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纳米 凝胶
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摘要
申请专利号:

CN201280036770.0

申请日:

2012.05.25

公开号:

CN103917239A

公开日:

2014.07.09

当前法律状态:

授权

有效性:

有权

法?#19978;?#24773;: 授权|||实质审查?#32435;?#25928;IPC(主分类):A61K 38/00申请日:20120525|||公开
IPC分类号: A61K38/00; C08F220/38; C08F220/34 主分类号: A61K38/00
申请人: 20迈德医疗私人有限公司
发明人: J·F·J·昂格贝尔森; A·V·津琴科
地址: 荷兰亨厄洛
优?#28909;ǎ?/td> 2011.05.27 EP 11167885.0; 2011.05.27 US 61/490,674
专利代理机构: 永新专利商标代理有限公司 72002 代理人: 张晓威
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法律状态
申请(专利)号:

CN201280036770.0

授权公告号:

||||||

法律状态公告日:

2016.10.05|||2014.08.06|||2014.07.09

法律状态类型:

授权|||实质审查?#32435;?#25928;|||公开

摘要

本发明涉及式(1)或(2)的聚合物:本发明还涉及由通式(1)和(2)的聚合物构成的纳米凝胶和毫微粒。所述纳米凝胶可包含如siRNA、miRNA、DNA、(寡)肽或蛋白质?#32435;?#29289;活性组分。

权利要求书

权利要求书
1.  式(1)和(2)的聚合物:

其中:
A独立地选自直接的碳-碳单键(即其中A不存在的结构)、O、N(R1)和S;
R1独立地选自H和CH3;
R2独立地选自:
(a)C1-C40亚烷基,其中所述亚烷基可为线性的或支化的,并且任选地被取代,和/或任选地(部分)不饱和,和/或任选地被一个或多个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S,和/或其中所述亚烷基被一个或多个-S-S-基团间断;
(b)C3-C40亚环烷基,其中所述亚环烷基任选地被取代,和/或任选地(部分)不饱和,和/或任选地在所述?#20998;?#21253;含一个或多个杂原子,其中所述杂原子独立地选自O、N和S,和/或其中所述亚环烷基被一个或多个所述环外的-S-S-基团间断;
(c)C6-C40亚芳基,其中所述亚芳基任选地被取代;
(d)C6-C40亚杂芳基,其中所述亚杂芳基包含1个、2个或3个独立地选自O、N和S的杂原子,和/或其中所述亚杂芳基任选地被取代;
(e)C7-C40亚烷基芳基,其中所述亚烷基芳基任选地被取代,和/或其中所述亚烷基芳基的烷基部分为线性的或支化的,并且任选地(部分)不饱和, 和/或任选地被一个或多个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S,和/或其中所述亚烷基芳基的烷基部分被一个或多个-S-S-基团间断;
(f)C7-C40亚烷基杂芳基,其中所述亚烷基杂芳基包含1个、2个或3个独立地选自O、N和S的杂原子,和/或其中所述亚烷基杂芳基任选地被取代,和/或其中所述亚烷基杂芳基的烷基部分为线性的或支化的,并且任选地(部分)不饱和,和/或任选地被一个或多个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S,和/或其中所述亚烷基杂芳基的烷基部分被一个或多个-S-S-基团间断;以及
(g)其中两个C7-C40亚(杂)芳基和/或C7-C40亚烷基(杂)芳基通过-S-S-基团相互连接的基团,其中所述亚烷基(杂)芳基的烷基部分为线性的或支化的,并且任选地(部分)不饱和,和/或任选地被一个或多个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;
R3独立地选自:
(a)H;
(b)C1-C10烷基,其中所述烷基可为线性的或支化的,并且任选地被取代,和/或任选地(部分)不饱和,和/或任选地被1个、2个或3个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;
(c)C3-C12环烷基,其中所述环烷基任选地被取代,和/或任选地(部分)不饱和,和/或任选地在所述?#20998;?#21253;含1个、2个或3个杂原子,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;
(d)C6-C12芳基,其中所述芳基任选地被取代;
(e)C6-C12杂芳基,其中所述杂芳基包含1个、2个或3个杂原子,其中所述杂原子独立地选自O、N和S,并且其中所述杂芳基任选地被取代;
(f)C7-C14烷基芳基,其中所述烷基芳基任选地被取代,和/或其中所述烷基芳基的烷基部分为线性的或支化的,并且任选地(部分)不饱和,和/或任选地被1个、2个或3个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;以及
(g)C7-C14烷基杂芳基,其中所述烷基杂芳基包含1个、2个或3个独立地选自O、N和S的杂原子,和/或其中所述烷基杂芳基任选地被取代,和/或其中所述烷基杂芳基的烷基部分为线性的或支化的,并且任选地(部分)不饱 和,和/或任选地被1个、2个或3个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;
R4独立地选自:
(a)H;
(b)C1-C10烷基,其中所述烷基可为线性的或支化的;
(c)C3-C12环烷基;
(d)C6-C14芳基;
(e)C6-C14杂芳基,其中所述烷基杂芳基包含1个、2个或3个独立地选自O、N和S的杂原子;
(f)C7-C14烷基芳基;以及
(g)C7-C14烷基杂芳基,其中所述烷基杂芳基包含1个、2个或3个独立地选自O、N和S的杂原子;
R5独立地选自:
(a)C1-C12亚烷基,其中所述亚烷基可为线性的或支化的,并且任选地被取代,和/或任选地(部分)不饱和,和/或任选地被一个或多个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;
(b)C3-C12亚环烷基,其中所述亚环烷基任选地被取代,和/或任选地(部分)不饱和,和/或任选地在所述?#20998;?#21253;含一个或多个杂原子,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;
(c)C6-C12亚芳基,其中所述亚芳基任选地被取代;
(d)C6-C12亚杂芳基,其中所述亚杂芳基包含1个、2个或3个独立地选自O、N和S的杂原子,和/或其中所述亚杂芳基任选地被取代;
(e)C7-C12亚烷基芳基,其中所述亚烷基芳基任选地被取代,和/或其中所述亚烷基芳基的烷基部分为线性的或支化的,并且任选地(部分)不饱和,和/或任选地被一个或多个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;并且
(f)C7-C12亚烷基杂芳基,其中所述亚烷基杂芳基包含1个、2个或3个独立地选自O、N和S的杂原子,和/或其中所述亚烷基杂芳基任选地被取代,和/或其中所述亚烷基杂芳基的烷基部分为线性的或支化的,并且任选地(部 分)不饱和,和/或任选地被一个或多个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;
POL表?#23616;?#22343;分子量Mw为约300-约25000的聚合物核心;
a=2-64;并且
b=1-50。

2.  权利要求1的聚合物,其中所述聚合物核心POL的重均分子量Mw为约300至约5000。

3.  权利要求1或2的聚合物,其中所述聚合物核心POL基于或选自支化的、超支化的、多臂的、树状的或星型(共)聚合物。

4.  权利要求3的聚合物,其中所述(共)聚合物具有2-64个末端氨基。

5.  权利要求4的聚合物,其中所述氨基为伯氨基。

6.  权利要求1-5中?#25105;?#39033;的聚合物,其中所述聚合物核心POL基于或选自PEI、PAMAM、PPI、PEAN和PEAC。

7.  权利要求6的聚合物,其中所述PEI由通式(5a)和(5b)表示:


其中n为使所述PEI的重均分子量Mn为约600-约3000的值。

8.  权利要求6的聚合物,其中所述聚合物核心POL基于或选自由通式(6)-(9)表?#38236;?#32858;合物:
N(R8)3-n[(CR92)m-N(R10R11)]n
               (6)
[(R10R11)N-(CR92)m]2N-P-N[(CR92)m-N(R10R11)]2
               (7)
N(R8)3-n[(CR92)m-C(O)N(R9)-(CR92)m-N(R12R13)]n
               (8)
[(R12R13)N-(CR92)m-N(R9)C(O)-(CR92)m]2N-P-N[(CR92)-C(O)NH-(CR92)m-N(R12R13)]2
               (9)
其中:
R8为氢原子、线性的或支化的C1-C20烷基或-[(CR142)q-X]o-R15,其中X为O或N(R8);
m为2、3或4;
n为2或3;
o为1-10;
q为2、3或4;
P为-(CR92)m-、C6-C12亚芳基、C6-C12亚环烷基或[(CR142)q-X]p-C(R14)2]-,其中X为O或N(R8)并且p为1-10;
R9为氢原子或者线性的或支化的C1-C6烷基;
R10和R11独立地为氢原子、线性的或支化的C1-C6烷基或式-(CR142)qNR16R17的基团,条件是R10和R11不?#38469;?#32447;性的或支化的C1-C6烷基;
R16和R17独立地为氢原子、线性的或支化的C1-C6烷基或式-(CR142)qNR18R19的基团,条件是R16和R17不?#38469;?#32447;性的或支化的C1-C6烷基;
R18和R19独立地为氢原子、线性的或支化的C1-C6烷基或式-(CR142)qNR20R21的基团,条件是R18和R19不?#38469;?#32447;性的或支化的C1-C6烷基;
R20和R21独立地为氢原子,或者线性的或支化的C1-C6烷基,条件是R20和R21不?#38469;?#32447;性的或支化的C1-C6烷基;
R22为氢原子或甲基,条件是至少一个R22为氢原子;
R15为氢,或者线性的或支化的C1-C20烷基,或者如上所定义的-[(CR142)q-X]o-R15;
R12和R13独立地为氢原子、线性的或支化的C1-C6烷基或式-(CR92)m-C(O)NH-(CR92)m-N(R23R24)的基团,条件是R12和R13不?#38469;?#32447;性的或支化的C1-C6烷基;
R23和R24独立地为氢原子、线性的或支化的C1-C6烷基或式-(CR92)m-C(O)NH-(CR92)m-N(R25R26)的基团,条件是R21和R22不?#38469;?#32447;性的或支化的C1-C6烷基;
R25和R26独立地为氢原子、线性的或支化的C1-C6烷基或式-(CR92)m-C(O)NH-(CR92)m-N(R27R28)的基团,条件是R25和R26不?#38469;?#32447;性的或支化的C1-C6烷基;
R27和R28独立地为氢原子,或者线性的或支化的C1-C6烷基,条件是R27和R28不?#38469;?#32447;性的或支化的C1-C6烷基。

9.  制备通式(1)或(2)的PA聚合物的方法,所述方法包括以下步骤:
(1)将通式(12)的单体(I):

其中R1、A和R2如在权利要求1中所定义,与通式(13)的单体(II)或通式(14)的单体(III)反应:
(H2N)-R3
               (13)
HR3N-R5-NR3H
               (14)
其中R3和R5如在权利要求1中所定义,所述反应以约1.5:1至约10:1的单体(I):单体(II)的摩尔比进行,以形成通式(15)或(16)的大分子单体:

其中b如在权利要求1中所定义;以及
(2)将通式(15)或(16)的大分子单体与式(17)的聚合物反应;
[(R42)N]a-POL
               (17)
其中a和R4如在权利要求1中所定义,并且其中至少一个R4为H。

10.  通式(1)或(2)的PA聚合物,其可通过权利要求9的方法获得。

11.  纳米凝胶,其包含权利要求1-8或10中?#25105;?#39033;的PA聚合物。

12.  权利要求11的纳米凝胶,其中所述纳米凝胶包含生物活性组分。

13.  权利要求12的纳米凝胶,其中所述生物活性组分选自RNA(特别是siRNA和miRNA)或者其衍生物或片段、DNA或者其衍生物或片段、(寡)肽及其衍生物,以及蛋白质及其衍生物。

14.  制备权利要求11的纳米凝胶的方法,其中将通式(1)或(2)的PA聚合物交联。

15.  权利要求14的方法,其中所述交联通过紫外辐射进行。

16.  通式(3)和(4)的毫微粒:

其中R1、R2、R3、R4、R5、A、POL、a和b如在权利要求1中所定义;
R6选自:
(a)C1-C40亚烷基,其中所述亚烷基可为线性的或支化的,并且任选地被取代,和/或任选地(部分)不饱和,和/或任选地被一个或多个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S,和/或其中所述亚烷基被一个或多个-S-S-基团间断;或者
(b)C3-C40亚环烷基,其中所述亚环烷基任选地被取代,和/或任选地(部分)不饱和,和/或任选地在所述?#20998;?#21253;含一个或多个杂原子,其中所述杂原子独立地选自O、N和S,和/或其中所述亚环烷基被一个或多个所述环外的-S-S-基团间断;并且
FG是选自-OH、-OR7、-NH2、-NH(R7)、-N(R7)2、-C(O)OR7、-C(O)R7、-C(O)NHR7和-C(O)NR72的官能团,其中R7独立地选自:
(a")H;
(b")C1-C10烷基,其中所述烷基可为线性的或支化的,并且任选地被取代,和/或任选地(部分)不饱和,和/或任选地被1个、2个或3个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;
(c")C3-C12环烷基,其中所述环烷基任选地被取代,和/或任选地(部分)不饱和,和/或任选地在所述?#20998;?#21253;含1个、2个或3个杂原子,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;
(d")C6-C12芳基,其中所述芳基任选地被取代;
(e")C6-C12杂芳基,其中所述杂芳基包含1个、2个或3个独立地选自O、N和S的杂原子,和/或其中所述杂芳基任选地被取代;
(f")C7-C14烷基芳基,其中所述烷基芳基任选地被取代,和/或其中所述烷基芳基的烷基部分为线性的或支化的,并且任选地(部分)不饱和,和/或任选地被1个、2个或3个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;以及
(g")C7-C14烷基杂芳基,其中所述烷基杂芳基包含1个、2个或3个独立地选自O、N和S的杂原子,和/或其中所述烷基杂芳基任选地被取代,和/或其中所述烷基杂芳基的烷基部分为线性的或支化的,并且任选地(部分)不饱和,和/或任选地被1个、2个或3个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S。

17.  制备毫微粒的方法,其包括将通式(1)或(2)的PA聚合物与式(26a)或(26b)的?#32422;?#21453;应的步骤:
FG-R6-NHR30
               (26a)
FG-R6-SH
               (26b)
其中R6和FG如在权利要求16中所定义,FG任选地为H,并且R30独立地选自:
(a)H;
(b)C1-C10烷基,其中所述烷基可为线性的或支化的,并且任选地被取代,和/或任选地(部分)不饱和,和/或任选地被1个、2个或3个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;
(c)C3-C12环烷基,其中所述环烷基任选地被取代,和/或任选地(部分)不饱和,和/或任选地在所述?#20998;?#21253;含1个、2个或3个杂原子,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;
(d)C6-C12芳基,其中所述芳基任选地被取代;
(e)C6-C12杂芳基,其中所述杂芳基包含1个、2个或3个独立地选自O、N和S的杂原子,和/或其中所述杂芳基任选地被取代;
(f)C7-C14烷基芳基,其中所述烷基芳基任选地被取代,和/或其中所述烷基芳基的烷基部分为线性的或支化的,并且任选地(部分)不饱和,和/或任选地被1个、2个或3个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;以及
(g)C7-C14烷基杂芳基,其中所述烷基杂芳基包含1个、2个或3个独立地选自O、N和S的杂原子,和/或其中所述烷基杂芳基任选地被取代,和/或其中所述烷基杂芳基的烷基部分为线性的或支化的,并且任选地(部分)不饱和,和/或任选地被1个、2个或3个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S。

18.  表面修饰的纳米凝胶,其通过包括下列步骤的方法获得:
(1)将通式(1)或(2)的PA聚合物交联;
(2)任选地将纳米凝胶用生物活性组分负载,所述生物活性组分优选选自RNA(特别是siRNA)或者其衍生物或片段、DNA或者其衍生物或片段、(寡)肽及其衍生物,以及蛋白质及其衍生物;以及
(3)将纳米凝胶与?#32422;罵-CFG或R’-SH反应,
其中:
R和R’选自2-巯基?#19968;?-羟基?#19968;EG(聚氧化乙烯)基团和PPO(聚氧化丙烯)基团,其中所述PEG基团和所述PPO基团的数均分子量Mn为约500-约10000;
CFG是能够与基团FG形成?#24067;?#38190;的基团,其中FG如在权利要求16中所 定义;并且
其中步骤(1)、(2)和(3)的顺序为:(1)-(2)-(3)、(1)-(3)-(2)或(3)-(1)-(2)。

说明书

说明书纳米凝胶
发明领域
本发明涉及聚合杂交核心-壳纳米载体(polymeric hybrid core-shell nanocarrier)?#32435;?#35745;和制备,其中将所述核?#32435;?#35745;为结合治疗性有效负载(therapeutic payload)(优选治疗性核苷酸、肽、蛋白质和小分子药物),并?#21307;?#25152;述壳设计为保护所述治疗性有效负载,稳定纳米载体,提供?#26434;?#31995;统?#32435;?#29289;相容性,使其能够靶向特定细胞和组织,并且促进治疗性有效负载从纳米载体的有效的细胞内释放。
更特别地,本发明涉及PA聚合物、由所述PA聚合物制备的毫微粒(nanoparticle)和纳米凝胶,其中所述纳米凝胶可包含选自RNA(特别是siRNA或miRNA)或者其衍生物或片段、DNA或者其衍生物或片段、(寡)肽及其衍生物,以及蛋白质及其衍生物?#32435;?#29289;活性组分。
发明背景
本发明的发明领域为siRNA的递送(siRNA意指小干扰RNA,其也称作短干扰RNA或沉默RNA)和miRNA的递送(miRNA意指微RNA)。
由于RNA干扰(RNAi)以序列特异性方式沉默基因表达的能力,其代表影响致病基因表达的有前景的策略。筛选不同的siRNA序?#26800;?#33268;了数种不同治疗应用的有潜力的治疗寡核苷酸的确认。然而,siRNA的递送是主要问题。在生物流体中,裸siRNA通过核酸酶快速降解(半衰期为大约几分钟),并且通常需要载体来在细胞外环?#25345;?#25552;供防止降解的充分保护,并且确保在细胞内摄取和处理期间有效地穿过细胞屏障。特别地,高度负电荷的siRNA仅可十分困难的穿过细胞膜。此外,一旦在细胞内液中,siRNA需要从载体上有效地卸载,以表现其治疗活性。因此,已研究了多种用于有效递送RNA、DNA和siRNA的非病毒聚合物载体。
全?#23458;?#36807;援引加入的US 2002/0131951(现在为US 6.998.115)、US 2004/0071654(现在为US 7.427.394)、US 2005/0244504和US 2010/0036084,公开了由双丙烯酰胺和官能化的伯?#20998;?#22791;的聚(氨基酯)聚合物。在它们的阳 离?#26377;?#24335;中,聚(氨基酯)聚合物与DNA分子或其片段形成络合物。
通过援引加入的US 2008/0242626公开了基于双丙烯酰胺和官能化的伯胺的聚(氨基酯)聚合物,其中将所述聚(氨基酯)聚合物进?#24515;?#31471;修饰。其中所述聚(氨基酯)聚合物是氨基取代的,将聚(氨基酯)聚合物与亲电体反应。其中所述聚(氨基酯)聚合物是丙烯酸酯取代的,将聚(氨基酯)聚合物与亲核体反应。这些末端修饰的聚(氨基酯)聚合物用于DNA和RNA的递送。
通过援引加入的WO 2010/065660公开了可生物降解的聚二硫化胺(polydisulfide amine)及其与如RNA、DNA、siRNA和其它寡核苷酸的络合物。
通过援引加入的US 2010/0041739公开了可用于如DNA递送的聚亚烷基亚胺聚合物。
通过援引加入的US 2010/0028445公开了包含侧挂(pendant)二硫基、侧挂巯基或侧挂活化巯基的聚(酰胺胺)聚合物,以及制备这样的聚(酰胺胺)聚合物的方法,其中将双丙烯酰基单体与伯胺和/或仲二胺反应,其中所述?#20998;械?#19968;个包含二硫基。通过在聚(酰胺胺)链之间形成二硫基,可将聚(酰胺胺)聚合物转化为水凝胶。
通过援引加入的C.Lin等人,Bioconjug.Chem.18,138-145,2007,公开了包含二硫键的聚(酰胺胺),其通过伯胺和包含二硫基的N,N’-胱胺双丙烯酰胺的Michael加成来制备。
通过援引加入的L.J.van der Aa等人,J.Control.Release148,e85,2010,公开了包含二硫键的聚(酰胺胺),其通过伯氨基醇、包含二硫基的N,N’-胱胺双丙烯酰胺和1,2-二氨基乙烷的Michael加成来制备。
通过援引加入的R.Namgung等人,Biotechnol.Lett.32,755,2010,公开了包含二硫键的聚(酰胺胺),其通过4-氨基-1-丁醇和包含二硫基的N,N’-胱胺双丙烯酰胺的Michael加成来制备。
通过援引加入的P.vader等人,Pharm.Res.28,1013,2011,公开了包含二硫键的聚(酰胺胺),其通过4-氨基-1-丁醇、包含二硫基的N,N’-胱胺双丙烯酰胺和1,2-二氨基乙烷的Michael加成来制备。
通过援引加入的D.Vercauteren等人,Biomaterials32,3072,2011,公开了包含二硫键的聚(酰胺胺),其通过4-氨基-1-丁醇和包含二硫基的N,N’-胱胺双丙烯酰胺的Michael加成来制备。
现有?#38469;?#20013;已知的阳离子聚合物系统仍具有一些缺点。特别地,在治疗配方中需要存在过量(细胞?#38236;?聚合物、治疗负载的纳米凝胶经常的低控制和低贮藏稳定性,以及在治疗性有效负载(核苷酸)从络合物的胞内体逃逸和细胞溶质卸载中有限的效率,仍是本领域的主要挑战。
发明概述
本发明涉及通式(1)和(2)的PA(聚丙烯基)聚合物:

其中:
A独立地选自直接的碳-碳单键(即其中A不存在的结构)、O、N(R1)和S;
R1独立地选自H和CH3;
R2独立地选自:
(a)C1-C40亚烷基,其中所述亚烷基可为线性的或支化的,并且任选地被取代,和/或任选地(部分)不饱和,和/或任选地被一个或多个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S,和/或其中所述亚烷基被一个或多个-S-S-基团间断;
(b)C3-C40亚环烷基,其中所述亚环烷基任选地被取代,和/或任选地(部分)不饱和,和/或任选地在所述?#20998;?#21253;含一个或多个杂原子,其中所述杂原子独立地选自O、N和S,和/或其中所述亚环烷基被一个或多个所述环外的-S-S-基团间断;
(c)C6-C40亚芳基,其中所述亚芳基任选地被取代;
(d)C6-C40亚杂芳基,其中所述亚杂芳基包含1个、2个或3个独立地选自O、N和S的杂原子,和/或其中所述亚杂芳基任选地被取代;
(e)C7-C40亚烷基芳基,其中所述亚烷基芳基任选地被取代,和/或其中所述亚烷基芳基的烷基部分为线性的或支化的,并且任选地(部分)不饱和,和/或任选地被一个或多个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S,和/或其中所述亚烷基芳基的烷基部分被一个或多个-S-S-基团间断;
(f)C7-C40亚烷基杂芳基,其中所述亚烷基杂芳基包含1个、2个或3个独立地选自O、N和S的杂原子,和/或其中所述亚烷基杂芳基任选地被取代,和/或其中所述亚烷基杂芳基的烷基部分为线性的或支化的,并且任选地(部分)不饱和,和/或任选地被一个或多个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S,和/或其中所述亚烷基杂芳基的烷基部分被一个或多个-S-S-基团间断;以及
(g)其中两个C7-C40亚(杂)芳基和/或C7-C40亚烷基(杂)芳基通过-S-S-基团相互连接的基团,其中所述亚烷基(杂)芳基的烷基部分为线性的或支化的,并且任选地(部分)不饱和,和/或任选地被一个或多个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;
R3独立地选自:
(a)H;
(b)C1-C10烷基,其中所述烷基可为线性的或支化的,并且任选地被取代,和/或任选地(部分)不饱和,和/或任选地被1个、2个或3个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;
(c)C3-C12环烷基,其中所述环烷基任选地被取代,和/或任选地(部分)不饱和,和/或任选地在所述?#20998;?#21253;含1个、2个或3个杂原子,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;
(d)C6-C12芳基,其中所述芳基任选地被取代;
(e)C6-C12杂芳基,其中所述杂芳基包含1个、2个或3个杂原子,其中所述杂原子独立地选自O、N和S,并且其中所述杂芳基任选地被取代;
(f)C7-C14烷基芳基,其中所述烷基芳基任选地被取代,和/或其中所述烷基芳基的烷基部分为线性的或支化的,并且任选地(部分)不饱和,和/或 任选地被1个、2个或3个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;以及
(g)C7-C14烷基杂芳基,其中所述烷基杂芳基包含1个、2个或3个独立地选自O、N和S的杂原子,和/或其中所述烷基杂芳基任选地被取代,和/或其中所述烷基杂芳基的烷基部分为线性的或支化的,并且任选地(部分)不饱和,和/或任选地被1个、2个或3个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;
R4独立地选自:
(a)H;
(b)C1-C10烷基,其中所述烷基可为线性的或支化的;
(c)C3-C12环烷基;
(d)C6-C14芳基;
(e)C6-C14杂芳基,其中所述杂芳基包含1个、2个或3个独立地选自O、N和S的杂原子;
(f)C7-C14烷基芳基;以及
(g)C7-C14烷基杂芳基,其中所述烷基杂芳基包含1个、2个或3个独立地选自O、N和S的杂原子;
R5独立地选自:
(a)C1-C12亚烷基,其中所述亚烷基可为线性的或支化的,并且任选地被取代,和/或任选地(部分)不饱和,和/或任选地被一个或多个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;
(b)C3-C12亚环烷基,其中所述亚环烷基任选地被取代,和/或任选地(部分)不饱和,和/或任选地在所述?#20998;?#21253;含一个或多个杂原子,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;
(c)C6-C12亚芳基,其中所述亚芳基任选地被取代;
(d)C6-C12亚杂芳基,其中所述亚杂芳基包含1个、2个或3个独立地选自O、N和S的杂原子,和/或其中所述亚杂芳基任选地被取代;
(e)C7-C12亚烷基芳基,其中所述亚烷基芳基任选地被取代,和/或其中所述亚烷基芳基的烷基部分为线性的或支化的,并且任选地(部分)不饱和, 和/或任选地被一个或多个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;以及
(f)C7-C12亚烷基杂芳基,其中所述亚烷基杂芳基包含1个、2个或3个独立地选自O、N和S的杂原子,和/或其中所述亚烷基杂芳基任选地被取代,和/或其中所述亚烷基杂芳基的烷基部分为线性的或支化的,并且任选地(部分)不饱和,和/或任选地被一个或多个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;
POL表?#23616;?#22343;分子量Mw为约300-约25000的聚合物核心;
a=2-64;并且
b=1-50。
本发明还涉及通式(3)和(4)的毫微粒:

其中R1、R2、R3、R4、R5、A、POL、a和b如上所定义,并且其中R6选自:
(a)C1-C40亚烷基,其中所述亚烷基可为线性的或支化的,并且任选地被取代,和/或任选地(部分)不饱和,和/或任选地被一个或多个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S,和/或其中所述亚烷基被一个或多个-S-S-基团间断;或者
(b)C3-C40亚环烷基,其中所述亚环烷基任选地被取代,和/或任选地(部分)不饱和,和/或任选地在所述?#20998;?#21253;含一个或多个杂原子,其中所述杂原子独立地选自O、N和S,和/或其中所述亚环烷基被一个或多个所述环外的-S-S-基团间断;并且
FG为官能团。
本发明还涉及包含通式(1)或(2)的PA(聚丙烯基)聚合物的纳米凝胶,其中通过将所述PA聚合物交联形成所述纳米凝胶。
本发明还涉及具有修饰的表面的纳米凝胶。
本发明还涉及包含生物活性组分的纳米凝胶。
本发明还涉及纳米凝胶的用途,以及纳米凝胶在生物活性组分向哺乳动物的递送?#26800;?#29992;途。
本发明还涉及包含纳米凝胶和药学可接受的载体的药物组合物。
本发明还涉及向哺乳动物递送生物活性组分的方法,其中将纳米凝胶或包含这样的纳米凝胶的组合物向哺乳动物给药。
附图说明
图1显示如在EtBr(溴化乙锭)实验中建立的,PA聚合物结合siRNA的能力。低荧光信号说明有效的siRNA屏蔽(保护)。
图2显示如在EtBr(溴化乙锭)实验中建立的,包含PA聚合物的纳米凝胶结合并屏蔽siRNA的能力。
图3显示纳米凝胶具有比PA聚合物更高的结合并屏蔽siRNA的能力(在?#32454;?#30340;聚合物/siRNA比下比?#31995;?2号和第4号样品,以及第13号和第3号样品)。
图4显示PA聚合物在H1299细胞?#26800;?#22522;因沉默效率。深灰色棒显示荧光素酶表达百分?#21462;?#27973;灰色棒为用非敏感siRNA的对照。
图5显示PA聚合物在H1299细胞?#26800;?#22522;因沉默效率。
图6显示一些带有不同核心组合物的纳米凝胶的基因沉默效率。
图7显示?#26434;赑A聚合物(第4号样品)和纳米凝胶(第12号样品)的H1299细胞的细胞活力曲线,以浓度的函数的形式。
图8显示在血清条件下,通过siRNA负载的纳米凝胶在不同的聚合物/siRNA比(w/w)和不同的siRNA剂量(ng每100μL转染培养基)下,H1299细胞的荧光素酶沉默。
图9显示在血清条件下,通过siRNA负载的纳米凝胶(siRNA72nM)在不同的聚合物/siRNA混合比下,H1299细胞的荧光素酶沉默。
图10显示通过其表面用大量PEG(相?#26434;?#32435;米凝胶的聚合物的重量%)修饰的siRNA负载的纳米凝胶(第12号样品)的H1299细胞的荧光素酶沉默。
图11显示通过siRNA负载的纳米凝胶(第12号样品)的H1299细胞的荧光素酶沉默,分别使用新鲜制备的siRNA-纳米凝胶溶液、冻融的siRNA-纳米凝胶溶液和冻干的siRNA-纳米凝胶溶液。黑色棒给出使用无义编码的siRNA,对照试验的荧光素酶表达(设为100%)。证明了三种不同处理的配?#25509;?#21453;义siRNA表现相等的荧光素酶沉默活性。
发明详述
如本发明说明书和权利要求书中所使用的动词“包含”及其词形变化形式以其非限制性含义使用,意指包含该词语后的条目,但是不排除未具体提到的条目。此外,用不定冠词“a”或“an”指代的元素不排除存在多于一个该元素的可能,除非文中明确要求该元素有?#21307;?#26377;一个。因此,不定冠词“a”或“an”通常意指“至少一个”。
术语“siRNA”还包含“miRNA”(微RNA,micro RNA)。
PA聚合物
根据本发明,式(1)和(2)的聚合物的重均分子量Mw优选为约10000g/mol-约1000000g/mol,更优选约20000g/mol-约500000g/mol。
根据一优选实施方案,A为N(R1)或O,最优选N(R1)。
根据本发明的另一优选实施方案,R1为H。
根据另一优选实施方案,R2选自:
(a1)C1-C20亚烷基,优选C2-C12亚烷基,其中所述亚烷基可为线性的或支化的,并且任选地被取代,和/或任选地(部分)不饱和,和/或任选地被一个或多个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S,和/或其中所述亚烷基被一个或多个-S-S-基团间断;
(b1)C3-C20亚环烷基,优选C5-C12亚环烷基,其中所述亚环烷基任选地被取代,和/或任选地(部分)不饱和,和/或任选地在所述?#20998;?#21253;含1个、2个或3个杂原子,其中所述杂原子独立地选自O、N和S,和/或其中所述亚环烷基被一个或多个所述环外的-S-S-基团间断;
(c1)C6-C20亚芳基,优选C6-C12亚芳基,其中所述亚芳基任选地被取代;
(d1)C6-C20亚杂芳基,优选C6-C12亚杂芳基,其中所述亚杂芳基包含1个、2个或3个独立地选自O、N和S的杂原子,和/或其中所述亚杂芳基任选地被取代;
(e1)C7-C20亚烷基芳基,优选C7-C12亚烷基芳基,其中所述亚烷基芳基任选地被取代,和/或其中所述亚烷基芳基的烷基部分为线性的或支化的,并且任选地(部分)不饱和,和/或任选地被1个、2个或3个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S,和/或其中所述亚烷基芳基的烷基部分被一个或多个-S-S-基团间断;
(f1)C7-C20亚烷基杂芳基,优选C7-C12亚烷基杂芳基,其中所述亚烷基杂芳基包含1-3个独立地选自O、N和S的杂原子,和/或其中所述亚烷基杂芳基任选地被取代,和/或其中所述亚烷基杂芳基的烷基部分为线性的或支化的,并且任选地(部分)不饱和,和/或任选地被一个或多个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S,和/或其中所述亚烷基杂芳基的烷基部分被一个或多个-S-S-基团间断;并且
(g1)其中两个C7-C20亚(杂)芳基和/或C7-C20亚烷基(杂)芳基,优选两个C7-C12亚(杂)芳基和/或C7-C12亚烷基(杂)芳基通过-S-S-基团相互连接的基团,其中所述亚烷基(杂)芳基的烷基部分为线性的或支化的,并且任选地(部分)不饱和,和/或任选地被一个或多个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S。
根据本发明的另一优选实施方案,R2选自组(a1)或组(b1),更优选自组(a1)?#26800;?#22522;团,特别是组(a1)?#26800;?#20854;中被一个或多个-S-S-基团间断的C1-C40亚烷基。
根据一优选实施方案,当R3为取代的C1-C10烷基?#20445;?#35813;烷基被选自-OH、-OR7、-NH2、-NH(R7)、-N(R7)2、-C(O)OR7、-C(O)R7、-C(O)NHR7和-C(O)NR72的基团取代,其中R7独立地选自:
(a)H;
(b)C1-C10烷基,其中所述烷基可为线性的或支化的,并且任选地被取代,和/或任选地(部分)不饱和,和/或任选地被1个、2个或3个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;
(c)C3-C12环烷基,其中所述环烷基任选地被取代,和/或任选地(部分)不饱和,和/或任选地在所述?#20998;?#21253;含1个、2个或3个杂原子,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;
(d)C6-C12芳基,其中所述芳基任选地被取代;
(e)C6-C12杂芳基,其中所述杂芳基包含1个、2个或3个独立地选自O、N和S的杂原子,和/或其中所述杂芳基任选地被取代;
(f)C7-C14烷基芳基,其中所述烷基芳基任选地被取代,和/或其中所述烷基芳基的烷基部分为线性的或支化的,并且任选地(部分)不饱和,和/或任选地被1个、2个或3个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;以及
(g)C7-C14烷基杂芳基,其中所述烷基杂芳基包含1个、2个或3个独立地选自O、N和S的杂原子,和/或其中所述烷基杂芳基任选地被取代,和/或其中所述烷基杂芳基的烷基部分为线性的或支化的,并且任选地(部分)不饱和,和/或任选地被1个、2个或3个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S。
根据一优选实施方案,当R3为取代的C3-C12环烷基?#20445;?#35813;环烷基具有选自-OH、-OR7、-NH2、-NH(R7)、-N(R7)2、-C(O)OR7、-C(O)R7、-C(O)NHR7和-C(O)NR72的外?#19968;?#22242;(pending group),其中R7如上所定义。
根据一优选实施方案,当R3为取代的C6-C12芳基、C6-C12杂芳基、C7-C14烷基芳基或C7-C14烷基杂芳基?#20445;?#25152;述烷基芳基或烷基杂芳基被取代,优选地被1个、2个或3个-OH、-OR7、-NH2、-NH(R7)、-N(R7)2、-C(O)OR7、-C(O)R7、-C(O)NHR7和-C(O)NR72取代,其中R7如上所定义。
在本发明由通式(1)和(2)表?#38236;腜A聚合物中,聚合物核心POL优选基于或选自支化的、超支化的、多臂的(multi-arm)、树状或星状的(共)聚合物,所述(共)聚合物优选具有2-64个,更优选2-32个,甚至更优选2-16个末端氨基,优选伯氨基。因此,a为2-64,优选2-32,并且特别是2-16。(共)聚合物可包含不同的线性的或支化的间隔基(spacer),所述间隔基包含一个或多个选自O、N和S的杂原子,其优选为O和N。
根据本发明,b为1-50,优选1-30,并且特别是1-10。
在本领域中,以下是熟知的:树状(共)聚合物并非总是完全支化的,因此可能具有超支化的结构。支化度(DB)可通过以下定义:
DB=(D+T)(D+L+T)]]>
其中D为树状的数量,L为线性的数量,并且T为末端单元的数量。完全的树状聚合物的DB为1,然而超支化(共)聚合物的DB通常为0.4-0.5,甚至高达0.9。在本发明中,术语“树状聚合物?#24065;?#29702;解为包括“完全的支化树状聚合物?#24065;?#21450;“不完全的支化树状聚合物”(其也称作“超支化的(共)聚合物”)。或者,术语“超支化(共)聚合物”还可包括“真正的”超支化(共)聚合物。即,有目的地制备具有超支化结构的高分子。术语“树状聚合物?#24065;?#29702;解为既包括树状同聚物,也包括树状共聚物。术语“共聚物”包括至少由两种不同的单体构成的聚合物。
超支化聚合物可在至少一种能够引发支化的多官能化单体的存在下,由单体?#25105;?#22320;聚合来获得。这样的合成路线由以?#28388;?#31034;:Hawker和Devonport在“Step-Growth Polymers for High-Performance Materials:New Synthetic Methods”中,Hedrick,J.L.和Labadie,J.W.,Eds.,Am.Chem.Soc.,Washington,D.C.,1996,pp.191-193.Hult等人,在“Advances in Polymer Science"Vol.143(1999)中,Roovers,J.,Ed.,Springer,New York,pp.1-34,这些提供了超支化聚合物的总结。
高度支化的树状聚合物例如在“Polymeric Materials Encyclopedia”,Vol.5(1996),J.C.Salamone,Ed.,CRC Press,New York,pp.3049-3053中所?#33268;邸?#26641;状的聚合物通常为非线性的构造,并?#20918;?#36136;上形状为球状。使用分立的分?#33014;?#25104;方法制备高度支化的纯化合物或树状聚合物。如Hawker和Devonport在“Step-Growth Polymers for High-Performance Materials:New Synthetic Methods"中,Hedrick,J.L.和Labadie,J.W.,Eds.,在Am.Chem.Soc.,Washington,D.C.,1996,pp.186-196中所?#33268;郟?#22914;果高分子具有依照严格?#36127;甕及?#30340;高度规则支化,则其为树状聚合物。树状聚合物通常为单分散,并且以多步的方法并在各个阶?#26410;?#21270;的形式制备。Roovers和Comanita在“Advances in Polymer Science”,Vol.142(1999),Roovers,J.,Ed.,Springer,New York,pp.179-228中也?#33268;?#20102;树状聚合物的构造。树状聚合物由核心分子组成,核心分子限定了分子的对称中心,以及支化层。Tomalia等人,Angew. Chem.Int.Ed.Eng.,29(1990),138-175中公开了由引发核心(initiator core)和支化基团构成的“星型(starburst)”树状聚合物。
优选地,聚合物核心POL是基于PEI(从如Denditrech,Inc.市售可得)、Astramol聚合物(DSM)、JEFFAMINE聚合物(Huntsman)、PAMAM聚合物(有时还称作PANAM聚合物)、PPI聚合物、PEAN聚合物和PEAC聚合物。术语“PEI”指聚乙烯亚胺。术语“PAMAM”指聚(酰胺胺)聚合物,其以商品名Starburst市售可得。术语“PPI?#24065;?#25351;聚丙烯亚胺聚合物。术语“PEAN”指聚(酯胺)聚合物。术语“PEAC”指聚(醚胺)聚合物。所有这些聚合物?#38469;?#26412;领域熟知的。因此,聚合物核心POL优选基于或选自PEI、PAMAM、PPI、PEAN和PEAC。
根据本发明,聚合物核心POL的重均分子量Mw优选为约300-约5000,更优选约600-约5000。
优选用于聚合物核心POL的聚合物为市售可得的,并且重均分子量Mw为约440-约5000的JEFFAMINET系?#26800;?#32858;合物(聚醚胺)。JEFFAMINET聚合物的适合类型包括T-403(Mw=440)和T-3000(Mw=3000)。
可用于聚合物核心POL的另一组优选的聚合物为PEI聚合物(PEI’s)。PEI可为线性的或支化的结构。线性的PEI是市售可得的(jetPEI,Polyplus-Transfection Co.;Exgen500,Fermentas Co.),并且通常由聚(2-?#19968;?2-噁唑烷)水解来制备。支化的PEI聚合物由氮丙啶制备,并且这些聚合物具有高度支化的结构,并且包含约25%伯胺基、约50%肿胺基和约25%叔胺基。优选地,PEI的重均分子量Mn为约600-约3000,更优选为约600-约2000。线性的PEI聚合物可由通式(5a)表示:

支化的PEI聚合物可由通式(5b)表示:

其中n是使PEI的重均分子量Mn为约300-约5000,更优选约300-约3000,甚至更优选约600-约2500的值。这样的PEI聚合物例如从Sigma-Aldrich可得。
用于聚合物核心POL的另一组优选的聚合物为聚(酰胺胺)超支化聚合物和树状聚合物,优选第1-4代的那些,更优选第1代和/或第3代的那些。这些聚合物从Dentritech,Inc.市售可得,并且重均分子量Mw为约1400(第1代)-约15000(第4代)。
用于聚合物核心POL的另一组优选的聚合物由通式(6)-(9)表示:
N(R8)3-n[(CR92)m-N(R10R11)]n
               (6)
[(R10R11)N-(CR92)m]2N-P-N[(CR92)m-N(R10R11)]2
               (7)
N(R8)3-n[(CR92)m-C(O)N(R9)-(CR92)m-N(R12R13)]n
               (8)
[(R12R13)N-(CR92)m-N(R9)C(O)-(CR92)m]2N-P-N[(CR92)-C(O)NH-(CR92)m-N(R12R13)]2
               (9)
其中:
R8为氢原子、线性的或支化的C1-C20烷基或-[(CR142)q-X]o-R15,其中X为O或N(R8);
m为2、3或4;
n为2或3;
o为1-10;
q为2、3或4;
P为-(CR92)m-、C6-C12亚芳基、C6-C12亚环烷基或-[(CR142)q-X]p-C(R14)2]-,其中X为O或N(R8),并且p为1-10;
R9为氢原子,或者线性的或支化的C1-C6烷基;
R10和R11独立地为氢原子、线性的或支化的C1-C6烷基或者式-(CR142)qNR16R17的基团,条件是R10和R11不?#38469;?#32447;性的或支化的C1-C6烷基;
R16和R17独立地为氢原子、线性的或支化的C1-C6烷基或式-(CR142)qNR18R19的基团,条件是R16和R17不?#38469;?#32447;性的或支化的C1-C6烷基;
R18和R19独立地为氢原子、线性的或支化的C1-C6烷基或式-(CR142)qNR20R21的基团,条件是R18和R19不?#38469;?#32447;性的或支化的C1-C6烷基;
R20和R21独立地为氢原子,或者线性的或支化的C1-C6烷基,条件是R20和R21不?#38469;?#32447;性的或支化的C1-C6烷基;
R22为氢原子或甲基,条件是至少一个R22为氢原子;
R15为氢,或者线性的或支化的C1-C20烷基,或者如上所定义的-[(CR142)q-X]o-R15;
R12和R13独立地为氢原子、线性的或支化的C1-C6烷基或式-(CR92)m-C(O)NH-(CR92)m-N(R23R24)的基团,条件是R12和R13不?#38469;?#32447;性的或支化的C1-C6烷基;
R23和R24独立地为氢原子、线性的或支化的C1-C6烷基或式-(CR92)m-C(O)NH-(CR92)m-N(R25R26)的基团,条件是R23和R24不?#38469;?#32447;性的或支化的C1-C6烷基;
R25和R26独立地为氢原子、线性的或支化的C1-C6烷基或式-(CR92)m-C(O)NH-(CR92)m-N(R27R28)的基团,条件是R25和R26不?#38469;?#32447;性的或支化的C1-C6烷基;
R27和R28独立地为氢原子,或者线性的或支化的C1-C6烷基,条件是R27和R28不?#38469;?#32447;性的或支化的C1-C6烷基。
在式(6)-(9)中,用于聚合物核心POL的优选聚合物基团为其?#26032;?#36275;以下的基团:
R8和R15为氢原子或-[(CR142)q-X]o-R15,其中X为NH;
R9、R20、R21和R21为氢原子;
R10和R11独立地为氢原子或式-(CR142)qNR16R17的基团;
R16和R17独立地为氢原子或式-(CR142)qNR18R19的基团;
R18和R19独立地为氢原子或式-(CR142)qNR20R21的基团;
R12和R13独立地为氢原子或式-(CR92)m-C(O)NH-(CR92)m-N(R23R24)的基团;
R23和R24独立地为氢原子或式-(CR92)m-C(O)NH-(CR92)m-N(R25R26)的基团;
R25和R26独立地为氢原子或式-(CR92)m-C(O)NH-(CR92)m-N(R27R28)的基团;并且
R27和R28独立地为氢原子。
在式(6)-(9)中,m和q优选为2。
根据本发明的PA聚合物更优选的种类可由通式(10)和(11)表示:

其中:
R1独立地选自H和CH3;
Y为O或N(R1);
r为2、3或4;
Z为-S-S-;
R29独立地选自:
(a)H;
(b)C1-C10烷基,其中所述烷基可为线性的或支化的,并且任选地被取代,和/或任选地(部分)不饱和,和/或任选地被1个、2个或3个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;
(c)C3-C12环烷基,其中所述环烷基任选地被取代,和/或任选地(部分)不饱和,和/或任选地在所述?#20998;?#21253;含1个、2个或3个杂原子,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;
(d)C6-C12芳基,其中所述芳基任选地被取代;
(e)C6-C12杂芳基,其中所述杂芳基包含1个、2个或3个独立地选自O、N和S的杂原子,和/或其中所述杂芳基任选地被取代;
(f)C7-C14烷基芳基,其中所述烷基芳基任选地被取代,和/或其中所述烷基芳基的烷基部分为线性的或支化的,并且任选地(部分)不饱和,和/或任选地被1个、2个或3个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;以及
(g)C7-C14烷基杂芳基,其中所述烷基杂芳基包含1个、2个或3个独立地选自O、N和S的杂原子,和/或其中所述烷基杂芳基任选地被取代,和/或其中所述烷基杂芳基的烷基部分为线性的或支化的,并且任选地(部分)不饱和,和/或任选地被1个、2个或3个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;所述烷基杂芳基任选地被取代,优选被1个、2个或3个-OH、-OR29、-NH2、-NH(R29)或-N(R29)2取代;
R30独立地选自:
(a)H;
(b)C1-C10烷基,其中所述烷基可为线性的或支化的,并且任选地被取代,和/或任选地(部分)不饱和,和/或任选地被1个、2个或3个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;
(c)C3-C12环烷基,其中所述环烷基任选地被取代,和/或任选地(部分)不饱和,和/或任选地在所述?#20998;?#21253;含1个、2个或3个杂原子,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;
(d)C6-C12芳基,其中所述芳基任选地被取代;
(e)C6-C12杂芳基,其中所述杂芳基包含1个、2个或3个独立地选自O、N和S的杂原子,和/或其中所述杂芳基任选地被取代;
(f)C7-C14烷基芳基,其中所述烷基芳基任选地被取代,和/或其中所述烷基芳基的烷基部分为线性的或支化的,并且任选地(部分)不饱和,和/或 任选地被1个、2个或3个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;以及
(g)C7-C14烷基杂芳基,其中所述烷基杂芳基包含1个、2个或3个独立地选自O、N和S的杂原子,和/或其中所述烷基杂芳基任选地被取代,和/或其中所述烷基杂芳基的烷基部分为线性的或支化的,并且任选地(部分)不饱和,和/或任选地被1个、2个或3个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;
R31独立地选自:
(a)H;
(b)C1-C10烷基,其中所述烷基可为线性的或支化的;
(c)C3-C12环烷基;
(d)C6-C12芳基;
(e)C6-C12杂芳基,其中所述杂芳基包含1个、2个或3个独立地选自O、N和S的杂原子;
(f)C7-C14烷基芳基;以及
(g)C7-C14烷基杂芳基,其中所述烷基杂芳基包含1个、2个或3个独立地选自O、N和S的杂原子;
R32独立地选自:
(a)C1-C12亚烷基,其中所述亚烷基可为线性的或支化的,并且任选地被取代,和/或任选地(部分)不饱和,和/或任选地被一个或多个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;
(b)C3-C12亚环烷基,其中所述亚环烷基任选地被取代,和/或任选地(部分)不饱和,和/或任选地在所述?#20998;?#21253;含一个或多个杂原子,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;
(c)C6-C12亚芳基,其中所述亚芳基任选地被取代;
(d)C6-C12亚杂芳基,其中所述亚杂芳基包含1个、2个或3个独立地选自O、N和S的杂原子,和/或其中所述亚杂芳基任选地被取代;
(e)C7-C14亚烷基芳基,其中所述亚烷基芳基任选地被取代,和/或其中所述亚烷基芳基的烷基部分为线性的或支化的,并且任选地(部分)不饱和, 和/或任选地被一个或多个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;以及
(f)C7-C14亚烷基杂芳基,其中所述亚烷基杂芳基包含1个、2个或3个独立地选自O、N和S的杂原子,和/或其中所述亚烷基杂芳基任选地被取代,和/或其中所述亚烷基杂芳基的烷基部分为线性的或支化的,并且任选地(部分)不饱和,和/或任选地被一个或多个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;并且
a=2-64;并且
b=1-50。
根据一优选实施方案,当R30为取代的C1-C10烷基?#20445;?#35813;烷基被选自-OH、-OR7、-NH2、-NH(R7)、-N(R7)2、-C(O)OR7、-C(O)R7、-C(O)NHR7和-C(O)NR72的基团取代,其中R7独立地选自:
(a)H;
(b)C1-C10烷基,其中所述烷基可为线性的或支化的,并且任选地被取代,和/或任选地(部分)不饱和,和/或任选地被1个、2个或3个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;
(c)C3-C12环烷基,其中所述环烷基任选地被取代,和/或任选地(部分)不饱和,和/或任选地在所述?#20998;?#21253;含1个、2个或3个杂原子,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;
(d)C6-C12芳基,其中所述芳基任选地被取代;
(e)C6-C12杂芳基,其中所述杂芳基包含1个、2个或3个独立地选自O、N和S的杂原子,和/或其中所述杂芳基任选地被取代;
(f)C7-C14烷基芳基,其中所述烷基芳基任选地被取代,和/或其中所述烷基芳基的烷基部分为线性的或支化的,并且任选地(部分)不饱和,和/或任选地被1个、2个或3个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;以及
(g)C7-C14烷基杂芳基,其中所述烷基杂芳基包含1个、2个或3个独立地选自O、N和S的杂原子,和/或其中所述烷基杂芳基任选地被取代,和/或其中所述烷基杂芳基的烷基部分为线性的或支化的,并且任选地(部分)不饱 和,和/或任选地被1个、2个或3个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S。
根据一优选实施方案,当R30为取代的C3-C12环烷基?#20445;?#35813;环烷基具有选自-OH、-OR7、-NH2、-NH(R7)、-N(R7)2、-C(O)OR7、-C(O)R7、-C(O)NHR7和-C(O)NR72的外?#19968;?#22242;,其中R7如上所定义。
根据一优选实施方案,当R30为取代的C6-C12芳基、C6-C12杂芳基、C7-C14烷基芳基或C7-C14烷基杂芳基?#20445;?#25152;述烷基芳基或烷基杂芳基优选地被1个、2个或3个-OH、-OR7、-NH2、-NH(R7)、-N(R7)2、-C(O)OR7、-C(O)R7、-C(O)NHR7和-C(O)NR72取代,其中R7如上所定义。
在一类更优选的通式(10)和(11)的PA聚合物中:
R1独立地选自H和CH3;
Y为N(R1);
r为2;
Z为-S-S-;
R29独立地选自H和C1-C10烷基,其中所述烷基可为线性的或支化的,并且任选地被取代,和/或任选地(部分)不饱和,和/或任选地被一个或多个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;
R30独立地选自H和C1-C10烷基,其中所述烷基可为线性的或支化的,并且任选地被取代,和/或任选地(部分)不饱和,和/或任选地被1个、2个或3个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;
R31独立地选自H和C1-C10烷基,其中所述烷基可为线性的或支化的;并且
R32为C1-C10亚烷基,其中所述亚烷基可为线性的或支化的,并且任选地被取代,和/或任选地(部分)不饱和,和/或任选地被1个、2个或3个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S。
在一类甚至更优选的通式(10)和(11)的PA聚合物中:
R1为H;
Y为N(R1);
r为2;
Z为-S-S-;
R29为H;
R30独立地选自H和C1-C10烷基,其中所述烷基为线性的,并且任选地被1个、2个或3个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;
R31为H;并且
R32为C1-C10亚烷基,其中所述亚烷基可为线性的或支化的;
在一类甚至更优选的通式(10)和(11)的PA聚合物中:
R1为H;
Y为N(R1);
r为2;
Z为-S-S-;
R29为H;
R30为C1-C10烷基,其中所述烷基为线性的,并且任选地被1个、2个或3个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;
R31为H;并且
R32为C1-C10亚烷基,其中所述亚烷基可为线性的或支化的;
在一类最优选的通式(10)和(11)的PA聚合物中:
Y为NH;
r为2;
Z为-S-S-;
R29为H;
R30为C1-C6烷基;
R31为H;并且
R32为C1-C10亚烷基,其中所述亚烷基为线性的。
在所有这些优选的通式(10)和(11)的PA聚合物种类中,以下是优选的:当R30为取代的C1-C10烷基?#20445;?#35813;烷基被选自-OH、-OR7、-NH2、-NH(R7)、-N(R7)2、-C(O)OR7、-C(O)R7、-C(O)NHR7和-C(O)NR72的基团取代,其中R7如上所定义。优选地,所述烷基被-OH、-NH2、-NH(R7)或-N(R7)2取代;更优选地被-OH或-NH2取代。
制备PA聚合物的方法
根据本发明一实施方案,如通式(1)和(2)所表?#38236;?#26412;发明的PA聚合物可 通过包括下列步骤的方法制备:
(1)将通式(12)的单体(I):

其中R1、A和R2如上所定义,与通式(13)的单体(II)或式(14)的单体(III)反应:
(H2N)-R3
               (13)
HR3N-R5-NR3H
               (14)
其中R3和R5如上所定义,所述反应以约1.5:1至约10:1的单体(I):单体(II)的摩尔比进行,以形成通式(15)或(16)的大分子单体:

其中b如上所定义;以及
(2)将通式(15)或(16)的大分子单体与式(17)的聚合物反应;
[(R42)N]a-POL
               (17)
其中a、POL和R4如上所定义,并且其中至少一个R4为H。
因此,本领域?#38469;?#20154;?#34987;?#28165;楚,在该反应中,在形成-C(O)-CH(R1)-CH2-N(R4)-基团(Michael加成)下,将-C(O)-C(R1)=C基团与 POL的(R42)N基团反应。
因此,本发明还涉及可通过该方法获得的通式(1)和(2)的PA聚合物。
根据本发明一优选实施方案,如通式(10)和(11)所表?#38236;?#26412;发明的PA聚合物还可通过包括下列步骤的方法制备:
(1)将通式(18)的单体(III):

其中R1、Y、R29和r如上所定义,与通式(19)的单体(IV)或式(20)的单体(V)反应:
(H2N)-R30
               (19)
HR30N-R32-NR30H
               (20)
其中R30和R32如上所定义,所述反应以约1.5:1至约10:1的单体(I):单体(II)的摩尔比进行,以形成通式(21)或(22)的大分子单体:

其中b如上所定义;以及
(2)将通式(21)或(22)的大分子单体与式(23)的聚合物反应;
[(R312)N]a-POL
               (23)
其中a、POL和R31如上所定义,并且其中至少一个R31为H。
根据本发明,该方法的步骤(1)优选在环境温度至约100℃的温度下进行,优选约30℃至约80℃。
根据本发明,该方法的步骤(2)优选在环境温度至约100℃的温度下进行,优选约30℃至约80℃。
毫微粒
本发明还涉?#26114;?#24494;粒。本发明的毫微粒由通式(3)和(4)表示:

其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、A、POL、FG、a和b如上所说明。
根据一优选实施方案,所述毫微粒由通式(24)和(25)表示:

其中R1、R6、R29、R30、R31、R32、Y、Z、POL、FG、a、b和r如上所定义。
官能团FG为能够与用于后修饰的?#32422;?#30340;互?#26500;?#33021;团(CFG)形成?#24067;?#38190;的取代基。基团FG优选自能够与基团CFG,优选地在生物相容的反应条件下,特别是在生理pH和环境温度以及水性系统的条件下,形成?#24067;?#38190;的官 能团。本领域?#38469;?#20154;员熟知这样的基团FG。特别地,基团FG选自-OH、-OR7、-NH2、-NH(R7)、-N(R7)2、-C(O)OR7、-C(O)R7、-C(O)NHR7和-C(O)NR72的基团,其中R7独立地选自:
(a")H;
(b")C1-C10烷基,其中所述烷基可为线性的或支化的,并且任选地被取代,和/或任选地(部分)不饱和,和/或任选地被1个、2个或3个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;
(c")C3-C12环烷基,其中所述环烷基任选地被取代,和/或任选地(部分)不饱和,和/或任选地在所述?#20998;?#21253;含1个、2个或3个杂原子,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;
(d")C6-C12芳基,其中所述芳基任选地被取代;
(e")C6-C12杂芳基,其中所述杂芳基包含1个、2个或3个独立地选自O、N和S的杂原子,和/或其中所述杂芳基任选地被取代;
(f")C7-C14烷基芳基,其中所述烷基芳基任选地被取代,和/或其中所述烷基芳基的烷基部分为线性的或支化的,并且任选地(部分)不饱和,和/或任选地被1个、2个或3个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;以及
(g")C7-C14烷基杂芳基,其中所述烷基杂芳基包含1个、2个或3个独立地选自O、N和S的杂原子,和/或其中所述烷基杂芳基任选地被取代,和/或其中所述烷基杂芳基的烷基部分为线性的或支化的,并且任选地(部分)不饱和,和/或任选地被1个、2个或3个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S。
CFG优选自-OH、-OR7、-NH2、-NH(R7)、-N(R7)2、-C(O)OR7、-C(O)R7、-C(O)NHR7和-C(O)NR72,其中R7如?#26434;贔G所定义。例如,FG可为-OH,并且CFG可为-COOH。
通式(3)、(4)、(24)和(25)的毫微粒可通过以下方法制备,其中分别将通式(1)、(2)、(10)或(11)的PA聚合物与式(26a)或式(26b)的?#32422;?#21453;应:
FG-R6-NHR30
               (26a)
FG-R6-SH
               (26b)
其中FG和R6如上所定义,FG任选地为氢。其它有用的FG包括生物学上或药理学上的活性基团,例如寡肽和多肽。式(26a)和(26b)的?#32422;?#30340;适合的实例为乙二胺、二亚?#19968;?#19977;胺、三亚?#19968;?#22235;胺、四亚?#19968;?#20116;胺、1,6-二氨基?#21644;欏?#31471;氨基(amine terminated)PEG、端氨基PPO、端巯基(thiol terminated)PEG和端巯基PPO。
然而本领域?#38469;?#20154;?#34987;?#26126;确,式(26b)的?#32422;?#19981;仅可与式(1)、(2)、(10)和(11)中?#25105;?#20010;的PA聚合物的丙烯酸酯基团反应,还可与式(1)或式(2)的PA聚合物的R2?#26800;?S-S-基团(?#36125;?#22312;时),或者式(10)或式(11)的PA聚合物中如由Z表?#38236;?S-S-基团反应。另外,由于式(1)或式(2)的PA聚合物的R3以及式(10)或式(11)的PA聚合物的R30可包含官能团,还可设想式(26a)的?#32422;?#21487;与这些官能团反应。此外,当R3和R30包含如伯胺基或肿胺基?#20445;?#38500;了式(26a)的?#32422;粒?#36824;可使用式FG-R6-RG的?#32422;粒?#20854;中RG选自-OH、-OR7、-C(O)OR7、-C(O)R7、-C(O)NHR7、-C(O)NR72和-SO2Cl,其中R7如上所定义。
纳米凝胶
本发明还涉及纳米凝胶。本发明的纳米凝胶具有以下重要优势?#26680;且?#28342;解的和分散的形式存在时是稳定的。本发明的纳米凝胶还是贮藏稳定的。可冷冻纳米凝胶的溶液,而不丢失他们的完整性,并可将其冻干为可容易地?#25351;?#20026;溶液而不丢失活性或完整性的粉末形式。
所述纳米凝胶通过将通式(1)和(2)的PA聚合物交联来制备,其中该交联优选通过紫外辐射进行,优选地用约365nm波长的紫外辐射。所述交联反应优选在光敏引发剂的存在下进行。所述交联反应还优选在油包水乳液中进行。所述交联反应还优选在低于7,优选低于约6的pH下进行。优选地,pH高于约1,优选地高于约2。
因此本发明还涉及通过上述方法获得的纳米凝胶,所述方法包括将通式(1)、(2)、(10)和(11)的PA聚合物交联,优选地通过将PA聚合物暴露于紫外辐射。
负载的纳米凝胶
根据本发明,所述纳米凝胶还优选地包含选自RNA(特别是siRNA)或者 其衍生物或片段、DNA或者其衍生物或片段、(寡)肽及其衍生物,以及蛋白质及其衍生物?#32435;?#29289;活性组分。
通过将生物活性组分与纳米凝胶在水性溶?#26009;低持?#25509;触来进行纳米凝胶的负载,所述水性溶?#26009;?#32479;优选为缓冲的水性溶?#26009;?#32479;,其中所述水性溶?#26009;?#32479;优选为生理pH。纳米凝胶负载的方法是本领域中已知的。
纳米凝胶的表面修饰
本发明的纳米凝胶,?#36824;?#26159;负载形式还是未负载形式,还可通过后修饰进一步官能化。
根据后修饰的一优选实施方案,通过将式(1)或(2)的PA聚合物交联获得的纳米凝胶,其中R3独立地选自:
(a1)取代的C1-C10烷基,其中所述烷基可为线性的或支化的,并且任选地(部分)不饱和,和/或任选地被1个、2个或3个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;
(b1)取代的C3-C12环烷基,其中所述环烷基任选地(部分)不饱和,和/或任选地在所述?#20998;?#21253;含1个、2个或3个杂原子,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;
(c1)取代的C6-C12芳基;
(d1)取代的C6-C12杂芳基,其中所述杂芳基包含1个、2个或3个杂原子,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;
(e1)取代的C7-C14烷基芳基,其中所述烷基芳基的烷基部分为线性的或支化的,并且任选地(部分)不饱和,和/或任选地被1个、2个或3个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;
(f1)取代的C7-C14烷基杂芳基,其中所述烷基杂芳基包含1个、2个或3个独立地选自O、N和S的杂原子,和/或其中所述烷基杂芳基的烷基部分为线性的或支化的,并且任选地(部分)不饱和,和/或任选地被1个、2个或3个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;
其中上述基团(a)-(f)包含作为取代基的官能团(FG),其能够与用于后修饰R的?#32422;?#30340;互?#26500;?#33021;团(CFG)形成?#24067;?#38190;,并且其中所述任选地包含生物活性组分的纳米凝胶与所述?#32422;罵根据下列方法反应:
纳米凝胶-FG+R-CFG
基团CFG能够与基团FG形成?#24067;?#38190;。本领域?#38469;?#20154;员熟知基团FG和CFG的适合的实例。例如,FG可为-COOH,而CFG基团可为-NH2。
根据一优选实施方案,官能团FG选自-OH、-OR7、-NH2、-NH(R7)、-N(R7)2、-C(O)OR7、-C(O)R7、-C(O)NHR7和-C(O)NR72的基团,其中R7独立地选自:
(a")H;
(b")C1-C10烷基,其中所述烷基可为线性的或支化的,并且任选地被取代,和/或任选地(部分)不饱和,和/或任选地被1个、2个或3个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;
(c")C3-C12环烷基,其中所述环烷基任选地被取代,和/或任选地(部分)不饱和,和/或任选地在所述?#20998;?#21253;含1个、2个或3个杂原子,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;
(d")C6-C12芳基,其中所述芳基任选地被取代;
(e")C6-C12杂芳基,其中所述杂芳基包含1个、2个或3个独立地选自O、N和S的杂原子,和/或其中所述杂芳基任选地被取代;
(f")C7-C14烷基芳基,其中所述烷基芳基任选地被取代,和/或其中所述烷基芳基的烷基部分为线性的或支化的,并且任选地(部分)不饱和,和/或任选地被1个、2个或3个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S;以及
(g")C7-C14烷基杂芳基,其中所述烷基杂芳基包含1个、2个或3个独立地选自O、N和S的杂原子,和/或其中所述烷基杂芳基任选地被取代,和/或其中所述烷基杂芳基的烷基部分为线性的或支化的,并且任选地(部分)不饱和,和/或任选地被1个、2个或3个杂原子间断,其中所述杂原子独立地选自O、N和S。
根据后修饰的另一优选实施方案,将通过将式(10)或(11)的PA聚合物交联获得的纳米凝胶与用于后修饰R’的?#32422;?#26681;据下述方法反应:
纳米凝胶+R’-SH
基团R和R’优选地为2-巯基?#19968;?-羟基?#19968;?#20197;及数均分子量Mn为约500-约10000的PEG(聚氧化乙烯)基团或PPO(聚氧化丙烯)基团。如本领域?#38469;?#20154;?#34987;?#26126;确,?#32422;罵’-SH也可与如上所述的式(1)、(2)、(10)和式(11)的 PA聚合物的纳米凝胶?#26800;?S-S-基团(?#36125;?#22312;时)反应。
因此本发明还涉及通过包括下列步骤的第一方法获得的表面修饰的纳米凝胶:
(1)将通式(1)、(2)、(10)或(11)的PA聚合物交联,优选通过将PA聚合物暴露于紫外辐射以形成纳米凝胶;
(2)任选地将纳米凝胶用选自RNA(特别是siRNA)或者其衍生物或片段、DNA或者其衍生物或片段、(寡)肽及其衍生物,以及蛋白质及其衍生物?#32435;?#29289;活性组分负载;以及
(3)将纳米凝胶与?#32422;罵-CFG或R’-SH反应。
所述表面修饰的纳米凝胶还通过包括下列步骤的第二方法获得:
(1')将通式(1)、(2)、(10)或(11)的PA聚合物交联,优选通过将PA聚合物暴露于紫外辐射以形成纳米凝胶;
(2')将纳米凝胶与?#32422;罵-CFG或R’-SH反应;以及
(3')任选地将纳米凝胶用选自RNA(特别是siRNA)或者其衍生物或片段、DNA或者其衍生物或片段、(寡)肽及其衍生物,以及蛋白质及其衍生物?#32435;?#29289;活性组分负载。
所述表面修饰的纳米凝胶还通过包括下列步骤的第三方法获得:
(1")将纳米凝胶与?#32422;罵-CFG或R’-SH反应,从而形成官能化的纳米凝胶;
(2")将官能化的纳米凝胶交联,优选地通过将官能化的纳米凝胶暴露于紫外辐射以形成纳米凝胶;以及
(3")任选地将纳米凝胶用选自RNA(特别是siRNA)或者其衍生物或片段、DNA或者其衍生物或片段、(寡)肽及其衍生物,以及蛋白质及其衍生物?#32435;?#29289;活性组分负载。
在第一方法的步骤(1)和第二方法的步骤(1')中,不需要将所有丙烯酸酯基团交联,这样以分别在第一方法的步骤(3)和第二方法的步骤(2)中将未交联的丙烯酸酯基团官能化。同样地,在第三方法的步骤(1")中,不需要将所有丙烯酸酯基团官能化,以使未交联的丙烯酸酯基团仍可交联。因此,在这三?#22336;?#27861;的?#25105;?#31181;中获得的产物可能是非常复杂的。根据本发明,以下是更优选的:当首先进行官能化步骤?#20445;?#26410;将所有丙烯酸酯基团官能化, 从而使其余的丙烯酸酯基团能够进一步交联。同样地,以下也是优选的:当首先进行交联步骤?#20445;?#26410;将所有丙烯酸酯基团交联,从而使其余的丙烯酸酯基团能够进一步官能化。本领域?#38469;?#20154;员能够熟练地选择适合的反应条件,特别是通过选择适合的反应物和原料的摩尔比,以控制交联和官能化的程度。此外,如上所述,在PA聚合物中有其它的反应性基团(如-S-S-基团),其可连同丙烯酸酯基团一起官能化。
应用
由于本发明的纳米凝胶的高负载能力、高稳定性和对环境因素(如离子强度、还原电位、pH和温度)的应答性,其作为药物递送载体是非常适合的。特别地,与自组装聚合毫微粒系统作为递送载体相比,将本发明的纳米凝胶用于生物活性物质的递送具有其它益处,因为在这些纳米凝胶的情况中,将所有聚合组分掺入到递送纳米凝胶中,而在自组装聚合毫微粒系?#25345;校?#30001;于?#33014;?#26465;件,在溶液中通常需要过量的?#21355;?#32858;合物。这经常导致毫微粒的不期望的细胞毒性作用,以及其在配方稀释时的不稳定性。
实施例
材料和方法
购买最高纯度级别的双丙烯酰胱胺(CBA,Polysciences,USA),并且使用时未进一步纯化。从Aldrich获得重均分子量为800Da(PEI800)的低分子聚乙烯亚胺(PEI)。从Ciba购得光敏引发剂Igracure2959。从Degussa-Goldschmidt(Evonik)购得ABIL EM90表面活性剂。抗荧光素酶siRNA购自Eurogentec,AllStars。阴性对照siRNA购自Qiagen。其它所有化学品购自Aldrich。所有?#32422;?#21644;溶剂为?#32422;?#32423;别,并且使用时未进一步纯化。在Varian Unity300(1H NMR300MHz)上记录NMR谱,使用四甲基硅烷(TMS)作为内标。
实施例1:二丙烯酰基大分子单体(A-(CBA-ABOL)n-A)的合成。
将大约0.48g(0.0054mol.)的4-氨基-1-丁醇(ABOL)和1.56g(0.006mol)的CBA(9/10mol/mol ABOL/CBA比)加入到3mL的CaCl2(0.4M)在?#29366;?水3/1(v/v)的溶液中,并?#21307;?#21453;应烧瓶密封。聚合反应在50℃下进行,并且使该反应进行30小?#20445;?#24471;到粘稠的溶液。反应通过1H-NMR监测(两个丙烯酰 基峰(δ5.55和6.05)以及两个丁醇侧基的亚甲基峰(1.58ppm和1.78ppm)的积分面积。聚合反应结束?#20445;琋MR积分表明大分子单体(A-(CBA-ABOL)n-A)的每个丙烯酰基包含约6个ABOL单元,即n=12。
实施例2:超支化p(CBA-ABOL/PEI)的合成
将2.12、1.06、0.53或0.26ml体积的低分子PEI800(100mg/ml)溶液加入到在3mL?#29366;?水3/1(v/v)?#26800;?.34g A-p(CBA-ABOL)12-A二丙烯酰基大分子单体中,?#28304;?#21040;丙烯酰基与PEI期望的摩尔比(分别为3/1、6/1、12/1和24/1)。将混合物用0.4M的CaCl2在?#29366;?水3/1(v/v)?#26800;?#28342;?#21512;?#37322;至10mM的PEI?#24352;?#24230;,以防止在反应期间的胶凝作用。将反应在50℃下进行24小时。随后,分出一半的包含用CBA丙烯酰基封端的p(CBA-ABOL)/PEI的反应混合物,用于纳米凝胶的合成。向另一半反应混合物中加入10倍过量的乙二胺(EDA),以将所有末端CBA丙烯酰基转化为胺。将所得的乙二胺封端的p(CBA-ABOL)/PEI溶液用水稀释至约30ml,用4M HCl酸化至pH~4,然后使用超滤膜(MWCO1000g/mol)纯化。冻干,然后收集HCl盐形式的EDA末端的超支化(CBA-ABOL)/PEI聚合物。收率30-50%。在表1中总结不同的p(CBA-ABOL)/PEI聚合物的ABOL/丙烯酰基?#21462;?
表1

实施例3:超支化p(CBA-ABOL)/PAMAM的合成
将1.16、0.87或0.58ml体积的第二代(G2)PAMAM树状聚合物溶液(100mg/ml)加入到在3mL?#29366;?水3/1(v/v)?#26800;?.34g A-p(CBA-ABOL)12-A二丙烯酰基大分子单体中,?#28304;?#21040;丙烯酰基与PAMAM分子期望的摩尔比(分别为10/1、15/1和20/1)。将混合物用0.4M的CaCl2在?#29366;?水3/1(vol./vol.)?#26800;?#28342;?#21512;?#37322;至10mM的PAMAM?#24352;?#24230;,以防止在反应期间的胶凝作用。将反应在50℃下进行24小时。随后,分出一半的包含用CBA丙烯酰基封端的p(CBA-ABOL)/PAMAM的反应混合物,用于纳米凝胶的合成。向另一半反应混合物中加入10倍过量的乙二胺(EDA),以将所有末端CBA丙烯酰基转化为胺。将所得的乙二胺封端的p(CBA-ABOL)/PAMAM的溶液用水稀释至约30ml,用4M HCl酸化至pH~4,然后使用超滤膜(MWCO1000g/mol)纯化。冻干,然后收集HCl盐形式的EDA末端的超支化(CBA-ABOL)/PAMAM聚合物。收率30-50%。在表2中总结不同的p(CBA-ABOL)/PAMAM组合物的ABOL/丙烯酰基?#21462;?
表2

实施例4:EDA末端的超支化p(CBA-ABOL)/寡胺的合成
通过将表1和2的超支化聚合物与过量的EDA反应,制备EDA末端的超支化聚合物。使反应进行,直到通过NMR确认,丙烯酰基完全消失。
表3


实施例5:p(CBA-ABOL)/寡胺纳米凝胶(NG-PAA)的合成
将下列超支化聚合物(参见表3)如下交联。
表4

在室温下,将500mg丙烯酰基末端的p(CBA-ABOL)/寡胺(寡胺=PEI或PAMAM)的溶液用4M HCl酸化至pH~4。在氮气流中,将?#29366;即?#21453;应溶液中蒸发。随后将溶液体积用去离子水调节至4ml。加入5mg光敏引发剂Igracure2959,然后在5分钟内,将水相在30ml包含10%ABIL EM90表面活性剂的矿物油中,通过超声处理(Bandelin Sonoplus GM2070)(振幅75%),乳化。超声处理后,立即将纳米微滴在搅拌下,通过紫外辐射(5mW/cm2,在365nm下,持续1小时)交联。为了移除连续相,将乳液用100ml的丙酮/?#21644;?#28151;合物1/1(v/v)稀释。将交联的p(CBA-ABOL)/寡胺纳米凝胶(缩写为NG-PAA)通过离心法(8000rpm,5分钟)成球,从表面活性剂中用丙酮/?#21644;?#28151;合物洗涤4次,并在30ml去离子水?#24615;?#20998;散。使用超滤膜(MWCO10000g/mol)纯化,然后冻干,将NG-PAA在-20℃下储存。收率为20-25%。
实施例6:巯基官能化的聚(乙二醇)(PEG-SH)的合成
从甲氧基PEG在如?#28388;?#36848;的三?#33014;?#25104;法中合成分子量为2000g/mol的巯基官能化的PEG(PEG-SH)。
PEG-甲磺酸酯
将甲氧基PEG的羟基根据如Elbert等人(D.L.Elbert,J.A.Hubbell,Biomacromolecules2001,2,430)公开的略微修改的方法,通过甲磺酰化来活化。在一代表性实例中,将10.0g(5mmol,1当量)的甲氧基PEG(Mw=2000g/mol)在70ml干燥甲苯的共沸蒸馏中干燥两次。在第二次蒸馏步骤后,将PEG在20ml的干燥二氯甲烷中溶解,然后加入6.6ml(15mmol,3当量)的三 辛胺。随后,将溶液在冰浴中冷却,并?#19994;?#21152;1.72g甲磺酰?#21462;?#35813;反应在氮气气氛中,于室温下过夜进行,然后在乙醚中沉淀。最终通过过滤收集白色粉末的形式的PEG-甲磺酸酯,并?#21307;?#20854;在真空下干燥。收率:83%。1HNMR(CDCl3)δ(ppm):3.08(s,3H,OSO2CH3);3.37(s,3H,CH3OCH2);3.40(t,2H,CH3OCH2);3.52–3.90(m,176H,PEG);4.38(t,2H,CH2CH2OSO2CH3)。
PEG-硫代乙酸酯
在第二步中,根据修改的文献方法(C.Woghiren,B.Sharma,S.Stein,Bioconjugate Chem.1993,4,314),将甲磺酸酯转化为硫代乙酸酯。因此,将3.0g(1.5mmol,1当量)的PEG-甲磺酸酯在10ml干燥吡啶中溶解,并?#19994;?#29420;地将2.23g(19.5mmol,13当量)的硫代乙酸钾在28ml2/1(v/v)的干燥吡啶/?#29366;?#30340;混合物中溶解。然后将PEG-甲磺酸酯溶液和2.6ml三辛胺加入到硫代乙酸钾溶液中,并?#21307;?#21453;应混合物在氮气气氛中,在室温下搅拌过夜。将所有溶剂蒸发;将?#24615;?#22312;10ml盐水中溶解,并且用二氯甲烷萃取4次。将有机相用硫酸镁干燥,浓缩并且在乙醚中沉淀两次。最终通过过滤收集白色粉末形式的PEG-硫代乙酸酯,并?#21307;?#20854;在真空下干燥。收率:78%。1H NMR(CDCl3)δ(ppm):2.33(s,3H,CH2SCOCH3);3.08(t,3H,CH2SCOCH3);3.37(s,3H,CH3OCH2);3.40(t,2H,CH3OCH2);3.52–3.90(m,176H,PEG)。
PEG-巯基(PEG-SH)
在最后的步骤中,将硫代乙酸酯脱保护,以得到PEG-SH(O.B.Wallace,D.M.Springer,Tetrahedron Lett.1998,39,2693)。因此,将2.3g(1.2mmol,1当量)的PEG-硫代乙酸酯在10ml?#29366;?#20013;,于氮气气氛下溶解。向该溶解中加入溶解在1ml?#29366;賈械?1mg(1.2mmol,1当量)的甲硫醇钠,并?#21307;?#35813;溶液在室温下搅拌30分钟。然后将反应混合物倒入20ml的0.1M盐酸水溶液中,并用二氯甲烷萃取。将有机层用盐水洗涤,并?#21307;?#25152;有溶剂通过旋转蒸发移除。为了移除最后的杂质,将PEG溶解于40ml包含0.35g DTT(2.3mmol,2当量)的去矿物质水中,以减少可能的氧化的硫醇(thiol),并且通过用1000g/mol的分子?#21487;附?#30340;超滤来透析。最终通过冻干获得白色松散粉末形式的PEG-SH。收率:85%。1H NMR(CDCl3)δ(ppm):1.59(t,1H, CH2CH2SH);2.68(q,2H,CH2CH2SH);3.37(s,3H,CH3OCH2);3.40(t,2H,CH3OCH2);3.52–3.90(m,176H,PEG)。
通过Ellman?#32422;?#27979;定从羟基到巯基的总转化率,并且证明为100%。
实施例7:siRNA/超支化p(CBA-ABOL)/寡胺复合物(polyplexes)的制备
由CBA-ABOL(参?#38469;?#26045;例1)、第1-4号样品(参照表1)以及5和6(参照表2)制备复合物。
在代表性实验中,在HEPES缓冲的葡萄糖(HBG)(pH7.4)中制备?#24352;?#24230;为0.025mg/ml的siRNA溶液。制备超支化p(CBA-ABOL)/寡胺(1.25mg/ml)在HBG(pH7.4)?#26800;?#20648;备溶液,并?#21307;?#20854;用于制备50/1w/w的聚合物/siRNA比的复合物。将该溶液用HBG反复1:1稀释,以制备25/1、12/1和6/1w/w的聚合物/siRNA比的复合物。通常将等体积的siRNA和超支化p(CBA-ABOL)/寡胺溶液在1ml Eppendorf管中混合。混合后,将复合物溶液在环境温度下孵育20分钟。?#26434;?#26356;高的比(或应用的剂量),施用提高的组分浓度。
实施例8:NG-PAA纳米凝胶的siRNA负载
将实施例4的纳米凝胶,以及由实施例1的二丙烯酰基大分子单体(A-(CBA-ABOL)n-A)制备的纳米凝胶用siRNA负载。
在代表性实验中,在HEPES缓冲的葡萄糖(HBG)(pH7.4)中制备?#24352;?#24230;为0.025mg/ml的siRNA溶液。制备NG-PAA(1.25mg/ml)在HBG(pH7.4)?#26800;?#20998;散体,并?#21307;?#20854;用于以50/1的纳米凝胶/siRNA重量比负载。该NG-PAA分散体用HBG反复以1:1稀释,以制备25/1、12/1和6/1的聚合物/siRNA重量比的siRNA负载的纳米凝胶。通常将等体积的siRNA和纳米凝胶溶液在1ml Eppendorf管中混合,并?#21307;?#20854;在环境温度下孵育20分钟。?#26434;?#26356;高的比(或应用的剂量),施用如上给出的相同体积的适合组分的更高的浓度。
实施例9:溴化乙锭(EtBr)置换实验
使用溴化乙锭(EtBr)实验研究实施例4的EDA末端的超支化聚合物和实施例5的NG-PAA纳米凝胶的缩合(condense)siRNA的能力。将p(CBA-ABOL)聚合物(实施例1)?#31859;?#21442;考。
将超支化聚合物或NG-PAA纳米凝胶的溶液逐步加入到包含EtBr(0.4μg/mL)的在HBG?#26800;膕iRNA溶液(10μg/mL)。在每一步骤后,监测荧光强度(λex=510nm,λem=590nm)。在?#21355;雜iRNA存在下的EtBr溶液的荧光强度相 当于0%缩合,而无siRNA的荧光强度相当于100%DNA缩合。
结果在图1-3中显示。图1显示p(CBA-ABOL)聚合物自身在siRNA络合作用中效?#24335;系汀?#28982;后,EDA末端的超支化聚合物和NG-PAA纳米凝胶具有显著更高的结合能力。EDA末端的超支化聚合物和包含PEI的NG-PAA纳米凝胶比包含PAMAM的那些表现更高的与siRNA的亲和力(图1和2)。NG-PAA纳米凝胶比相应的EDA末端的超支化聚合物具有更高的缩合siRNA的能力。
实施例10:体外基因沉默
通过在NCI-H1299细胞(稳定地表达萤火虫荧光素酶,由G.Storm教授,University of Utrecht,The Netherlands捐赠)中沉默荧光素酶的表达,来测定敲低(Knockdown)效率。在两个平行试验中,分别使用抗荧光素酶和?#28508;?#30721;siRNA?#20848;?#25970;低和细胞活力。将细胞在96?#35013;?#20013;,以8000细胞每孔的密度接种。在包含5%CO2的潮湿环?#25345;校?#20110;37℃下孵育24小?#20445;?#28982;后将培养基用100μl新?#39280;?#34880;清培养基替代。两种抗荧光素酶siRNA都作为?#28508;?#30721;siRNA使用。阳离子脂质体(Lipofectamine)2000(LF)?#31859;?#21442;考,并根据制造商的规程制备络合物。用新鲜培养基孵育1小?#20445;?#28982;后向三次重复的细胞中加入复合物或siRNA负载的纳米凝胶(10μl每孔),得到72nM的siRNA?#24352;?#24230;。在无血清培养基中转染2小?#20445;?#28982;后将复合物培养基用完全培养基替代,并?#21307;?#32454;胞孵育另外48小时。将细胞在50μl裂解缓冲液中裂解,并将20μl的细胞裂解物与50μl包含底物荧光素的荧光素酶检测?#32422;?#28151;合。100-220秒后(在此期间发射光恒定),通过在PerkinElmer1420Victor3酶标仪上,在25℃下测量,持续4秒,以测定荧光素酶活性。将未处理细胞的荧光素酶活性定义为100%表达。
图4-6显示实施例2的第1-4号样品(图4)、实施例3的第5和6号样品(图5)以及实施例5的NG-PAA纳米凝胶(图6)的基因沉默效率。X轴上的数值表示聚合物/siRNA?#21462;BA/ABOL聚合物在siRNA递送中未表现任何效率。
实施例11?#27627;?#24230;和zeta电位的测量
通过使用Zetasizer Nano ZS(Malvern,UK)的激光散射法测量负载和未负载的复合物和纳米凝胶的粒度和zeta电位。
在高聚合物/siRNA混合比(w/w12或更高)下,未观察到由不同EDA末端 的超支化聚合物形成的复合物颗粒的尺寸上的显著不同。所有EDA末端的超支化聚合物形成的小复合物的尺寸为约80nm-约120nm,并且zeta电位为约30mV-约35mV。在低混合比(即w/w6)下,复合物进行缓慢的聚集,混合20分钟后达到约500nm-约600nm的尺寸。
纳米凝胶的负载导致退胀作用,并?#19994;被?#21512;比?#26723;褪保?#23427;们尺寸逐渐减少。第12号样品的尺寸从约120nm(未负载)减少至约90nm(负载w/w50)至约75nm(负载w/w12)。
与EDA末端的超支化聚合物所观察到的相似,混合比的进一步?#26723;?提高siRNA负载)导致纳米凝胶颗粒的聚集。?#22791;?#36733;?#20445;?#32435;米凝胶的zeta电位略微?#26723;汀6杂?#31532;12号样品,zeta电位从约28mV(未负载)减少至约26mV(负载w/w50)至约20mV(负载w/w12)。
实施例12?#21512;?#32990;毒性
用NCI-H1299细胞,在有和无10%FBS存在下进行细胞活力研究。在转?#23616;?#21069;24小时?#20445;?#23558;细胞在96?#35013;?#20013;,以8000细胞每孔的密度接种。制备超支化聚合物或NG-PAA纳米凝胶溶液的从12.5-0.02mg/ml的稀释系列,并将10μl该溶液加入到100μl生长培养基中。孵育24小?#20445;?#28982;后使用XTT实验测量细胞活力,其中将未处理细胞(未暴露于转染体系的细胞)的XTT?#26723;?#20570;100%细胞活力。无血清存在的第4和12号样品的细胞活力曲线如图7所示。特别显示了纳米凝胶表?#33267;?#26368;低的细胞毒性。为了对比:在聚合物/siRNA比48/1下的细胞转染中,聚合物浓度为0.055mg/mL。
实施例13:血清条件下的体外转染
根据如实施例10中描述的相?#21697;?#27861;,用NCI-H1299细胞进行转染研究。但是在?#20204;?#20917;中,转染培养基还包含10%FBS,并且在进行荧光素酶实验前48小时期间,细胞用siRNA负载的纳米凝胶孵育。根据实施例8中描述的方法,制备带有增加siRNA剂量的siRNA负载的纳米凝胶第12号样品的样品溶液(得到在孵育培养基中每孔(100μL)125、250和500ng siRNA,即分别为72、144和288nM),或者带有增加比率的纳米凝胶的恒定剂量的siRNA(72nM)的第12号样品的溶液。?#26434;?#36825;些不同配方的荧光素酶基因沉默分别在图8和9中显示。
实施例14:NG-PAA纳米凝胶配方的表面修饰
通过PEG,使用在PEG链上的末端-SH和纳米凝胶?#26800;?S-S-基团的交?#29615;?#24212;来修饰第12号样品的表面。在代表性实验中,将siRNA的溶液(0.05mg/ml)与等体积的2.5mg/ml的纳米凝胶溶液在HBG(pH7.4)中混合。混合后,将纳米凝胶溶液在环境温度下孵育20分钟,并且加入等体积的PEG-SH在HBG?#26800;?#28342;液。PEG-SH的浓度从0.125mg/ml-2.5mg/ml变化,?#28304;?#21040;0.1-2的PEG-SH/纳米凝胶?#21462;?#38543;后通过DLS注意毫微粒的尺寸和zeta电位。为?#25628;?#31350;胶体稳定性,在加入PEG-SH40分钟后,加入一定体积的NaCl溶液(3.15M),?#28304;?#21040;NaCl150mM的?#24352;?#24230;。这之后,以时间的函数的形式监测颗粒的尺寸。通过PEG2kDa表面修饰之前和之后的尺寸和zeta电位的结果如表4中所示。
表5

图10显示通过用PEG修饰的第12号样品将siRNA递送至H1299细胞的数据。聚合物/siRNA比为50w/w。无血清条件。
实施例15:纳米凝胶配方?#26434;?#20923;融循环和冻干的稳定性
通过DLS研究冻融循环和冻干后的带有siRNA的超支化的第4号样品和纳米凝胶第12号样品配方的性质。
冷冻第4号样品配方导致复合物毫微粒的聚集。在一次冻融循环后,50w/w混合比下的复合物的尺寸从约80nm升高至约600nm。通过加入MilliQ水来重建冻干的配方也是不可能的。?#34892;?5分钟后,在溶液中?#28304;?#22312;显著量的不溶物质。
然而在第12号样品的纳米凝胶配方的情况中,在冻融和冻干后,都?#36127;?#26410;观察到颗粒尺寸上的变化。50w/w混合比的初始配?#33014;?#20923;融循环后以及冻干后的配方的颗粒尺寸分别为约91nm、约94nm和约103nm。在这些处理后,配方未失去它们的活性(图11:左?#30452;?#30340;灰色棒表示带有抗LUC siRNA的配方,右?#30452;?#30340;灰色棒为作为对照的无义siRNA。聚合物/siRNA比50w/w。无血清条件)。所有三种配方在敲低靶基因中表现相等的效率。

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