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单克隆抗体及其应用、试剂盒、检测银杏叶水溶性蛋白含量的DOTELISA方法.pdf

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单克隆抗体 及其 应用 试剂盒 检测 银杏叶 水溶性 蛋白 含量 DOTELISA 方法
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摘要
申请专利号:

CN201310740803.6

申请日:

2013.12.27

公开号:

CN104140465A

公开日:

2014.11.12

当前法律状态:

授权

有效性:

有权

法?#19978;?#24773;: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):C07K 16/16申请日:20131227|||公开
IPC分类号: C07K16/16; C12N5/20; G01N33/68; C12R1/91(2006.01)N 主分类号: C07K16/16
申请人: 江苏康缘药业股份有限公司; 扬州大学
发明人: 萧伟; 秦爱建; 王振中; 赵妮; 李芳; 钱琨; 周军; 刘秋
地址: 222067 江苏省连云港市经济技术开发区江宁工业城
优?#28909;ǎ?/td>
专利代理机构: 北京集佳知识产权代理有限公司 11227 代理人: 赵青朵
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法律状态
申请(专利)号:

CN201310740803.6

授权公告号:

||||||

法律状态公告日:

2016.08.10|||2014.12.10|||2014.11.12

法律状态类型:

授权|||实质审查的生效|||公开

摘要

本发明涉及药物制剂检测领域,特别涉及单克隆抗体及其应用、试剂盒、检测银杏叶水溶性蛋白含量的Dot-ELISA方法。本发明提供的银杏叶水溶性蛋白的单克隆抗体由保藏号为CGMCC?NO:8654的杂交瘤产生。本发明提供的Dot-ELISA方法检测银杏叶水溶性蛋白的检测限低,检测的灵敏度远远高于ELISA方法,且操作时间短。

权利要求书

权利要求书
1.  一种银杏叶水溶性蛋白的单克隆抗体,其特征在于,由保藏号为CGMCC NO:8654的杂交瘤产生。

2.  如权利要求1所述的单克隆抗体在制备检测银杏叶水溶性蛋白含量的试剂盒中的应用。

3.  一种检测银杏叶水溶性蛋白含量的试剂盒,其特征在于,包括如权利要求1所述的单克隆抗体。

4.  一种检测银杏叶水溶性蛋白含量的Dot-ELISA方法,其特征在于,包括如下步骤:
获得待测样品;
获得银杏叶水溶性全蛋白;
取硝酸?#23435;?#32032;膜,划分出第一阴性对照区、第一阳性对照区和第一检测区,经饱和、第一干燥,获得第二阴性对照区、第二阳性对照区和第二检测区;
以磷酸盐缓冲液、所述银杏叶水溶性全蛋白、所述待测样品作为抗原,取所述磷酸盐缓冲液、所述银杏叶水溶性全蛋白、所述待测样品分别包被于所述第二阴性对照区、所述第二阳性对照区、所述第二检测区,经第二干燥、封闭、洗涤、第三干燥,获得抗原膜片;所述银杏叶水溶性全蛋白的最低包被量为9.75ng;
以权利要求1所述的单克隆抗体作为第一抗体,以酶标记的羊抗鼠IgG作为第二抗体,取所述第一抗体与所述抗原膜片结合,获得第一抗体-抗原膜片;取所述第二抗体与所述第一抗体-抗原膜片结合,显色,终止显色,观察所述检测区是否出现斑点用以检测所述待测样?#20998;?#38134;杏叶水溶性蛋白含量;
所述检测区出现斑点,则所述待测样?#20998;?#38134;杏叶水溶性蛋白含量大于或等于9.75ng;
所述检测区未出现斑点,则所述待测样?#20998;?#38134;杏叶水溶性蛋白含量小于9.75ng。

5.  根据权利要求4所述的Dot-ELISA方法,其特征在于,所述抗原的点样量为1μL。

6.  根据权利要求4所述的Dot-ELISA方法,其特征在于,所述封闭的时间为1h。

7.  根据权利要求4所述的Dot-ELISA方法,其特征在于,所述第一抗体的稀释倍数为1:3200~1:6400。

8.  根据权利要求4所述的Dot-ELISA方法,其特征在于,所述第二抗体的稀释倍数为1:5000。

9.  根据权利要求4所述的Dot-ELISA方法,其特征在于,所述显色的时间为15min~20min。

10.  根据权利要求4所述的Dot-ELISA方法,其特征在于,所述第一干燥为在通风橱中干燥。

说明书

说明书单克隆抗体及其应用、试剂盒、检测银杏叶水溶性蛋白含量的Dot-ELISA方法
技术领域
本发明涉及药物制剂检测领域,特别涉及单克隆抗体及其应用、试剂盒、检测银杏叶水溶性蛋白含量的Dot-ELISA方法。 
背景技术
脑梗死又称缺血性卒中,中医称之为卒中或中风,它是由各种原因所致的局部脑组织区域血液供应障碍,导致脑组织缺血缺氧性病变坏死,进而产生临床上对应的神经功能缺失表现。脑梗死依据发病机制的不同分为脑血栓形成、?#36816;?#22622;和腔隙性脑梗死等主要类型。其中脑血栓形成是脑梗死最常见的类型,约占全部脑梗死的60%。脑梗死的临床表?#31181;?#35201;有偏瘫、失语、意识障碍等,致残率高,给患者带来极大的痛苦,给家庭及社会带来沉重的经济负担,因此,如何有效预防和治疗脑梗死依然是现代医学研究的热点。 
银杏二萜内酯葡胺注射液是用于治疗脑梗死的药物,主要功效为活血通络,用于轻中度脑梗死恢复期痰瘀阻络症(症状如半身不遂,口舌歪?#20445;杂?#36423;涩,肢体麻?#38236;齲?#38134;杏二萜内酯葡胺注射液?#19988;?#38134;杏叶为原料,经提取纯化后得到,其有效成分为银杏二萜内酯,银杏二萜内酯包括银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯K?#21462;?nbsp;
由于中药注射制剂?#26447;?#25928;成分是经过生物提取的方?#20132;?#24471;,具有生物提取物的特征,在提取的过程中不可避免地带有一些生物大分子,?#28909;?#26893;物蛋白?#30465;?#26680;酸等,而蛋白质是抗原性最强的常见物质,且蛋白质的分子量越大抗原性越强,越容易引起过敏反应或类过敏反应。如果中药注射制剂的活性成分在提取过程中纯化不完全,中药注射制剂成?#20998;?#24102;有蛋白?#35797;又剩?#33268;使中药注射制剂产品的质量?#32531;?#26684;,注射入患者体内易引起过敏反应。因此,控制银杏二萜内酯葡胺注射液中水溶性蛋白含量,?#26434;?#25552;高银杏二萜内酯葡胺注射液的质量至关重要。目前,银杏二萜内酯葡胺注射液的质量控制方面多以高效液相色谱法(HPLC)和?#33108;?#27700;杨酸沉淀法检测为主。高效液相色 谱法需使用精密仪器,费时长,不适合大批量样品的快速测定?#25442;腔?#27700;杨酸沉淀法对蛋白质产生可见沉淀(混浊)的检测限约为25μg/mL,而低于此限量的蛋白质也能够引发过敏反应。因此,提供一种检测限低,灵敏度高,准确性好,操作简便,适于大批量样品检测的检测方法,用于银杏二萜内酯葡胺注射液中水溶性蛋白的检测,具有重要的现实意义。 
发明内容
有鉴于此,本发明提供了单克隆抗体及其应用、试剂盒、检测银杏叶水溶性蛋白含量的Dot-ELISA方法。该Dot-ELISA方法检测银杏叶水溶性蛋白的最低检出量为9.75ng,检测的灵敏度远远高于ELISA方法,且操作时间短。 
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案: 
本发明提供了一种银杏叶水溶性蛋白的单克隆抗体,由保藏号为CGMCC NO:8654的杂交瘤产生。 
该杂交瘤于2013年12月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委?#34987;?#26222;通微生物中心(CGMCC),保藏中心地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研?#20811;?#20445;藏号为CGMCC NO:8654。 
本发明?#22266;?#20379;了该单克隆抗体在制备检测银杏叶水溶性蛋白含量的试剂盒中的应用。 
本发明?#22266;?#20379;了一种检测银杏叶水溶性蛋白含量的试剂盒,包括本发明提供的单克隆抗体;该单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO:8654的杂交瘤产生。 
本发明?#22266;?#20379;了一种检测银杏叶水溶性蛋白含量的Dot-ELISA方法,包括如下步骤: 
获得待测样品; 
获得银杏叶水溶性全蛋白; 
取硝酸?#23435;?#32032;膜,划分出第一阴性对照区、第一阳性对照区和第一检测区,经饱和、第一干燥,获得第二阴性对照区、第二阳性对照区和第二检测区; 
以磷酸盐缓冲液、银杏叶水溶性全蛋白、待测样品作为抗原,取磷酸盐 缓冲液、银杏叶水溶性全蛋白、待测样品分别包被于第二阴性对照区、第二阳性对照区、第二检测区,经第二干燥、封闭、洗涤、第三干燥,获得抗原膜片;银杏叶水溶性全蛋白的最低包被量为9.75ng; 
以本发明提供的单克隆抗体作为第一抗体,以酶标记的羊抗鼠IgG作为第二抗体,取第一抗体与抗原膜片结合,获得第一抗体-抗原膜片;取第二抗体与第一抗体-抗原膜片结合,显色,终止显色,观察检测区是否出现斑点用以检测待测样?#20998;?#38134;杏叶水溶性蛋白含量; 
检测区出现斑点,则待测样?#20998;?#38134;杏叶水溶性蛋白含量大于或等于9.75ng; 
检测区未出现斑点,则待测样?#20998;?#38134;杏叶水溶性蛋白含量小于9.75ng。 
在制备抗原膜片的过程中,取磷酸盐缓冲液、银杏叶水溶性全蛋白、待测样品分别包被于第二阴性对照区、第二阳性对照区、第二检测区,具体为:取磷酸盐缓冲液包被于第二阴性对照区,取银杏叶水溶性全蛋白包被于第二阳性对照区,取待测样品包被于第二检测区。 
利用Dot-ELISA方法?#28304;?#27979;样品检测的结果需要肉眼观察,如果硝酸?#23435;?#32032;膜上的斑点扩散的面积过大,则易造成串孔,对试验结果的观察带来困?#36873;?#32463;过试验条件的优化,抗原的点样量为1μL?#20445;?#35797;验结果易观察。 
如果封闭时间过长,可导致阴性对照颜色显著,使试验结果的准确率下降。经过试验条件的优化,封闭的时间为1h?#20445;?#35797;验结果的准确率较高。 
为了保证能够获得最佳的反应效果,在本发明提供的一些实施例中,第一抗体的稀释倍数为1:3200~1:6400。 
为了保证能够获得最佳的反应效果,在本发明提供的一些实施例中,第二抗体的稀释倍数为1:5000。 
为了保证能够获得最佳的反应效果,在本发明提供的一些实施例中,显色的时间为15min~20min。 
为了保证硝酸?#23435;?#32032;膜平整,有利于点样操作的进行,在本发明提供的一些实施例中,第一干燥为在通风橱中干燥。 
膜湿润时点样,易流淌,结果判断?#24065;?#36896;成阳性值下?#25285;?#19988;影响结果美观性。膜半干时点样,扩散程度最小。膜完全干燥时点样,极易扩散,结果 判断?#24065;?#36896;成阳性值判断失误,且影响结果美观性。在本发明提供的一些实施例中,经第一干燥的硝酸?#23435;?#32032;膜的含水量为10%~30%,试验结果的阳性?#21040;?#39640;。 
本发明提供了单克隆抗体及其应用、试剂盒、检测银杏叶水溶性蛋白含量的Dot-ELISA方法。本发明提供的银杏叶水溶性蛋白的单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO:8654的杂交瘤产生。通过对银杏二萜内酯葡胺注射液中银杏叶水溶性蛋白含量的检测试验,结果显示该方法最低检出量为9.75ng,而同法操作的间接ELISA方法最低检出量为156ng,表明本发明提供的Dot-ELISA方法的灵敏性远远高于ELISA方法;Dot-ELISA方法操作时间短,比ELISA方法节约2h;密封后的硝酸?#23435;?#32032;膜片在4℃条件下可保存至少3周时间而不影响试验结果的观察。由此可见,本发明提供的Dot-ELISA方法检测银杏叶水溶性蛋白的检测限低,检测的灵敏度远远高于ELISA方法,且操作时间短。 
生物保藏说明 
分类命名:抗银杏叶蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株,于2013年12月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委?#34987;?#26222;通微生物中心(CGMCC),保藏中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研?#20811;?#20445;藏号为CGMCC NO:8654。 
附图说明
图1示实施例5中经过显色的硝酸?#23435;?#32032;膜;其中,A示阴性对照区,B示阳性对照区1、C示阳性对照区2、D示阳性对照区3、E示阳性对照区4、F示阳性对照区5、G示阳性对照区6、H示检测区1、I示检测区2、J示检测区3。 
具体实施方式
本发明公开了单克隆抗体及其应用、试剂盒、检测银杏叶水溶性蛋白含量的Dot-ELISA方法,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适?#22791;?#36827;工艺参 数实现。特别需要指出的是,所有类似的替?#32531;透?#21160;对本领域技术人员来说是?#36828;?#26131;见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适?#21271;?#26356;与组合,来实现和应用本发明技术。 
本发明提供的单克隆抗体及其应用、试剂盒、检测银杏叶水溶性蛋白含量的Dot-ELISA方法中所用试剂均可由市场购得。其中,含高糖的DMEM培养基购自GIBCO公司;次黄嘌呤(H)(13.6μg/mL)、胸腺嘧啶核苷(T)(3.88μg/mL)购自Sigma公司;L-谷氨酰胺(L.G)(0.29mg/mL)购自华美生物工程公司;双抗(青霉素G100U/mL,硫酸链霉素100μg/mL)购自AMERSCO公司;HAT培养基:在HT培养基中加入?#34987;?#34678;呤(A)(1.76μg/mL)购自Sigma公司;?#22791;?#36807;氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠IgG(全分子)、碱性磷酸酶(AP)标记羊抗鼠IgG、?#34987;?#30879;呤(A)、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷(HT)购自Sigma公司;McAb亚类鉴定试剂盒购自Thermo公司;50%聚?#21494;?#37255;4000(PEG1500)购自Sigma公司;新生小牛血清为兰州民海生物工程有限公司产品;显色液BCIP/NBT购自AMERSCO公司;TMB(四甲基联苯胺)、十二烷基磺酸钠(SDS)、丙烯酰胺等购自上海生工生物公司;普通蛋白质Marker、预染的蛋白质Marker购自Fermentas公司;考马斯亮蓝R-250购自上海?#25216;?#29983;物?#30772;?#26377;限公司;硝酸?#23435;?#32032;膜(NC膜)购自WHATMAN公司;蛋白酶抑制剂购?#26376;?#27663;公司;脱脂乳购自伊利公司;其它有关试剂均为国产分析纯试剂。 
磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4):Na2HPO41.44g,KH2PO40.24g,NaCl8.0g,KCl0.2g,加蒸馏水定容至1000mL。1M Tris-Hcl(pH8.0):12.11g Tris,加入80mL双蒸水,充分搅拌溶解,缓慢加入4.2mL浓HCl,定容至100mL,4℃保存。TBS:NaCl8.8g,1M Tris-Hcl(pH8.0)20mL,加入适?#20811;?#33976;水,充分搅拌溶解,定容至1L。TBST:TBS+0.05%Tween-20。5%TBST脱脂乳:5g脱脂乳粉,加入适量TBST,充分搅拌溶解,定容至100mL。 
小鼠骨髓瘤细胞?#25285;⊿P2/0)细胞由扬州大学动物预防医学重点实验室提供;6周龄雌性BALB/C小鼠、8周龄以上雄性ICR小鼠由扬州大学比较医 学中心提供。 
CO2恒温培养箱、超低温冰箱(-70℃)均为REVCO公司产品,4℃冷冻离心机为Eppendorf公司产品;紫外分光光度计为美国Nanodrop公司产品;SW-CJ-2F型医用净化工作台为苏州安泰空气技术公司产品。 
下面结合实施例,进一步阐述本发明: 
实施例1银杏叶水溶性全蛋白(抗原)的制备 
采摘新鲜银杏叶,-70℃保存;将其剪碎,加入适量液氮研磨成粉末状;取研磨好的银杏叶粉末0.1g,加入1.5mL10%的三氯乙酸(TCA)-丙酮,-20℃2h;4℃、12000rpm/min,离心1h,弃掉上清,加入1.5mL冰浴丙酮,-20℃2h;重复前一步操作直至上清变为清亮,4℃离心弃掉上清;沉淀置于通风厨中风干,得到含银杏叶全蛋白沉淀粉末,-70℃保存。 
取含银杏叶全蛋白沉淀粉末0.15g,用1mL pH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)裂解,12000rpm/min,离心0.5h,取上清,得到银杏叶水溶性全蛋白溶液,为防止蛋白?#24335;到猓?#21152;入蛋白酶抑制剂,-20℃保存备用。以Bradford方法对银杏叶水溶性全蛋白溶液进行蛋白质定量,结果显示银杏叶水溶性全蛋白溶液中蛋白质浓度为6.3mg/mL。 
实施例2单克隆抗体的制备 
选取6周龄雌性BALB/C小鼠,以实施例1提供的银杏叶水溶性全蛋白溶液腹腔免疫注射,间隔14天一次,共免疫三次,免疫的剂量分别为100μg/只,200μg/只,200μg/只。三次免疫后再进行一次加强免疫,加强免疫的剂量为300μg/只。首免时与完全弗氏佐剂(1:1.1)混合,再次免疫时与不完全弗氏佐剂(1:1.5)混合,之后免疫不加佐剂。 
取加强免疫后72~96h的小鼠,经眼采血,麻醉后颈?#30416;?#23558;小鼠?#28388;潰?#29992;事先准备好的75%酒精浸泡,仰面用针头固定于事先消毒灭菌好放于超净台的泡沫板上,无菌剪开小鼠?#20849;科?#32932;,取出脾脏,置于含少量无血清DMEM细胞培养基的无菌平皿中,用剪刀和镊子将表面的结缔组织去除,用弯头注射器针?#33459;费?#33086;脏,使得脾细胞释?#29275;?#21046;成脾细胞悬液,备用。 
选择7瓶处于对数生长期,密度在80%~90%的骨髓瘤细胞(SP2/0细胞),用不含血清的DMEM培养基吹下计数,备用。 
将上述制备的骨髓瘤细胞与脾细胞(细胞数比例约为5~10:1)混合于一支50mL的的融合管中,1000rpm离心10min,弃去培养基,轻拍管底,使沉淀均?#20154;?#25955;成糊状,在42~45s内加入1mL37℃预热的PEG-4000试剂,并立即由慢到快加入DMEM培养液使融合终止,于37℃培养箱静置20min后离心,弃上清加入约10mL HAT培养基,轻轻吹吸混匀,此时不能用力吹打,以免使融合在一起的细胞散开。再移到约80mL HAT培养基中,取约2mL含巨?#19978;?#32990;的HAT培养基加入上述含融合细胞的培养基中,分装于96孔培养板,置于37℃5%CO2培养箱培养,5天后HAT补液,10天后用HT培养基换液,同时吸出上清检测筛选。 
当杂交瘤细胞的上清开始变黄或细胞长满?#37327;?#24213;1/10以上时吸取上清进行间接ELISA检测。将银杏叶水溶性全蛋白溶液作为包被抗原(以建立好的间接ELISA筛选方法确定最佳包被抗原浓度)。包被银杏叶水溶性全蛋白溶液时包被液为0.05M、pH9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液,100μL/孔,37℃水浴2h包被,PBST(0.01M pH7.4,Tween-200.05%)洗涤三次,加5%脱脂乳的PBST于37℃封闭2h,PBST洗涤三次后加入杂交瘤细胞上清,同时分别以高免血清和ICR小鼠血清作阳性、阴性对照,37℃作用1h;PBST洗涤三次后,加入1:10000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG,37℃作用1h,PBST洗涤五次后,加入新鲜配制的1mg/mL的底物显色液TMB(10mL显色母液+0.1mL TMB使用液+42μL0.74%H2O2,显色母液:25.7mL0.2MNa2HPO4·12H2O+0.1M柠檬酸,TMB使用液:10mg TMB+1mL DMSO)显色20min,2M H2SO4终止后ELISA读值仪测定OD450。选取上清只与包被抗原反应的培养孔细胞继续培养。 
采用有限稀释法对ELISA检测为阳性的杂交瘤细胞进行克隆化。首先制备小鼠腹腔饲养细胞,具体方法为:取一只健康的ICR小鼠,经眼采血,麻醉后颈?#30416;?#23558;小鼠?#28388;潰?#20307;表消毒和固定后,?#26377;?#37096;剪开皮肤,并将皮肤向尾巴拉,暴露整个腹膜,酒精棉球消毒腹膜。用5mL注射器,注射5mL HAT培养基到腹腔,右手固定注射器,左手持酒精棉球轻轻按摩?#20849;浚?#25277;回腹腔 内液体,置于10mL离心管中备用。将筛选得到的疑似阳性孔杂交瘤细胞转移至24孔细胞培养板中扩大培养,对重复筛选阳性的杂交瘤细胞进行亚克隆,具体操作步骤如下:将细胞上清吸去,用1mL的HT生长液将细胞轻轻吹起,以血球计数板四周的16孔为准,?#24067;?#25968;4个16孔。结果得到细胞总数为1×104。先加10mLHT到离心管中,1×104/4=2500个细胞/mL,需要三倍稀释?#21512;?0滴HT培养基,再滴加10滴细胞悬液得到800个左右细胞/mL,吸取2?#26410;?#27987;度细胞加入到9.5mL HT中,再加入0.5mL巨?#19978;?#32990;,充?#21482;?#21248;,每孔2滴加入96孔板中,再每孔补加1滴(边缘补加2滴)。?#32531;?#32622;37℃,5%CO2培养箱培养,期间切忌移动细胞板。5~6d数亚克隆,10d后根据克隆的生长情况,吸取单克隆细胞孔的上清进行筛选。每株细胞克隆2~3次,直至抗体阳性率达100%,得到单克隆抗体,并采用间接ELISA检测单克隆抗体的OD450。 
腹水型单抗的效价的检测:取8~10周龄的Balb/c小鼠,腹腔注射矿物油0.5mL,两周后,取抗体阳性率达100%的杂交瘤细胞100万稀释于DMEM培养基,腹腔注射,待小鼠?#20849;?#26126;显膨大后多次抽取腹水,将腹水5000rpm离心5min,取上清,得到腹水型单抗,于-70℃冻存备用。以实施例1提供的银杏叶水溶性全蛋白溶液作为抗原,按5μg/孔37℃水浴2h进行包被。将腹水型单抗1:200稀释后再倍比稀释(1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:25600、1:102400、1:409600、1:1638400),按照间接ELISA方法测定第一抗体(一抗)的效价,以?#22791;?#36807;氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠全分子IgG作为二抗,采用TMB显色,用2mol/L的硫酸终止反应,测定各孔OD450,检测细胞上清的单抗效价。同时设高免血清为阳性对照,正常ICR小鼠血清为阴性对照,稀?#36879;?#27700;OD450/阴性对照OD450≥2.1为阳性,对应的抗体最高稀释倍数作为该抗体的效价。 
经过检测后,获得了1株能够产生抗银杏叶水溶性蛋白的单克隆抗体(单抗)的杂交瘤细胞,保藏编号为CGMCC NO:8654,其产生的单克隆抗体命名为抗银杏叶蛋白单抗8c10。抗银杏叶蛋白单抗8c10的间接ELISA检测结果见表1。表1中的结果显示抗银杏叶蛋白单抗8c10与包被抗原?#26159;?#38451;性反应。应用间接ELISA方法证明,腹水型单抗的效价可?#28304;?#21040;1:102400(阳 性血清A450为2.385,阴性对照A450为0.253)。 
表1银杏叶蛋白单抗8c10的间接ELISA检测结果 

用Thermo公司的免疫球蛋白标?#20339;?#31867;快速鉴定试剂盒对单抗亚类进行鉴定。按照说明书操作,具体如下:取出试剂盒内分别包被?#33487;?#23545;IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、IgM、kappa轻链、lambda轻链的特异性抗体的检测条,用TBS将密度为80%杂交瘤细胞上清1:50稀释按每孔50μL加入检测条的八个不同的包被孔,再加入50μL?#22791;?#36807;氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG+IgA+IgM,轻轻混匀,室?#36335;?#32946;1h。弃去孔内液体,用洗液重复洗三次,每孔加75μL TMB显色液,15~20min后每孔加75μL终止液,酶标仪测定OD450读?#25285;?#24403;OD450≥0.2则视为阳性。结果见表2。 
表2单抗的亚类鉴定 
单抗亚类 OD450IgG10.045 IgG2a0.051 IgG2b0.684 IgG30.043 IgA 0.062 IgM 0.050 Kappa 0.587 Lambda 0.049
由表2的结果可知,单抗的亚类为IgG2b、Kappa轻链。 
实施例3检测银杏叶水溶性蛋白的Dot-ELISA方法的建立 
在硝酸?#23435;?#32032;膜光面上划2×5cm的方格(可按?#23548;?#38656;要确定大小),标成1cm×1cm/格的膜片,分别标记为阴性对照区、阳性对照区1、阳性对照区2、阳性对照区3、阳性对照区4、阳性对照区5、阳性对照区6,于0.05mol/L、pH7.4的PBS缓冲液浸泡(饱和)1h后,取出置室温或37℃的通风厨中干燥。 
用0.05mol/L、pH7.4的PBS缓冲液稀释实施例1提供的银杏叶水溶性全蛋白溶液,浓度分别为0.156μg/μL、0.078μg/μL、0.039μg/μL、0.0195μg/μL、0.00975μg/μL、0.004875μg/μL。将PBS作为阴性对照点于阴性对照区,将上述浓度分别为0.156μg/μL、0.078μg/μL、0.039μg/μL、0.0195μg/μL、0.00975μg/μL、0.004875μg/μL的银杏叶水溶性全蛋白溶液分别点于阳性对照区1、阳性对照区2、阳性对照区3、阳性对照区4、阳性对照区5、阳性对照区6,点样量分别取1.0μL,点于每一个小方格的正中央,置37℃烘箱干燥0.5h。将干燥好的硝酸?#23435;?#32032;膜浸于5%脱脂乳的TBST(pH8.0)封闭液中,37℃摇床封闭1h。将封闭好的膜片置于洗涤液中泡洗3次,每次5min(37℃摇床);室温晾干,得到抗原膜片,密封后4℃保存。 
将实施例2提供的腹水型单抗用TBST以1:6400的稀释倍数稀释至7.5mL后,放培养皿中37℃1.5h。用TBST洗3次,每次5min(37℃摇床)。 
加入碱性磷酸酶(AP)标记的羊抗鼠IgG(1:5000稀释),体积7.5mL,37℃1.5h。用TBST洗4次,TBS洗1次,每次5min。 
将显色液BCIP/NBT以TBS按1:10稀释,加入10mL于培养皿中,37℃摇床避光作用15min,加双蒸水终止反应,晾干,密封后4℃保存。 
阳性对照区1、阳性对照区2、阳性对照区3、阳性对照区4、阳性对照区5处均出?#32440;?#26126;显斑点,为阳性,阳性对照区6处的斑点不明显;阴性对照区处呈无色,为阴性。结果显示本发明提供的Dot-ELISA方法检测银杏叶水溶性蛋白的最低检出量(检测限)为9.75ng。另外,密封后的硝酸?#23435;?#32032;膜片在4℃条件下可保存至少3周时间而不影响试验结果的观察。 
实施例4检测银杏叶水溶性蛋白的Dot-ELISA方法的建立 
在硝酸?#23435;?#32032;膜光面上划2×5cm的方格(可按?#23548;?#38656;要确定大小),标 成1cm×1cm/格的膜片,分别标记为阴性对照区、阳性对照区1、阳性对照区2、阳性对照区3、阳性对照区4、阳性对照区5、阳性对照区6,于蒸馏水中浸泡30min后,取出置室温或37℃的通风厨中干燥。 
用0.05mol/L、pH7.4的PBS缓冲液稀释实施例1提供的银杏叶水溶性全蛋白溶液,浓度分别为0.156μg/μL、0.078μg/μL、0.039μg/μL、0.0195μg/μL、0.00975μg/μL、0.004875μg/μL。将PBS作为阴性对照点于阴性对照区,将上述浓度分别为0.156μg/μL、0.078μg/μL、0.039μg/μL、0.0195μg/μL、0.00975μg/μL、0.004875μg/μL的银杏叶水溶性全蛋白溶液分别点于阳性对照区1、阳性对照区2、阳性对照区3、阳性对照区4、阳性对照区5、阳性对照区6,点样量分别取1.0μL,点于每一个小方格的正中央,置37℃烘箱干燥0.5h。将干燥好的硝酸?#23435;?#32032;膜浸于5%脱脂乳的TBST(pH8.0)封闭液中,37℃摇床封闭1h。将封闭好的膜片置于洗涤液中泡洗3次,每次5min(37℃摇床);室温晾干,得到抗原膜片,密封后4℃保存。 
将实施例2提供的腹水型单抗用TBST以1:3200的稀释倍数稀释至7.5mL后,放培养皿中37℃1.5h。用TBST洗3次,每次5min(37℃摇床)。 
加入碱性磷酸酶(AP)标记的羊抗鼠IgG(1:5000稀释),体积7.5mL,37℃1.5h。用TBST洗4次,TBS洗1次,每次5min。 
将显色液BCIP/NBT以TBS按1:10稀释,加入10mL于培养皿中,37℃摇床避光作用18min,加双蒸水终止反应,晾干,密封后4℃保存。 
阳性对照区1、阳性对照区2、阳性对照区3、阳性对照区4、阳性对照区5处均出?#32440;?#26126;显斑点,为阳性,阳性对照区6处的斑点不明显;阴性对照区处呈无色,为阴性。结果显示本发明提供的Dot-ELISA方法检测银杏叶水溶性蛋白的最低检出量(检测限)为9.75ng。 
实施例5批内重复试验 
按照实施例1提供的银杏叶水溶性全蛋白的制备方法,获得两个批次的抗原,分别为第一抗原、第二抗原。 
按照实施例3提供的Dot-ELISA方法,用同一批次制备的硝酸?#23435;?#32032;膜,检测第一抗原、第二抗原,获得第一抗原、第二抗原的最低检出量,比较第 一抗原、第二抗原的最低检出量,?#20113;兰?#21046;备抗原方法的稳定性。 
结果显示,第一抗原、第二抗原最低检出量均为9.75ng,表明抗原的制备方法稳定性好,进一步表明本发明提供的基于NC膜的Dot-ELISA方法的稳定性好。 
实施例6批间重复试验 
不同批次的硝酸?#23435;?#32032;膜,包括第一硝酸?#23435;?#32032;膜、第二硝酸?#23435;?#32032;膜,按照实施例4提供的Dot-ELISA方法,用实施例1提供的抗原(同一批次提取的抗原)分部包被第一硝酸?#23435;?#32032;膜、第二硝酸?#23435;?#32032;膜,比较最低检出量,?#20113;兰?#30813;酸?#23435;?#32032;膜的稳定性。 
结果显示,采用第一硝酸?#23435;?#32032;膜、第二硝酸?#23435;?#32032;膜检测的抗原最低检出量均为9.75ng,表明硝酸?#23435;?#32032;膜的稳定性好,进一步表明本发明提供的Dot-ELISA方法的稳定性好。 
实施例7银杏二萜内酯葡胺注射液的检测 
取市售的银杏二萜内酯葡胺注射液,批号分别为120501、121201、121202,进行银杏叶水溶性蛋白含量的检测。具体方法如下: 
在硝酸?#23435;?#32032;膜光面上划2×5cm的方格(可按?#23548;?#38656;要确定大小),标成1cm×1cm/格的膜片,分别标记为阴性对照区、阳性对照区1、阳性对照区2、阳性对照区3、阳性对照区4、阳性对照区5、阳性对照区6、检测区1、检测区2、检测区3,于0.05mol/L、pH7.4的PBS缓冲液中浸泡30min后,取出置室温或37℃的通风厨中干燥。 
用0.05mol/L、pH7.4的PBS缓冲液稀释实施例1提供的银杏叶水溶性全蛋白溶液,浓度分别为0.156μg/μL、0.078μg/μL、0.039μg/μL、0.0195μg/μL、0.00975μg/μL、0.004875μg/μL。将PBS作为阴性对照点于阴性对照区;将上述浓度分别为0.156μg/μL、0.078μg/μL、0.039μg/μL、0.0195μg/μL、0.00975μg/μL、0.004875μg/μL的银杏叶水溶性全蛋白溶液分别点于阳性对照区1、阳性对照区2、阳性对照区3、阳性对照区4、阳性对照区5、阳性对照区6;取批号为120501、121201、121202的银杏二萜内酯葡胺注射液分别点于检测 区1、检测区2、检测区3;点样量分别取1.0μL,点于每一个小方格的正中央,置37℃烘箱干燥0.5h。将干燥好的硝酸?#23435;?#32032;膜浸于5%脱脂乳的TBST(pH8.0)封闭液中,37℃摇床封闭1h。将封闭好的膜片置于洗涤液中泡洗3次,每次5min(37℃摇床);室温晾干,得到抗原膜片,密封后4℃保存。 
将实施例2提供的腹水型单抗用TBST以1:4800的稀释倍数稀释至7.5mL后,放培养皿中37℃1.5h。用TBST洗3次,每次5min(37℃摇床)。 
加入碱性磷酸酶(AP)标记的羊抗鼠IgG(1:5000稀释),体积7.5mL,37℃1.5h。用TBST洗4次,TBS洗1次,每次5min。 
将显色液BCIP/NBT以TBS按1:10稀释,加入10mL于培养皿中,37℃摇床避光作用20min,加双蒸水终止反应,晾干,密封后4℃保存。 
经过显色的硝酸?#23435;?#32032;膜如图1所示。 
由图1可以看出,阳性对照区1、阳性对照区2、阳性对照区3、阳性对照区4、阳性对照区5处均出?#32440;?#26126;显斑点,为阳性,阳性对照区6处出现的斑点不明显;阴性对照区处呈无色,为阴性;检测区1、检测区2、检测区3均未见明显斑点,表明批号为120501、121201、121202的银杏二萜内酯葡胺注射液中无高于9.75ng银杏叶水溶性蛋白存在,产?#20998;?#37327;符合国?#20918;?#20934;。 
对比例1检测银杏叶水溶性蛋白的ELISA方法研究 
取实施例1提供的银杏叶水溶性全蛋白溶液,进行ELISA检测,检测最低检出量。具体试验操作为: 
以0.05M、pH9.6的碳酸?#20255;?#34987;缓冲液稀释实施例1提供的银杏叶水溶性蛋白,制得蛋白溶液,96孔酶标板1-12列按列分别加入含有5μg、5μg、5μg、2.5μg、1.25μg、0.625μg、0.312μg、0.156μg、0.078μg、0.039μg、0.0195μg、0.00975μg的蛋白溶液,四复孔,4℃过夜。PBST洗板3次,含5%小牛血清的PBST溶液37℃封闭1h,再洗板3次,1列加入ICR小鼠血清作为阴性对照,2列加入高免血清做阳性对照,3-12列分别加入1:1600稀释的8c10腹水;37℃1h,PBST洗涤三次后,加入1:10000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG,37℃作用1h,PBST洗涤五次后,加入新鲜配制的1mg/mL的底物显色液TMB显色20min,2M H2SO4终止后ELISA读值仪测定OD450。 
结果显示,ELISA方法最低检出量为156ng,而本发明提供的Dot-ELISA方法最低检出量为9.75ng,表明本发明提供的Dot-ELISA方法的灵敏性远远高于ELISA方法;Dot-ELISA方法操作时间短,比ELISA方法节约2h;NC膜易于存放。 
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,?#26434;?#26412;技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润?#25105;?#24212;视为本发明的保护范围。 

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