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金黄色葡萄球菌黏附素蛋白抗体的抗黏附能力的检测方法.pdf

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金黄色 葡萄球菌 黏附 蛋白 抗体 能力 检测 方法
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摘要
申请专利?#29275;?/td>

CN201510746052.8

申请日:

2015.11.06

公开?#29275;?/td>

CN106680483A

公开日:

2017.05.17

当前法律状态:

实审

?#34892;?#24615;:

审中

法?#19978;?#24773;: 实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/543申请日:20151106|||公开
IPC分类?#29275;?/td> G01N33/543 主分类?#29275;?/td> G01N33/543
申请人: 中创云牧(内蒙?#29275;?#31185;技咨询有限公司
发明人: 郝永清
地址: 010000 内蒙古自治区呼和浩特?#34892;?#22478;区内蒙古自治区大学科技园12号楼二层208室
优?#28909;ǎ?/td>
专利代理机构: 代理人:
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法律状态
申请(专利)?#29275;?/td>

CN201510746052.8

授权公告?#29275;?/td>

|||

法律状态公告日:

2017.09.29|||2017.05.17

法律状态类型:

实质审查的生效|||公开

摘要

本发明公开了一种金黄色葡萄球菌黏附素蛋白抗体的抗黏附能力的检测方法,包括:(1)pET??FnbpB??D的诱导表达;(2)目的蛋白免疫实验兔后的抗血清制备;(3)抗体抗黏附能力的检测。本发明通过将S.aureus菌株的FnbpB基因进行克隆表达后,再对表达产物的特异性抗体的抗黏附能力进行检测,进而为以FnbpB为靶位的S.aureus的黏附素疫苗提供参考。本发明还为金黄色葡萄球菌性奶牛乳房炎疫苗的研究提供试验依据。

权利要求书

1.金黄色葡萄球菌黏附素蛋白抗体的抗黏附能力的检测方法,其特征在于,包括以下
步骤:
(1)pET-FnbpB-D的诱导表达
首先采用PCR方法对金黄色葡萄球菌FnbpB基因中的D区进行特异性的扩增得到构
建的重组质粒,并利用表达载体pET-32a对该构建的重组质粒进行诱导表达后,经鉴定,
诱导表达后的重组质粒以可溶性蛋白形式存在,然后将该可溶性蛋白形式的重组质粒进行
大量表达纯化,得到目的蛋白;
(2)目的蛋白免疫实验兔后的抗血清制备
将目的蛋白与弗氏完全佐剂乳化后,实验兔背部多点注射免疫,注射量为600μg/只,
2周后,将目的蛋白与弗氏不完全佐剂乳化后,进行加强免疫;1周后,实验兔耳缘静脉
采血后,制备得到含有抗体的抗血清;
(3)抗体抗黏附能力的检测,包括以下步骤:
①5μg/mL牛?#23435;?#34507;白原包被酶标板,4℃过夜;
②往酶标板中加入5%脱脂乳作为封?#25214;海?7℃封闭3h得到封闭好的酶标板;
③将对数生长期的S.aureus与制备的抗血清在37℃共孵育60min;
④将孵育的S.aureus加入封闭好的酶标板中,以未经抗血清孵育的S.aureus做对照,
37℃作用2h,PBST洗涤3次;
⑤25%甲醛固定30min,洗涤同上;
⑥用结晶?#20808;?#33394;30min,洗涤同上;
⑦最后用95%乙醇脱色两次,每次5min;
⑧在波长405nm处测定经抗血清孵育的S.aureus、未经抗血清孵育的S.aureus两组的
OD值;根据测定值,计算经抗血清孵育的S.aureus、未经抗血清孵育的S.aureus两组的平
均OD405nm值以及标准差,从而对抗体的抗黏附能力进行判定。

说明书

金黄色葡萄球菌黏附素蛋白抗体的抗黏附能力的检测方法

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域,具体是一种金黄色葡萄球菌黏附素蛋白抗体的抗黏
附能力的检测方法。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,简称S.aureus)是奶牛乳房炎的主要病原菌,
近50%的奶牛乳房炎是由该菌引起。奶牛乳房炎不仅造成产奶量下降,甚至严重影响牛奶
?#20998;剩?#23548;致乳品工业的经济损失。

S.aureus黏附到乳头管被认为是乳腺感染的第一步,因此,黏附到乳腺上皮细胞和细
胞外基质上的能力对于S.aureus的致病性至关重要。S.aureus黏附的过程中有多种黏附因
子参与,其中?#23435;?#32032;结合蛋白B(Fibronectin-binding protein B,简称FnbpB)是重要的黏
附素之一,它能够介导S.aureus结合于细胞表面的?#23435;?#36830;结素(Fn)与?#23435;?#34507;白原(Fg),
使细胞黏附于宿主细胞表面,促进细菌对宿主的侵入。因此,目前研究表明以FnbpB为靶
位进行疫苗的研制可能是预防奶牛S.aureus乳房炎的?#34892;?#26041;法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种金黄色葡萄球菌黏附素蛋白抗体的抗黏附能力的检测方
法,通过将S.aureus菌株的FnbpB基因进行克隆表达后,再对表达产物的特异性抗体的抗
黏附能力进行检测,进而为以FnbpB为靶位的S.aureus的黏附素疫苗提供参考,还为金黄
色葡萄球菌性奶牛乳房炎疫苗的研究提供试验依据。

为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:

金黄色葡萄球菌黏附素蛋白抗体的抗黏附能力的检测方法,包括以下步骤:

(1)pET-FnbpB-D的诱导表达

首先采用PCR方法对金黄色葡萄球菌FnbpB基因中的D区进行特异性的扩增得到构
建的重组质粒,并利用表达载体pET-32a对该构建的重组质粒进行诱导表达后,经鉴定,
诱导表达后的重组质粒以可溶性蛋白形式存在,然后将该可溶性蛋白形式的重组质粒进行
大量表达纯化,得到目的蛋白;

(2)目的蛋白免疫实验兔后的抗血清制备

将目的蛋白与弗氏完全佐剂乳化后,实验兔背部多点注射免疫,注射量为600μg/只,
2周后,将目的蛋白与弗氏不完全佐剂乳化后,进行加强免疫;1周后,实验兔耳缘静脉
采血后,制备得到含有抗体的抗血清;

(3)抗体抗黏附能力的检测,包括以下步骤:

①5μg/mL牛?#23435;?#34507;白原包被酶标板,4℃过夜;

②往酶标板中加入5%脱脂乳作为封?#25214;海?7℃封闭3h得到封闭好的酶标板;

③将对数生长期的S.aureus与制备的抗血清在37℃共孵育60min;

④将孵育的S.aureus加入封闭好的酶标板中,以未经抗血清孵育的S.aureus做对照,
37℃作用2h,PBST洗涤3次;

⑤25%甲醛固定30min,洗涤同上;

⑥用结晶?#20808;?#33394;30min,洗涤同上;

⑦最后用95%乙醇脱色两次,每次5min,尽量使结晶?#20808;客?#20986;;

⑧在波长405nm处测定经抗血清孵育的S.aureus、未经抗血清孵育的S.aureus两组的
OD值;根据测定值,计算经抗血清孵育的S.aureus、未经抗血清孵育的S.aureus两组的平
均OD405nm值以及标准差,从而对抗体的抗黏附能力进行判定。

与现有技术相比,本发明的有益效果是:

本发明通过将S.aureus菌株的FnbpB基因进行克隆表达后,再对表达产物的特异性抗
体的抗黏附能力进行检测,进而为以FnbpB为靶位的S.aureus的黏附素疫苗提供参考。本
发明还为金黄色葡萄球菌性奶牛乳房炎疫苗的研究提供试验依据。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例,对本发明实施例中的技术方?#38468;?#34892;清楚、完整地描述,显
然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的
实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提?#28388;?#33719;得的所有其他实施例,都
属于本发明保护的范围。

本发明实施例中,金黄色葡萄球菌黏附素蛋白抗体的抗黏附能力的检测方法,具体操
作步骤如下:

1、pET-FnbpB-D的诱导表达

首先采用PCR方法对金黄色葡萄球菌FnbpB基因中的D区进行特异性的扩增得到构
建的重组质粒,并利用表达载体pET-32a对该构建的重组质粒进行诱导表达后,经鉴定,
诱导表达后的重组质粒以可溶性蛋白形式存在,然后将该可溶性蛋白形式的重组质粒进行
大量表达纯化,得到目的蛋白。

2、目的蛋白免疫实验兔后的抗血清制备

将目的蛋白与弗氏完全佐剂乳化后,实验兔背部多点注射免疫(600μg/只),2周后,
将目的蛋白与弗氏不完全佐剂乳化后,进行加强免疫。1周后,实验兔耳缘静脉采血后,
制备得到含有抗体的抗血清。

3、抗体抗黏附能力的检测

①5μg/mL牛?#23435;?#34507;白原包被酶标板,4℃过夜;

②往酶标板中加入5%脱脂乳作为封?#25214;海?7℃封闭3h得到封闭好的酶标板;

③将对数生长期的S.aureus与制备的抗血清在37℃共孵育60min;

④将孵育的S.aureus加入封闭好的酶标板中,以未经抗血清孵育的S.aureus做对照,
37℃作用2h,PBST洗涤3次;

⑤25%甲醛固定30min,洗涤同上;

⑥用结晶?#20808;?#33394;30min,洗涤同上;

⑦最后用95%乙醇脱色两次,每次5min,尽量使结晶?#20808;客?#20986;;

⑧在波长405nm处测定OD值。

4、抗体抗黏附能力的检测结果

用酶标仪测定OD405nm,并从统计学角度?#37255;?#31639;经抗血清孵育的S.aureus、未经抗血清
孵育的S.aureus两组的平均OD405nm值以及标准差,结果表明:经抗血清孵育的S.arreus
的平均OD405nm值为0.1679(标准差为0.0346),未经抗血清孵育的S.aureus的平均OD405nm
值为0.3543(标准差为0.0895),经抗血清孵育的S.aureus的平均OD405nm值明?#32536;?#20110;未
经抗血清孵育的S.aureus,试验组与对照组差异极显著(p<0.01),表明抗血清有?#31181;?br />S.aureus黏附到?#23435;?#36830;结素的作用。

因此,通过上述方法,可以?#34892;?#22320;检测金黄色葡萄球菌黏附素蛋白抗血清的抗黏附能
力,为进一步证明FnbpB基因具有帮助S.aureus黏附于宿主细胞的作用,对金黄色葡萄球
菌性奶牛乳房炎疫苗的研究提供了依据。

对于本领域技术人员而言,显然本发明不限于上述示范性实施例的?#38468;冢?#32780;?#20197;?#19981;背
离本发明的精神或基本特征的情况下,能够以其他的具体形式实现本发明。因此,无论从
哪一点?#32431;矗?#22343;应将实施例看作是示范性的,而且是非限制性的,本发明的范围由所附权
利要求而不是上述说明限定,因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有
变化囊括在本发明内。

此外,应当理解,虽然本说明书按照实施方式加以描述,但并非每个实施方式仅包含
一个独立的技术方案,说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见,本领域技术人员应当将
说明书作为一个整体,各实施例中的技术方案也可以经?#23454;?#32452;合,形成本领域技术人员可
以理解的其他实施方式。

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