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抗人SST2单克隆抗体及其应用.pdf

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抗人 SST2 单克隆抗体 及其 应用
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摘要
申请专利号:

CN201310180447.7

申请日:

2013.05.15

公开号:

CN104151416A

公开日:

2014.11.19

当前法律状态:

撤回

有效性:

无权

法?#19978;?#24773;: 发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):C07K 14/47申请公布日:20141119|||公开
IPC分类号: C07K14/47; C07K16/28; C12N5/20; G01N33/577; C12R1/91(2006.01)N 主分类号: C07K14/47
申请人: 中国科学院上海巴斯德研?#20811;? 重庆凯联投资有限公司
发明人: 蓝柯; 何志祥; 李康; 张弛宇; 崔盟; 马新蕾; 朱寅霜
地址: 200025 上海市?#30772;?#21306;合肥路411号
优?#28909;ǎ?/td>
专利代理机构: 上海专利商标事务所有限公司 31100 代理人: 陈静
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法律状态
申请(专利)号:

CN201310180447.7

授权公告号:

|||

法律状态公告日:

2017.01.04|||2014.11.19

法律状态类型:

发明专利申请公布后的视为撤回|||公开

摘要

本发明涉及抗人sST2单克隆抗体及其应用。本发明人第一次采用基因工程手段将编码人sST2蛋白的基因导入到适当的果蝇表达系统中,制备出一种在活性上与天然的人sST2蛋白非常接近的重组人sST2蛋白,用该蛋白免疫动物可获得灵敏地识别人体中天然的sST2蛋白的抗体,从而用于对相关疾病的诊断或检测。

权利要求书

权利要求书
1.  一种制备人sST2蛋白的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(a)将人sST2基因序列插入表达载体的多克隆位点中,获得插入了人sST2基因序?#26800;?#34920;达载体;所述的表达载体是果蝇S2表达系统使用的诱导分泌型表达载体;
(b)使(a)获得的插入了人sST2基因序?#26800;?#34920;达载体转入宿主细胞,获得转化的宿主细胞;所述的宿主细胞是果蝇S2细胞;
(c)培养转化的宿主细胞,从而表达出人sST2蛋白;
(d)分离获得人sST2蛋白。

2.  如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的表达载体为pMT/BiP/V5-His A载体。

3.  如权利要求1所述的方法,其特征在于,在步骤(d)中,还包括用5±2μMCdCl2诱导表达。

4.  一种通过权利要求1所述的方法制备的人sST2蛋白。

5.  一种单克隆抗体,其特征在于,所述的单克隆抗体特异性地抗权利要求4所述的人sST2蛋白。

6.  如权利要求5所述的单克隆抗体,其特征在于,所述的单克隆抗体的亚型为IgG,κ。

7.  如权利要求6所述的单克隆抗体,其特征在于,所述单克隆抗体由选自下组的杂交瘤细胞株产生:8D9,7C11,11E2,9B3或1A11。

8.  一种制备抗人sST2蛋白单克隆抗体的方法,所述的方法包括步骤?#21495;?#20859;杂交瘤细胞8D9、7C11、11E2、9B3或1A11,使用上述杂交瘤细胞制备腹水,以及从腹水中分离纯化上述细胞分泌的单克隆抗体。

9.  抗人sST2特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞,其选自:8D9,7C11,11E2,9B3或1A11。

10.  一种试剂盒,其特征在于,含有权利要求5-7?#25105;?#25152;述的抗体。

说明书

说明书抗人sST2单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物技术和免疫学领域;更具体地,本发明涉及抗人sST2单克隆抗体及其应用。
背景技术
ST2(IL1RL1,DER4,T1和FIT-1)是Toll样/白介素受体超家族的一员,属于IL-1受体亚家族。在人体内ST2基因编码3种亚型的蛋白质:分泌到细胞外的可溶型蛋白sST2,膜结合型受体蛋白ST2L和主要在人肠组织中表达的ST2V[1]。ST2L?#19978;?#32990;膜外3个串联的免疫球蛋白结构域、跨膜结构域和细胞内的TIR(Toll/Interleukin-1receptor)结构域3部分组成[2]。ST2L广泛表达于多种造血细胞和非造血细胞[3],在造血细胞中,ST2L选择性的的表达在Th2淋巴细胞表面,而不表达在Th1淋巴细胞表面,因此ST2L可以作为Th2细胞表面标记分子[4]。ST2L可以与胞外配体分子白介素-33(IL-33)及细胞膜上的白介素-1受体辅助蛋白(IL-1RAcP)形成复合物,招募接头分子Myd88,激活细胞内多条信号通路,促进Th2相关的炎症因子的表达[5,6]。IL-33/ST2L/IL-1RAcP信号通路在体内衔接先天性免疫和适应性免疫进程,参与多种免疫相关疾病的调控过程,具体包括抗感染免疫,肝炎,过敏及哮喘,自身免疫病,抗肿瘤免疫,中枢神经系统炎症,糖尿病,心血管疾病等[7-10]。因此IL-33/ST2L信号通路可以作为多种疾病的潜在治疗?#26800;悖?#22312;疾病治疗和诊断中具有重要价值。
sST2为分泌性的可溶型蛋白,缺少ST2L的跨膜结构域和胞内结构域,在C段与ST2L相比,存在9个不同的氨基酸片段[11]。sST2可作为诱骗受体,在细胞外与游离的IL-33结合,抑制IL-33/ST2L/IL-1RAcP复合物的形成,起到负调控作用,抑制Th2相关的炎症因子IL-4,IL-5,IL-13等的表达[12]。正常人体内,血清sST2浓度维持在非常低的水平,但是在病毒感染[13]、自身免疫性疾病[14]、哮喘[15]、肺?#23435;?#21270;[16]、心衰[17]、呼吸衰竭[18]、糖尿病[19]等多种病人体内,血清sST2水平明显升高。2004年,Shimpo,M.et al等发现血清sST2水平可作为心衰标志物,预测心衰病人的死亡率,具有极其重要的 预后诊断价值[20],随后的多项研究证明([7]Table1Studies examining sST2in serum/plasma of patients with CV disease),sST2可以作为一?#20013;?#22411;的心衰标志物,可用于预测急性?#21215;?#26775;死[20],急?#38498;?#21560;衰竭[18,21]、非稳定的心力衰竭[22],代偿性心力衰竭[23],慢性心力衰竭和左心室收缩功能不全[24]等多?#20013;?#34880;管相关疾病的死亡率。而且sST2与现有的心衰标志物CRP,BNP,ANP等具有功能互补作用,可以显著提高疾病预测的准确性[25,26]。因此sST2,IL-33及相关抗体等具有极其重要的临床应用价值[2,27]。
获取特异性的抗人sST2的单克隆抗体,不仅可以应用于科学研究,还可以用于临床诊断及治疗,具有极其巨大的应用前景,也越来越受到国际研?#23458;械?#37325;视。目前市面上现有的检测sST2的抗体主要来自R&D,MBL,Santa Cruz,Abcam,sinobiological等公司,使用的抗原来源于大肠?#21496;?#34920;达或者哺乳动物细胞如293等的表达。由于sST2是一个高度糖基化的蛋白,在大肠?#21496;?#20013;缺乏糖基化修饰,因此使用大肠?#21496;?#34920;达的重组蛋白在蛋白活?#38498;?#26500;象上与天然蛋白具有极大的差异;使用哺乳动物细胞如293等表达的重组人sST2蛋白,虽然具有与人相似或者相同的糖基化修饰系统,但存在成本高产?#24247;偷热?#38519;。为?#31169;?#20915;上述问题,本发明人采用昆虫细胞(果蝇S2细胞),筛选得到?#23435;?#23450;表达重组人sST2蛋白的细胞株,所得到的重组蛋白不仅具有与人的sST2蛋白相似的天然构象和活性,也具有与哺乳动物表达系统类似的糖基化修饰。不仅避免了大肠?#21496;?#34920;达系统中没有糖基化修饰的缺陷,也弥补了哺乳动物细胞表达重组蛋白成本高产?#24247;?#30340;劣势,具有极大的新颖性。
发明内容
本发明的目的在于提供高效表达和纯化人sST2蛋白的方法;以及抗人sST2蛋白的单克隆抗体及其应用。
在本发明的第一方面,提供一种制备人sST2蛋白的方法,包括以下步骤:
(a)将人sST2基因序列插入表达载体的多克隆位点中,获得插入了人sST2基因序?#26800;?#34920;达载体;所述的表达载体是果蝇S2表达系统使用的诱导分泌型表达载体;
(b)使(a)获得的插入了人sST2基因序?#26800;?#34920;达载体转入宿主细胞,获得转化的宿主细胞;所述的宿主细胞是果蝇S2细胞;
(c)培养转化的宿主细胞,从而表达出人sST2蛋白;
(d)分离获得人sST2蛋白。
在一个优选例中,所述的表达载体为pMT/BiP/V5-His A载体。
在另一优选例中,在步骤(d)中,还包括用5±2μM CdCl2诱导表达。
在本发明的另一方面,提供一种通过所述的方法制备的人sST2蛋白。
在本发明的另一方面,提供一种单克隆抗体,所述的单克隆抗体特异性地抗所述的人sST2蛋白。
在一个优选例中,所述的单克隆抗体的亚型为IgG,κ。
在另一优选例中,所述单克隆抗体由选自下组的杂交瘤细胞株产生:8D9,7C11,11E2,9B3或1A11。
在本发明的另一方面,提供一种制备抗人sST2蛋白单克隆抗体的方法,所述的方法包括步骤?#21495;?#20859;杂交瘤细胞8D9、7C11、11E2、9B3或1A11,使用上述杂交瘤细胞制备腹水,以及从腹水中分离纯化上述细胞分泌的单克隆抗体。
在本发明的另一方面,提供抗人sST2特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞,其选自:8D9,7C11,11E2,9B3或1A11。
在本发明的另一方面,提供一种试剂盒,含有前面所述的抗体。
本发明的其它方面由于本文的公开内容,对本领域的技术人员而言是显而?#20934;?#30340;。
附图说明
图1、采用PCR扩增人sST2蛋白编码序?#26800;?#30005;泳结果。
各?#38236;?#26679;品依次为:1,2,3:人sST2蛋白编码序列,Marker:DL2,000DNA Marker(Takara),
图2、插入人sST2蛋白编码序?#26800;?#34920;达载体菌液PCR鉴定的电泳结果。
图3、使用亲和层析方法纯化重组人sST2蛋白的SDS-PAGE图。
各?#38236;?#26679;品依次为:?#38236;?:hsST2蛋白纯化后使用Amicon Ultra-4Centrifugal Filter(30KD)浓缩后样品;?#38236;?:PageRuler Prestained Protein Ladder  (10-170kDa);?#38236;?:His亲和层析柱纯化处理的穿透?#28023;揮镜?:使用Washing Buffer清洗的流穿?#28023;揮镜?-7?#21512;?#33073;液(?#25239;?#25910;集1ml样品)
图4、使用亲和层析方法纯化重组人sST2蛋白免疫印迹(WB)分析结果。所用抗体为His-Tag(2A8)Mouse mAb(Abmart),二抗使用抗体为Anti-Mouse IgG(H+L),AP Conjugate(Promega,S3721)
各?#38236;?#26679;品上样顺序与图3相同。
图5、Balb/c小鼠第二次免疫后血清抗体效价图,使用间接ELISA方法测定。从结果可以显示经过两次免疫后4只小鼠血清抗体效价都超过1:32000。
图6、为使用ProteinG亲和层析柱纯化腹水中抗体SDS-PAGE分析图。
各?#38236;?#26679;品依次为:?#38236;?:经结合缓冲?#21512;?#37322;处理后的腹水;?#38236;?:HiTrap PtoteinG HP亲和层析柱处理后的穿透?#28023;揮镜?:经结合缓冲液清洗柱子后的流穿?#28023;揮镜?-7:经洗脱缓冲液处理后的洗脱液。左图为使用浓度为7.5%的SDS-PAGE进行非还原性电泳结果;右图为使用浓度为10%的SDS-PAGE进行还原性电泳结果。从电泳结果可以看到纯化的抗体条带单一,没有其它的杂带。
图7、使用本发明中的单克隆抗体和R&D公?#38236;?#21830;业化抗体MAB523进行免疫印迹分析结果及分析灵敏度的定量比?#31232;?
左图显示分别使用杂交瘤细胞株8D9,7C11,9B3,11E2,1A11,7F9,1A1分泌纯化的抗体与R&D公?#38236;?#21830;业化抗体MAB523检测1μg重组人sST2蛋白结果,右图显示杂交瘤细胞株8D9,7C11与R&D公?#38236;?#21830;业化抗体MAB523检测一系列浓度梯度的重组人sST2蛋白的检测结果。
经过定量WB分析,可以发现在本实施例中使用相同浓度的抗体检测相同量的重组人sST2蛋?#36164;保?#32463;杂交瘤细胞株8D9和7C11分泌纯化的抗体比R&D公?#38236;?#21830;业化抗体MAB523具有更加灵敏的检测效果。
图8、使用本发明中的单克隆抗体和R&D公?#38236;?#21830;业化抗体MAB523进行免疫沉淀分析结果。
分别使用杂交瘤细胞株8D9,7C11,9B3,11E2,1A11,7F9,1A1分泌纯化的抗体与R&D公?#38236;?#21830;业化抗体MAB523,对果蝇S2细胞稳转细胞株无血清培养液(Serum free medium)和含有10%FBS培养液经CdCl2诱导72h后收集样品进行免疫沉淀分析。检测过程中使用的一抗为His-Tag(2A8)Mouse mAb(Abmart),二抗为IRDye800CW Goat anti-Mouse IgG(H+L)抗体。
从分析结果可以看出上述抗体均可以结合培养液中游离的重组人sST2蛋白。
图9、使用本发明中的单克隆抗体和R&D公?#38236;?#21830;业化抗体MAB523进行流式细胞术分析结果。
分别使用杂交瘤细胞株8D9,7C11,9B3,11E2,1A11,7F9,1A1分泌纯化的抗体与R&D公?#38236;?#21830;业化抗体MAB523对人的PBL细胞进行染色分析。
从分析结果可以看出,杂交瘤细胞株7C11分泌纯化的抗体比R&D公?#38236;?#21830;业化抗体MAB523具有更好的分析效果,在相同的细胞群中更多表达ST2L的细胞被染色标记。
图10、使用本发明中提供的双夹心酶联免疫法分析纯化的sST2重组蛋白和来源于商业化试剂盒中的sST2蛋白标准品的标?#35760;?#32447;。
分别使用抗体8D9,7C11,9B3作为包被抗体,生物素标记的抗体11E2和1A11作为检测抗体进行双夹心ELISA分析。
具体实施方式
本发明人经过广泛的研究,发现通过基因工程手段,将编码人sST2蛋白的基因重组插入诱导分泌型表达载体pMT-BIP-V5/His A,将表达载体和筛选载体(pCoBlast)共同转染果蝇S2细胞,通过有限稀释法可筛选得到稳定表达人sST2重组蛋白的稳转细胞株,分离纯化可获取高纯度的人sST2重组蛋白,该蛋白具有与人的sST2蛋白类似的糖基化修饰和天然构象。利用果蝇S2细胞表达纯化的人sST2蛋白作为抗原,可以获得特异性的识别人sST2的高亲和力单克隆抗体,可以应用于WB,IP,FACS和ELISA分析。与R&D公?#38236;?#21830;业化抗体MAB523相比,本发明的抗体应用于WB和FACS分析?#20445;?#20855;有更好的分析效果,在临床诊断或治疗中具有重要的应用前景。
本发明人第一次采用基因工程手段将编码人sST2蛋白的基因导入到适当的果蝇表达系统中,制备出一种在活性上与天然的人sST2蛋白非常接近的重组人sST2蛋白,用该蛋白免疫动物可获得灵敏地识别人体中天然的sST2蛋白的抗体,从而用于对相关疾病的诊断或检测。
本发明的提供一种使用果蝇S2细胞高效表达和快速纯化人sST2蛋白的方法,所述方法包括以下步骤:
(a)PCR扩增得到编码人sST2蛋白编码序列
(b)将(a)所述的人sST2蛋白编码序列插入到果蝇S2细胞表达系统使用表达载体的多克隆位点,获得了插入人sST2蛋白编码序?#26800;?#34920;达载体。
(c)使用(b)获得的插入人sST2蛋白编码序?#26800;?#34920;达载体和筛选载体一起,利用磷酸钙转染方法共同转染S2细胞。
(d)使用抗生素筛选转染细胞,得到稳定转染筛选载体或筛选载体与表达载体共转?#38236;?#31283;定细胞株。
(e)使用有限稀?#22270;?#26415;结合Western blot分析方法,筛选筛选载体与表达载体共转?#38236;?#31283;转单克隆细胞株。
(f)扩大培养(e)中获取的稳转单克隆细胞细胞株,加入诱导剂CdCl2诱导重组人sST2蛋白表达。
(g)分离纯化获取人sST2重组蛋白。
在本发明的一个优选实施例中,使用的表达载体为诱导分泌型表达载体pMT-BiP-V5/His A,使用的筛选载体为pCoBlast,表达载体与筛选载体共转时比例为19:1.
在本发明的一个优选实施例中,使用的诱导剂CdCl2浓度为5μM。
在本发明的一个优选实施例中,洗脱缓冲液中使用的咪唑浓度为250mM
本发明提供一种使用(g)中纯化的人sST2重组蛋白作为抗原,制备抗人sST2蛋白的的单克隆抗体的制备方法,所述方法包括以下步骤:
(a)免疫动物
(b)杂交瘤细胞株制备和筛选
(c)抗体亚?#22270;?#23450;
(d)腹水制备和抗体纯化
在本发明的一个优选实施例中,抗体亚?#22270;?#23450;用杂交瘤细胞培养上清?#21512;?#37322;比例为1:50
本发明提供一种抗人sST2蛋白的抗体,其特征在于所述抗体为IgG类,κ亚型。
在本发明的一个优选实施例中,所述单克隆抗体由8D9和7C11杂交瘤细胞株产生。
在本发明的一个优选实施例中,所述单克隆抗体由7C11杂交瘤细胞株产生。
本发明提供一种免疫偶联物,其特点在于该免疫偶联物含有:
(a)本发明的单克隆抗体或人sST2重组蛋白;和
(b)选自下组的偶联物部分:药物,毒素,细胞因子,酶,生物素或放射?#38498;?#32032;。
本发明提供一种夹心酶联免疫方法,可以定量检测血清,组织液及细胞培养液中的sST2浓度,其含有本发明的人sST2重组蛋白,单克隆抗体或免疫偶联物,或所述抗体或免疫偶联物的组合。
在本发明的一个优选实施例中,所述包被抗体由8D9、7C11或9B3杂交瘤细胞株分泌。
在本发明的一个优选实施例中,所述抗体免疫偶联物含有由11E2或1A11杂交瘤细胞株分泌的抗体。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的?#27573;А?#19979;列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著,分子克隆实验指南,第三版,科学出版社,2002中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。
实施例1、人sST2蛋白编码基因的获取
通过检索GenBank数据库,查?#19994;?#21040;关于人sST2基因的基本信息:NCBI Reference Sequence:NM_003856.2,ORF Size:987nt Protein_id="NP_003847.2, 328aa。人sST2基因具有SEQ ID NO:1所?#38236;?#26680;苷酸序列,编码SEQ ID NO:2所?#38236;?#34507;白。
从?#26412;?#20041;翘神州生物技术有限公司购买包含有此基因ORF的T载体(Human IL1R4 ORF,Catalog Number:HG10105-M)?#28304;薚载体为模板,设计特异性引物,在目的片段两端分别引入两个酶切位点:Kpn I和ApaL I,通过PCR方法将sST2cDNA序列插入到果蝇S2表达系统(Drosophial Expression System,周保罗研究员惠赠,购自Invitrogen公司)使用的表达载体pMT/BiP/V5-His A(周保罗研究员惠赠,购自Invitrogen公司)中,使用引物序列如下:
Forward Primer:5’-CCGGGTACCTGGGTTTTGGATCTTAGC-3’(SEQ ID NO:3)
Reverse Primer:5’-CGCGGGCCCGAAACACTCCTTAC-3’(SEQ ID NO:4)
注:下划线分别表示Kpn I和ApaL I酶切位点
参照《分子克隆实验指?#31232;?#26041;法使用上述特异性引物对人sST2cDNA进行扩增:
PCR体系:50μl

PCR程序:

取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定,所用凝?#20309;?.5%琼脂糖凝?#28023;?#20998;子量标记为购自TaKaRa公?#38236;腄L2,000 DNA Marker(D501A)。电泳结果如图1所示。
实施例2、人sST2重组蛋白表达载体构建
将实施例1中得到的PCR产物经KpnI和ApaL I两个酶同时双酶切后切胶回收,参照《分子克隆实验指?#31232;罰?#23558;sST2目的片段连接到同样使用KpnI和ApaL I双酶?#26800;膒MT/BIP/V5-His A载体中,获得pMT/BIP/V5-His-sST2重组载体,转化入感受态细胞DH5-α中,随机挑选两个克隆进行菌液PCR鉴定,鉴定结果如图2,结果显示挑取的两个克隆均为阳性克隆,在1000bp大小有明显的目的条带,取其中的1号阳性克隆结果送博尚生物技术有限公司测序验证,测序结果与目的片段完全一?#38534;?
实施例3、稳定表达人sST2重组蛋白的果蝇S2稳转细胞株构建
(1)转染用质粒准备
取前述准备的pMT/BIP/V5-His-sST2重组质粒和pCoBlast质粒(周保罗研究员惠赠购自Invitrogen公司)DH5a感受态细胞,挑选单个克隆扩大培养后使用NucleoBond Xtra Midi Plus试剂盒提取质粒,并使用NanoDrop测定质粒浓度。
(2)转染试剂配制
参照Drosophila Expression System提供的protocol准备以下溶?#28023;?XHEPES Buffered Saline(50 mM HEPES,1.5 mM Na2HPO4,280mM NaCl,pH7.1);2.5MCaCl2溶?#28023;琩dH2O。
(3)转染细胞准备
转染前一天,准备状态好的果蝇S2细胞传代至六?#35013;?#20013;,每孔1.0-1.5x106细胞,28℃培养12-18h后细胞密度达到2-4x106个细胞即可以用于转染。
(4)转染
转?#38236;?#22825;按照以下配方准备转染混合?#28023;?
溶液A:150μl


溶液B:2×HEPES Buffered Saline  150μl
细胞操作台上缓慢将溶液A滴加到溶液B中,同时用Vortex连续混?#21462;?#25972;个过程约1min左?#25671;?#28982;后将混合液置细胞操作台静置30min直到形成大小较均一的沉淀物。均匀的将混合液滴加到铺有果蝇S2细胞的6?#35013;?#20013;,每孔150μl混合液。细胞置28℃培养16-24h。
(5)换液
转染后16-24h给细胞换?#28023;?#31163;心去除磷酸钙溶?#28023;?#29992;完全培养?#21512;?#32454;胞两次后用2ml完全培养液重悬转?#38236;?#32454;胞并将细胞传代至原来的6?#35013;?#20013;。
(7)筛选稳定转?#38236;?#32454;胞
转染后3天向细胞培养液中加入筛选抗生素Blasticidin HCl至?#24352;?#24230;为25μg/ml,间隔4-5天更换含有选择抗生素的培养?#28023;?#32463;过2周左?#19994;?#31579;选即可获取稳定转?#38236;?#32454;胞。
(8)筛选表达重组人sST2蛋白的稳转细胞株
通过有限稀释法,取步骤7中的细胞100个,稀释到预先准备好的10ml细胞密度为105的正常细胞中,混匀后铺96?#35013;澹?#27599;空加样量为100μl。24h后向96?#35013;?#20013;加入100μl筛选抗生素Blasticidin HCl浓度为50μg/ml的培养?#28023;?#27599;隔4-5天向96?#35013;?#20013;补充50μl含25 μg/ml筛选抗生素Blasticidin HCl的培养?#28023;?0天后挑选单个细胞克隆孔传代至48?#35013;澹?#24182;逐?#29420;?#22823;培养。细胞传代至24?#35013;?8h换成无血清培养液并加入?#24352;?#24230;为5μM的诱导剂CdCl2,72h后收集细胞培养液和细胞进行WB分析。WB分析使用抗体:一抗:His-Tag(2A8)Mouse mAb(Abmart,M20001S);二抗:Anti-Mouse IgG (H+L),APConjugate(Promega,S3721)。
实施例4、重组人sST2蛋白大量诱导表达及纯化
(1)大量诱导表达
取实施例4中得到的稳定转染细胞株扩大培养后接种至3L Spinner Flask中,?#31185;?#21152;入1L无血清培养?#28023;?#25509;种细胞密度0.5-1×106细胞/ml。28℃培养24-48h后向培养液中加入诱导剂CdCl2使?#24352;?#24230;为5μM,加入诱导剂后3-4天收集细胞培养液。
(2)培养?#21495;?#32553;
取(1)中细胞培养液4℃,6000rpm/min离心10min收集细胞培养上清?#28023;?.45μm滤膜过滤后向培养上清液中加入蛋白酶抑制剂PMSF,使?#24352;?#24230;为1mM。将上述培养液使用GE公司QuixStandTM benchtop systems进行10倍浓缩和缓冲液交换。浓缩后样品可放-20℃储存。
(3)蛋白纯化
溶?#21495;?#21046;:结合缓冲?#28023;?0mM磷酸钠,500mM NaCl,20mM咪唑,pH7.4;清洗缓冲?#28023;?0mM磷酸钠,500mM NaCl,50mM咪唑,pH7.4;洗脱缓冲?#28023;?50mM磷酸钠,500mM NaCl,250mM咪唑,pH7.4。
使用GE公司His GraviTrap Column通过亲和层析的方法对人sST2重组蛋白进行纯化。纯化过程如下:His GraviTrap预装柱→10ml?#20811;?#28165;洗→10ml结合缓冲液平衡→上样→10ml-清洗缓冲液清洗→3ml洗脱缓冲?#21512;?#33073;,每ml收集一管→10ml-清洗缓冲液清洗→10ml?#20811;?#28165;洗→10ml 20%乙?#35760;?#27927;→5ml20%乙醇柱子置4℃储存。纯化后收集的洗脱液可使用超?#26031;?截留分子量30KD)浓缩。
(4)纯化结果SDS-PAGE和WB分析结果如图3和图4所示。
实施例5、抗人sST2单克隆抗体制备
(1)动物免疫
取实施例4中纯化的人sST2重组蛋白作为免疫原,免疫Balb/c小鼠(6-8周,雌鼠)4只,免疫三次,每次间隔两周。具体方法如下:
初次免疫抗原50μg,加福氏完全佐剂皮下多点注射
↓2周后
第二次免疫剂量减半,加福氏不完全佐剂皮下多点注射,5-7天后采集血清测抗体效价
↓2周后
第三次免疫剂?#23458;?#19978;,加福氏不完全佐剂皮下多点注射
↓1~2周
加强免疫,抗原25μg,不加佐剂,皮下多点注射
↓3天后
取脾细胞融合
第二次免疫后测定血清抗体效价如图5所示。
(2)杂交瘤制备和筛选
A.骨髓瘤细胞株培养
骨髓瘤细胞采用单克隆抗体制备的常用细胞株SP2/0。融合前细胞用含有8-氮鸟嘌呤的培养液处理,杀?#34013;訦AT不敏?#26800;姆底?#32454;胞。融合时选择对数期生长且细胞形态和活?#38498;?#30340;细胞,融合前一天用新鲜培养液调整细胞密度约为2×105cells/ml,第二天的细胞即可用于融合。
B.饲养层细胞制备
刚融合的细胞比?#27927;?#24369;,难以生长,需要添加一些饲养层细胞才能较快的促进细胞生长。细胞融合所用饲养层细胞为小鼠腹腔细胞。选择与免疫小鼠相同品系的Balb/c小鼠(6-8周),无菌条件下向小鼠腹腔注入预冷的培养液5-6ml,轻揉几次后取出?#27425;?#23567;鼠腹腔细胞,无血清培养?#21512;?#20004;次后,用10%FBS培养液重悬,调整细胞密度至1×105cells/ml。提前一天铺96?#35013;濉?
C.细胞融合
加强免疫后第三天,取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞在50%的PEG介导下进行细胞融合,随后用培养液终止融合作用。融合时脾细胞与骨髓瘤细胞的比例为10:1。融合完成后将细胞加入到提前一天铺有饲养层细胞的96?#35013;?#20013;。
D.阳性克隆筛选及亚克隆
使用间接ELISA方法筛选阳性克隆。筛选用抗原为实施例4中纯化的重组人sST2蛋白,二抗使用HRP标记的羊抗鼠IgG(H+L)抗体(Abmart)。经确认的阳性克隆使用有限稀释法进行亚克隆,经三次克隆化后均为阳性的细胞克隆?#27425;?#21333;克隆株,可扩大培养和冻存。
(3)腹水制备
选择6-8周Balb/c小鼠用于腹水的制备。具体操作为每只小鼠腹腔注射0.5ml液体石蜡,7-10天后注射已经定株的杂交瘤细胞,每只小鼠注射细胞量为1-3×106cells。1-2周后可见小鼠?#20849;?#26126;显膨大,用注射器抽取腹水,从腹水中即可纯化获得大量的抗体
(4)抗体纯化
使用仪器:Bio-Rad EM-1 Econo UV Monitor,Econo Gradient Pump
溶?#21495;?#21046;:结合缓冲液:20mM sodium phosphate,pH7.0;洗脱缓冲液:0.1 M glycine-HCl,pH2.7;中和缓冲液:1M Tris-HCl,pH9.0;PBS:10mM sodium phosphate,pH 7.4
处理过程:
取腹水离心(2000rpm离心5min),吸去最上层的脂肪组织,除去细胞成分和其他的沉淀物,收集上清,用冷的结合缓冲液进行20?#26029;?#37322;,12000rpm离心15min,取上清用0.45μm滤膜过滤后静置至无气泡。按照Bio-Rad仪器的使用操作规程使用甲醇和ddH2O对仪器管道进行清洗。连接好HiTrap PtoteinG HP column(1ml或5ml),设置好流速和紫外吸收值。然后按照以下步骤进行纯化。
20ml?#20811;?#28165;洗→20ml结合缓冲液平衡→上样→10ml结合缓冲液清洗→20ml洗脱缓冲?#21512;?#33073;(在吸光?#26723;?#36798;高值之前,用单独的收集管收集,一旦出?#27835;?#20809;值,马上分多管收集,建议前一两管单独收集,并且一管收集1-2ml,每ml洗脱液中可加入60–200μl中和缓冲液。)→20ml?#20811;?#28165;洗→20ml 20%乙?#35760;?#27927;,拆下柱子置4℃储存。各个流程均取样品,加入loading缓冲?#28023;?#27832;水浴10min,样品用SDS-PAGE分析抗体纯度(如图6所示)。其余的洗脱液收集至预处理好的透析袋中,用PBS溶液在4℃透析24h,中间更换3-4次透析液。收集透析后样品加入?#35270;?#33267;?#24352;?#24230;为50%,用Bio-Rad Bradford试剂测定抗体浓度,纯化好的抗体分装后置-80℃冰箱保存。
实施例6、单克隆抗体免疫印迹(Western Blot)应用与比较
样品处理:取实施例2中纯化的重组人sST2蛋白经Bio-Rad Bradford试剂。测定浓度后,稀释样?#20998;?#37325;组人sST2蛋白浓度为0.2mg/ml,加等量的2×SDS-PAGE loading缓冲?#28023;?00℃处理10min,上样(10孔PAGE?#22909;?#23380;上样量为20μl,重组人sST2蛋白含量1μg,每条?#38236;?#21152;入0.2μl PageRuler Prestained Protein Ladder 10-170kDa,Cat No.:26616用于指示?#38236;?#20301;置),10%的SDS-PAGE电泳,(电泳条件90V,30min,接着120V,40min)转膜(恒流条件下200mA,60min)。转印完成后的PVDF膜室温下置5%脱脂牛奶中封闭60min。TBST洗3次后,将膜按照?#38236;?#20301;置剪成小条,每一条分别置1ml?#24352;?#24230;为1μg/ml的单克隆抗体中(单克隆抗体来自于实施例5中纯化的抗体8D9,7C11,9B3,11E2,1A11,7F9,1A1和R&D公?#38236;?#21830;业化抗体MAB523),室?#36335;?#32946;1h后用TBST溶?#21512;?次,将所有膜小片置1:5000稀释的IRDye 800CW Goatanti-Mouse IgG(H+L)抗体溶液中孵育1h,TBST洗5次后使用ODYSSEY INFRARED IMAGING SYSTEM扫描,并使用仪器?#28304;?#30340;分析软件进行定量WB分析,结果如图7所示。
定量WB分析结果显示单克隆抗体8D9,7C11比R&D公司商业化抗体MAB523检测效果好。
另取相同的样品用15孔胶进行免疫印迹分析灵敏度验证,将处理好的样品使用2×SDS-PAGE上样缓冲液进行2倍梯度稀释,共稀释5个梯度(每孔上样量分别为1μg,0.5μg,0.25μg,0.125μg,0.063μg),按照上面的免疫印迹处理方法分析,结果如图7所示,结果分析显示单克隆抗体8D9,7C11分析灵敏度比R&D公司商业化抗体MAB523高。
通过上述免疫印迹分析显示,单克隆抗体8D9,7C11在免疫印迹分析中具有比R&D公司商业化抗体MAB523更好的分析效果。
实施例7、单克隆抗体免疫沉淀(IP)应用
取实施例2中筛选得到的果蝇S2细胞稳转株,正常传代至T75 Flask后48h,加入?#24352;?#24230;为5μM的诱导剂CdCl2,诱导重组人sST2蛋白表达。加入诱导剂后72h收集细胞培养上清?#28023;?#21462;1ml上清液液加至1.5mlEP管中,向上清液中加入20μl Recombinant Protein G (rProtein G)Agarose(Invitrogen:15920-010),EP管置旋转摇床上4℃孵育1h,12000rpm离心5min,收集离心上清?#28023;?#20998;别向每个EP管中加入50μl Recombinant Protein G (rProtein G)Agarose和实施例5中纯化的抗体8D9,7C11,9B3,11E2,1A11,7F9,1A1和R&D公?#38236;?#21830;业化抗体MAB523各1μg,EP管置旋转摇床上4℃孵育过?#26775;?2000rpm离心5min,收集离心后的沉淀物,用预冷的PBS洗3次后向每个EP管中加入100μl2×SDS-PAGE loading 缓冲?#28023;?00℃煮10min后,12000rpm离心5min收集上清?#28023;?#21462;20μl样品跑10%SDS-PAGE?#28023;?#32463;转印,封闭,一抗(His-Tag(2A8)Mouse mAb(Abmart))孵育,清洗,二抗IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG(H+L)孵育,清洗后用ODYSSEY INFRARED IMAGING SYSTEM扫描,结果如图8所示。
实施例8、单克隆抗体流式细胞术(FACS)应用与比较
细胞染色过程:冻存的PBL细胞?#27492;?#21518;,37℃培养4-6小?#20445;?#25910;集细胞,用预冷的FACS Buffer(PBS,5%FBS,0.1%NaN3 sodium azide)调整细胞数至 5×106cell/ml。加入100μl细胞悬液至12x75mmBD Falcon tubes (cat # 352052)中,加入1μg实施例5中纯化的抗体8D9,7C11,9B3,11E2,1A11,7F9,1A1和R&D公?#38236;?#21830;业化抗体MAB523,冰上孵育1h后,用FACS 缓冲?#21512;?次(1000rpm、5min)。取5μl IgG (H+L),Goat Anti-Mouse,(R-PE)(Invitrogen:M30004-1)稀释至1ml预冷的FACS 缓冲液中,取100μl重悬细胞,冰上孵育1h后用预冷的FACS缓冲?#21512;?#28068;细胞3次。用200μl FACS 缓冲液重悬后使用BD LSRII仪器进行分析,结果如图9所示。
实施例9、双抗体夹心ELISA检测sST2
利用竞争ELISA方法和抗体配对实验分析实施例5中纯化的27株单克隆抗体。通过配对分析可获得3组抗体对(8D9&11E2,7C11&11E2,9B3&1A11,上述3对抗体对中,“&”前面的抗体为包被抗体,后面的抗体为生物素标记的检测抗体)用于夹心ELISA检测sST2,可获得较好的分析效果。
双抗体夹心ELISA检测sST2操作如下:
取上述3对抗体中的包被抗体(如8D9)用包被缓冲液(Na2CO3:1.59g,NaHCO3:2.93g溶解在800ml水中,调节 pH至 9.6,定容至1000ml)稀释至2μg/ml,包被空白ELISA板(Nunc:468667),100μl/well,4℃过?#26775;?#27927;涤后加入封闭液(1%BSA,PBST,pH7.4)37℃封闭2h。充分洗涤后加入待测抗原(实施例4中纯化的重组人sST2蛋白或R&D公?#38236;腟T2 Standard【(Part 893764),0-2000pg/ml的一系列浓度梯度】37 ℃孵育1h后,用PBST洗涤4次后,加入生物素标记的检测抗体100μl(如Biotin-11E2),37℃孵育1h后用PBST洗涤4次,加入用封闭液20000?#26029;?#37322;过的 High Sensitivity Streptavidin HRP Conjugate(Pierce:21130)100μl,37℃孵育30min后用PBST洗涤4次,加入HRP底物溶液(TMB)100μl,37℃孵育20min,加入50μl终止液(2MH2SO4),用Molecular Device SpectraMax 190酶标仪记录450nm波长下每孔的吸光度,利用Excel表格对测定结果进行分析,测定结果如图10所示。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参?#36857;?#23601;如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的?#27573;А?


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