、2
血清中和抗体效价?#30452;?#20026;1/20和1/10;图6B为ELISA检测患者血清中和抗体效价结果,患者
1、2血清中和抗体效价?#30452;?#20026;1/20和1/10,结果与ICW一致。

实施例7.本发明检测HTNV中和抗体效价及其与经典ELISA方法的对比(图7)。

图7A为ICW检测本科室自制的HTNV中和抗体3D8和3G1的中和效价,效价?#30452;?#20026;1/
1334和1/2240;图7B为ELISA检测同一批中和抗体效价结果,效价?#30452;?#20026;1/1334和1/2240,
结果与ICW一致。

实施例8.本发明筛选和鉴定抗HTNV分子(图8)。

通过慢病毒?#20302;?#22312;A549中表达Mx1等ISG分子(图8A)及DDX3等DExD/H家族分子(图
8B)(A549细胞铺入ICW专用微孔板后按照MOI=100感染相应的慢病毒,感染1天后进行后续
实验),之后按照MOI=1感染HTNV,2dpi通过ICW检测细胞内HTNV NP的表达。图8A显示Mx1、
Mx2、IFIT2等分子具有抗HTNV感染的作用,图8B显示DDX3和DDX21等分子具有抗HTNV感染的
作用,而DDX17和DDX50等分子具有促进HTNV感染的作用。(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)

以?#32454;?#20986;的实施例是实现本发明较优的例子,本发明不限于上述实施例。本领域
的技术人?#22791;?#25454;本发明技术方案的技术特征所做出的任何非本质的添加、替换,均属于本
发明的保护?#27573;А?br />

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