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HIV1GP41前发夹中间物的稳定肽模拟物.pdf

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HIV1GP41 发夹 中间 稳定 模拟
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摘要
申请专利号:

CN201380015435.7

申请日:

2013.03.15

公开号:

CN104203276A

公开日:

2014.12.10

当前法律状态:

撤回

有效性:

无权

法?#19978;?#24773;: 发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):A61K 39/21申请公布日:20141210|||实质审查的生效IPC(主分类):A61K39/21申请日:20130315|||公开
IPC分类号: A61K39/21; C12N7/00; G01N33/53; A61K38/00 主分类号: A61K39/21
申请人: 默沙东公司
发明人: J.G.乔伊斯; C.吴; E.A.奥蒂格尔; V.加斯基
地址: 美国新泽西州
优?#28909;ǎ?/td> 2012.03.20 US 61/613264
专利代理机构: 中国专利代理(香港)有限公司 72001 代理人: 李波;万雪松
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法律状态
申请(专利)号:

CN201380015435.7

授权公告号:

||||||

法律状态公告日:

2017.04.05|||2015.04.22|||2014.12.10

法律状态类型:

发明专利申请公布后的视为撤回|||实质审查的生效|||公开

摘要

本发明涉及在化学支架上具有三个gp41N-肽的gp41三价肽模拟物,其在构象上将N-肽限制为三聚体卷曲螺旋,以模拟gp41呈现。本发明还涉及具有整个HIVgp41NH2-末端七肽重复区域,并且能够形成gp41肽模拟物的N-肽。HIV-1gp41前发夹中间物的此类肽模拟物可以用于疫苗中,用于通过引发中和抗体治疗或预防HIV-1感染。

权利要求书

权利要求书
1.  一种包含支架核心的gp41肽模拟物,所述支架核心连接至三个N-肽,其中每个N-肽包括包含N36                                                的氨基酸序列或其修饰形式,其中所述三个N-肽彼此相互作用以形成三聚卷曲螺旋,其模拟HIV gp41的前发夹构象,条件是所述gp41肽模拟物不是(CCIZN36)3。

2.  权利要求1的gp41肽模拟物,其中所述三个肽的每一个在不同连接点?#24067;?#36830;接至所述支架核心。

3.  权利要求1的gp41肽模拟物,其中所述支架核心包含下述或?#19978;?#36848;组成:三(2-羧?#19968;?膦盐酸盐;三琥珀酰?#21069;?#27688;基三乙酸酯;三-(2-马来酰?#21069;芬一?胺;KTA-溴化物或胆酸。

4.  权利要求3的gp41肽模拟物,其中所述支架核心是KTA-溴化物或胆酸。

5.  权利要求1的gp41肽模拟物,其中所述支架核心?#21069;?#21547;三个官能化残基的线性多肽链,所述三个官能化残基允许三个N-肽的连接。

6.  权利要求5的gp41肽模拟物,其中所述支架核心包含:




7.  权利要求2的gp41肽模拟物,其中所述支架核心?#21069;?#21547;环?#21644;欏?#29615;庚烷或环辛烷的碳环支架。

8.  权利要求2的gp41肽模拟物,其中所述支架核心?#21069;?#21547;吡咯烷、氧杂环戊烷、硫杂环戊烷、哌啶、噁烷、硫杂环?#21644;欏?#27694;杂环庚烷、氧杂环?#21644;欏?#30827;杂环庚烷、哌嗪、吗啉或硫代吗啉的杂环支架。

9.  权利要求1的gp41肽模拟物,其中一个或多个N-肽包含N51




10.  权利要求1的gp41肽模拟物,其中每个N-肽由N51

组成。

11.  权利要求1的gp41肽模拟物,其中所述N-肽包含相同或不同氨基酸序列。

12.  权利要求1的gp41肽模拟物,其中所述N-肽?#19978;?#21516;的氨基酸序列组成。

13.  权利要求1的gp41肽模拟物,其中一个或多个N-肽?#20052;?#21512;N-肽,其包含:
a) 包含能够形成三聚卷曲螺旋的可溶性α螺旋区域的支架部分;和
b) 包含HIV gp41 NH2-末端七肽重复区域的全部或部分的N-肽部分,
其中所述支架部分在螺旋相中与所述N-肽部分融合,形成α螺旋结构域,并且其中所述三个N-肽彼此相互作用以形成三聚卷曲螺旋。

14.  权利要求13的gp41肽模拟物,其中所述嵌合N-肽的N-肽部分在螺旋相中与所述嵌合N-肽的支架部分的COOH-末端融合。

15.  权利要求13的gp41肽模拟物,其中所述嵌合N-肽的支架部分包含:
a) Suzuki-IZ卷曲螺旋基序;
b) IZ卷曲螺旋基序或
c) EZ卷曲螺旋基序。

16.  一种gp41肽模拟物,其为:




17.  权利要求16的gp41肽模拟物,其为KTA(N51)3。

18.  一种免疫原性组合物,其包含权利要求1的gp41肽模拟物和药学可接受的载体。

19.  一种在哺乳动物宿主中引发免疫应答的方法,其包括将预防有效量的权利要求18的免疫原性组合物引入所述哺乳动物宿主内。

20.  权利要求19的方法,其中所述哺乳动物宿主是人。

说明书

说明书HIV-1 GP41前发夹中间物的稳定肽模拟物
发明领域
本发明涉及构象受限的三价gp41肽模拟物及其作为免疫原引发针对HIV的中和抗体的用途。本发明还涉及具有整个HIV gp41 NH2末端七肽重复区域或其修饰形式,并且能够形成gp41肽模拟物的N肽。
发明背景
人免疫缺陷病毒(HIV)是获得性免疫缺陷综合征(AIDS)和相关病症的致病因子。虽然AIDS的有效治疗是可获得的,但用于预防HIV-1感染的有效预防疫苗的开发已由于不能鉴定并优化免疫原而被阻碍,所述免疫原能够诱导广泛中和抗体以预防病毒进入。
已进行相当大的研究量,以评估HIV-1包膜糖蛋白作为免疫原的用途。HIV-1包膜糖蛋白作为160 kDa前体合成,其由宿主细胞蛋白酶切割成120 kDa受体结合亚基(gp120)和41 kDa膜锚定亚基(gp41)。在gp120与CD4以及容许细胞上的相关CXCR4或CCR5趋化因子共受体的序贯结合后,在包膜糖蛋白亚基中发生广泛构象变化,从而使得先前埋入的三聚gp41核心瞬时暴露,并最终导致病毒和细胞膜的融合以及病毒内容物插入宿主细胞的细胞质内。
在gp41插入靶宿主细胞膜内后,为广泛的重排,其中gp41的两亲C末端七肽重复(CHR)区域以反向平行方式塞入由三聚体的N末端七肽重复(NHR)部?#20013;?#25104;的疏水口袋内,以形成6螺旋“发夹三聚体”结构。发夹三聚体结构是六个α螺旋的束:以针对中心反向平行方式塞入的三个α螺旋(由来自三个gp41胞外域的C螺旋区域形成)、三链卷曲螺旋(由来自三个gp41胞外域的N螺旋区域形成)。该重排提供了必要几何形状和能量以?#20849;?#27602;和细胞膜达到并列(apposition),其随后为脂质混合和膜融合。
已发现合成的NHR和CHR肽展示有效的抗病毒活性并?#20918;?#35748;为通过显性失活机?#30772;?#20316;用,其中它们与新生融合中间物结合,并且阻?#20808;?#21512;活性6螺旋束的形成。前发夹中间物的可溶性三聚肽模拟物已通过使衍生自酵母转?#23478;?#23376;GCN4的异源三聚结构域与不同残基长度的gp41 NHR融合进行制备。此类构建体在美国专利号7,960,504和7,811,577以及美国专利申请公开号20100092505中描述。类似地,通过在细菌中的重组表达产生的重组5螺旋肽,由通过短接头分开的交替NHR和CHR序列组成的单链多肽由美国专利号7,053,179和7,504,224描述。用于使这些肽稳定的一?#22336;?#27861;是通过使用半胱氨酸残基。参见美国专利号7,811,577;Bianchi等人,2009,Adv Exp Med Biol 611:121-3;Bianchi等人,2010,Proc Natl Acad Sci USA 107:10655-10660;和Bianchi等人,2005,Proc Natl Acad Sci USA 120:12903-12908。用于使gp41肽稳定的其他方法包括美国专利号7,728,106和7,604,804中描述的?#20999;?
发明概述
本发明涉及构象受限的三价gp41肽模拟物及其作为免疫原引发针对HIV的中和抗体的用途。gp41肽模拟物呈现为结构稳定形式的完整HIV-1 gp41 N-七肽重复(NHR)区域的全部或一部分,其模拟天然前发夹融合中间物,并且引发能够中和HIV-1病毒的免疫应答。
相应地,本发明涉及包含连接至三个N-肽的支架核心的gp41肽模拟物,其中每个N-肽包括包含N36                                                的氨基酸序列或其修饰形式,其中三个N-肽彼此相互作用以形成三聚卷曲螺旋,其模拟HIV gp41的前发夹构象,条件是gp41肽模拟物不是(CCIZN36)3。在特定实施方案中,三个肽各自在不同连接点?#24067;?#36830;接至支架核心。
在某些实施方案中,gp41肽模拟物包含支架核?#27169;?#25152;述支架核心包含三(2-羧?#19968;?膦盐酸盐;三琥珀酰?#21069;?#27688;基三乙酸酯;三-(2-马来酰?#21069;芬一?胺;KTA-溴化物或胆酸。在特定实施方案中,支架核心是KTA-溴化物或胆酸。
在其他实施方案中,gp41肽模拟物包含支架核?#27169;?#25152;述支架核心?#21069;?#21547;三个官能化残基的线性多肽链,所述三个官能化残基允许三个N-肽的连接。在特定实施方案中,所述支架核心包含:



在另外其他实施方案中,gp41肽模拟物包含支架核?#27169;?#25152;述支架核心?#21069;?#21547;环?#21644;欏?#29615;庚烷或环辛烷的碳环支架。在另外其他实施方案中,gp41肽模拟物包含支架核?#27169;?#25152;述支架核心?#21069;?#21547;吡咯烷、氧杂环戊烷、硫杂环戊烷、哌啶、噁烷、硫杂环?#21644;?thiane)、氮杂环庚烷、氧杂环?#21644;?oxepane)、硫杂环庚烷(thiepane)、哌嗪、吗啉或硫代吗啉的杂环支架。
在本发明的某些实施方案中,N-肽包含N51

。在特定实施方案中,N-肽由N51

组成。
在某些实施方案中,N-肽可以包含相同或不同氨基酸序列。在特定实施方案中,N-肽?#19978;?#21516;氨基酸序列组成。
在某些实施方案中,一个或多个N-肽?#20052;?#21512;N-肽,其包含:
a)    包含能够形成三聚卷曲螺旋的可溶性α-螺旋区域的支架部分;和
b)    包含HIV gp41 NH2-末端七肽重复区域的全部或部分的N-肽部分,
其中支架部分在螺旋相中与N-肽部分融合,形成α螺旋结构域,并且其中三个N-肽彼此相互作用以形成三聚卷曲螺旋。在这个实施方案的某些方面,嵌合N-肽的N-肽部分在螺旋相中与嵌合N-肽的支架部分的COOH末端融合。在这个实施方案的特定方面,所述嵌合N-肽的支架部分包含:
a) Suzuki-IZ卷曲螺旋基序
b) IZ卷曲螺旋基序或
c) EZ卷曲螺旋基序。
本发明还涉及gp41肽模拟物,其为:



在特定实施方案中,所述gp41肽模拟物是KTA(N51)3。
本发明还涉及包含本发明的gp41肽模拟物和药学可接受的载体的免疫原性组合物。
本发明还涉及在哺乳动物宿主中引发免疫应答的方法,其包括将预防有效量的本发明的免疫原性组合物引入所述哺乳动物宿主内。在某些实施方案中,哺乳动物宿主是人。
附图简述
图1A-B。HIV-1 gp41肽模拟物的图解表示:A) 示意性结构,其中两亲卷曲螺旋式的螺旋HIV-1 N-肽和SZ或IZ三聚结构域描述为不同阴影的圆柱体。描述了多?#21482;?#23398;支架核心的结构;B) 化学结构,描述了基于CCIZ、KTA和胆酸支架的三聚策略并?#20801;?#20102;肽序列的连接。
图2。对于在豚鼠研究HIV-350和HIV-365中的动物个体的中和抗体滴度。测定是使用病毒?#23616;闢570A测试的p4/2R5。结果对于取血前(T=0)?#20801;?#20026;空心圆圈并且对于剂量3后取血(T= 11周)?#20801;?#20026;实心圆圈。组几何平均值由横杠指示。测定的定量极限由虚线?#20801;尽?
图3。对于NHP研究HIV-360,动物个体的ELISA应答。箭?#20998;?#31034;在0、4、8和34周时用(CCIZN36)3,以及在62和66周时用同源或异源抗原进行相应免疫接种后的取血日期。曲线是●,(CCIZN36)3同源的;○,(CCIZN36)3,/ KTA(N51)3 / 5-螺旋;▲,(CCIZN36)3,/ 5螺旋 / KTA(N51)3。
图4。对于NHP研究HIV-360,动物个体的DCBA应答。箭?#20998;?#31034;在0、4、8和34周时用(CCIZN36)3,以及在62和66周时用同源或异源抗原进行相应免疫接种后的取血日期。曲线是●,(CCIZN36)3同源的;○,(CCIZN36)3,/ KTA(N51)3 / 5螺旋;▲,(CCIZN36)3,/ 5螺旋 / KTA(N51)3。测定的定量极限由虚线?#20801;尽?
图5A-B。对于NHP研究HIV-360中的动物个体的中和抗体滴度。结果?#20801;?#23545;于在最后一次免疫接种后两周(T=68周)收集的血样,通过中和测定和病毒测试的结果。小图A,使用病毒V570A和HXB2的P4/2R5测定。小图B,使用病毒9020.A13和SC22.3C2的A3R5测定。组几何平均值由实心横杠指示。测定的定量极限由虚线?#20801;尽?#25324;号指示通过Tukey检验在组间的显著性。为了简化轴标记,免疫原缩写为"N36",(CCIZN36)3;"N51",KTA(N51)3;和"5H",5-螺旋。
图6。对于NHP研究HIV-360中的动物个体的中和抗体宽度。结果对于在最后一次免疫接种后两周(T=68周)收集的血样,按动物个体和组?#20801;尽?#25152;有结果均来自A3R5测定。测定的定量极限由虚线?#20801;尽?#30149;毒进化枝和层(Tier)名称在图例中指示。为了简化轴标记,免疫原缩写为"N36",(CCIZN36)3;"N51",KTA(N51)3;和"5H",5-螺旋。
图7A-B。按照在NHP研究HIV-360中的研究期,对于动物个体的比较中和抗体滴度。对于研究分部(arms)的1期(小图A?#21644;?#28304;的(CCIZN36)3给药方案)和2期(小图B:异源抗原施用),结果按动物个体和组?#20801;尽?#25152;有结果均来自P4/2R5测定。在T=36或T=68周时的组几何平均值由横杠指示。测定的定量极限由虚线?#20801;尽?I>小图A,直到1期结束的中和结果。T=0,取血前;T=13,剂量3后5周;T=36,剂量4后2周;小图B,直到2期结束的中和结果。T=62,在同源相对于异源比较起始前收集的血样;T=68,最后一次剂量后2周。
图8A-B。对于在NHP研究HIV-366中的最后一次免疫接种后2周(T=38周)收集的血样,通过P4/2R5和TZM-bl测定来测定的对于动物个体的中和抗体滴度。结果对于动物个体,按组?#20801;尽?#25152;有结果均使用病毒V570A_HXB2病毒测量,在小图A中为P4/2R5测定,或在小图B中为TZM-bl测定。组几何平均值由实心横杠指示。测定的定量极限由虚线?#20801;尽?#25324;号指示通过Tukey检验在组间的显著性。为了简化轴标记,免疫原缩写为"N36",(CCIZN36)3;"N51",KTA(N51)3;和"5H",5-螺旋。
图9A-B。通过A3R5测定来测定的对于动物个体的中和抗体滴度。小图A,针对病毒Ce0393测试的在最后一次免疫接种后2周(T=38周)收集的血样。小图B,针对病毒MW965测试的在第三次剂量免疫接种后2周(T=26周)收集的血样。组几何平均值由实心横杠指示。测定的定量极限由虚线?#20801;尽?#25324;号指示通过Tukey检验在组间的显著性。为了简化轴标记,免疫原缩写为"N36",(CCIZN36)3;"N51",KTA(N51)3;和"5H",5-螺旋。
发明详述
在一个方面,本发明涉及包含借助于支架,在构象限制为三聚卷曲螺旋的三个gp41肽的gp41肽模拟物。特别地,本发明的这个方面涉及包含支架核心的gp41肽模拟物,所述支架核心与三个N-肽连接,其中每个N-肽包括包含或其修饰形式的N肽部分,其中三个N-肽彼此相互作用,以形成模拟HIV gp41的前发夹构象的三聚卷曲螺旋。
在另一个方面,本发明涉及具有整个HIV gp41 NH2-末端七肽重复区域,即N51

或其修饰形式,并且能够形成gp41肽模拟物的N-肽,以及由其形成的gp41肽模拟物。
本发明部?#21482;?#20110;本申请人的下述观察:如实施例中举例说明的,在啮齿类、豚鼠和非人灵长类免疫原性研究中,构象受限的KTA(N51)3在引发针对一组病毒分离物的中和抗体应答中优于重组5螺旋肽和(CCIZN36)3。
虽然不希望受任何理论束缚,认为本发明指导在接种疫苗的哺乳动物中的免疫应答,以集中于高度保守的gp41前发夹构象中间物,其含有特异性D5表位中和组分。这通过使用支架核心在构象上限制gp41肽模拟物来实现,以稳定三聚卷曲螺旋中的中和表位的呈现。在一些实施方案中,这些构象上稳定、可溶性gp41肽模拟物潜在提供了不同于D5表位的另外中和表位。
如本文使用的,“嵌合N肽”或“嵌合肽”定义为这样的肽,所述肽包含融?#29616;?#33021;够获得三聚卷曲螺旋构象的α螺旋支架蛋白质的,gp41的NH2末端七肽重复结构域(NHR)的全部或部分(一般至少N17或N36),或其修饰形式。支架蛋白质是非HIV序列。
如本文使用的,术语“表位”涉及能够与抗体特异性结合的蛋白质决定簇。众所周知表位通常由化学活性的分子表面分组例如氨基酸或糖侧链组成,并且通常具有特异性三维结?#22266;?#24449;,以及比电荷特征。构象和非构象表位区别在于前者而不是后者的结合在变性溶剂的存在下丧失。
如本文使用的,在提及N肽构建体中的“异源的?#24065;?#25351;在下述中不同的N肽构建体:(1)gp41序列(长度和/或修饰),或(2)任何支架结构域(例如IZ、EZ、SZ)的同一性或长度。
如本文使用的,“HIV?#24065;?#27442;表示HIV-1、HIV-2或HIV-1和/或HIV-2。
如本文使用的,“N肽”定义为这样的肽,其包含gp41的NH2末端七肽重复结构域(NHR)的全部或部分(一般至少N17或N36),或其修饰形式,并且能够单独或通过使用支架结构域而获得三聚卷曲螺旋构象。
如本文使用的,“中和?#27604;?#26412;领域中用于指示抗体在体外基于细胞/病毒的测定例如实施例1和2中所述的?#20999;?#20013;阻止或减少病毒感染的能力。中和活性可以定量测量为关于该特异性抗体的IC50值。“中和抗体”或“HIV中和抗体”在领域公认的传染性测定中?#20801;?#20013;和至少一种HIV分离物。
如本文使用的,“支架核心”涉及如本文公开和/或描述的化学结构,其为具有至少三个部分的环状或线性化学化合物,所述部分各自可以直接或通过接头连接至gp41 N肽。
本发明的gp41肽模拟物模拟在有包膜病毒膜融合蛋白的促融合构象内含有的内部、三聚卷曲螺旋基序,特别是HIV gp41胞外域的内部卷曲螺旋结构域。这些模拟物包含三个N肽,其可以?#20052;?#21512;N肽,其一起形成gp41融合前中间物的三聚卷曲螺旋特征。在一些实施方案中,N肽?#20052;?#21512;N肽,其包含在螺旋相位中融?#29616;罤IV gp41的N螺旋的全部或部分的非HIV、可溶性、三聚形式的卷曲螺旋,或其修饰形式。在本发明的某些方面,三个N肽通过使用支架核心在同源三聚或异源三聚卷曲螺旋结构中?#24067;?#31283;定,所述支架核心构象限制N肽。
在某些实施方案中,N肽包含HIV gp41 NH2末端七肽重复结构域的全部或部分,或其修饰形式。N肽可以包含例如N17、N36、N38、N44或N51。在其他实施方案中,N肽?#20052;?#21512;肽,其包含:1)包含能够形成三聚卷曲螺旋的可溶性α螺旋区域的支架部分;和2)包含HIV gp41 NH2末端七肽重复区域(例如N17、N36或N51)的全部或部分的N肽部分,和任选的,3)包含至少两个半胱氨酸残基的半胱氨酸部分,其中支架部分在螺旋相位中融?#29616;罭肽部分,形成α螺旋结构域,并且所述半胱氨酸部分(如果存在的话)位于在NH2或COOH末端的所述α螺旋结构域的外部。半胱氨酸部分的存在帮助使嵌合肽?#24067;?#38480;制为三聚形式。这些N肽的?#24067;?#31283;定允许呈现HIV gp41的中心、三聚、N螺旋式卷曲螺旋的稳定、暴露部分。
gp41肽模拟物包含N肽,所述N肽包含衍生自HIV-1 gp41的N七肽重复区域的全部或部分。HIV-1 gp41胞外域代表大约169个氨基酸残基,如根据其在参考?#23616;闔XB2的HIV-1 gp160包膜蛋白质中的位置编号的残基512-681。在该胞外域中的是定位邻近预期为形成α螺旋的胞外域的NH2末端部分的4-3七肽重复区域。该N七肽重复分别定位在大约gp160的氨基酸位置541-592(参见例如Caffrey等人,1998,EMBO J. 17:4572-4584)。
本发明的所述肽模拟物的N肽结构域包含足够量的gp41的N螺旋区域,以与由糖蛋白的C螺旋结构域形成的α螺旋结合。通常,来自N螺旋结构域的17个或更多个、或者36个或更多个氨基酸残基,直到并包括所述结构域的所有51个残基,可以包含N肽的HIV gp41组分。可以使用在N肽区域内的任何序列,只要它呈现表位。然而,短于约36、40、45或50个氨基酸的序列可能需要提供支架结构域的另外肽序列,所述支架结构域将在下文更详细地?#33268;邸?
在本发明的一个实施方案中,如本文描述的N肽包含位于HIV-1 gp41的NHR的COOH末端一半处的至少36个氨基酸,?#26434;?#20110;gp160序列的残基546至581(下文被称为"N36";SEQ ID NO:1)。在某些实施方案中,N肽包含下述、基本上?#19978;?#36848;组成或?#19978;?#36848;组成:gp41残基546至583(下文被称为"N38";SEQ ID NO:2))。在某些实施方案中,N肽包含下述、基本上?#19978;?#36848;组成或?#19978;?#36848;组成:具有在NH2末端处添加的六个氨基酸的gp41残基546至583(下文被称为"N44";SEQ ID NO:3))。在某些实施方案中,N肽包含下述、基本上?#19978;?#36848;组成或?#19978;?#36848;组成:gp41残基540至590(下文被称为"N51";SEQ ID NO:4))。此类肽包含HIV-1 gp41 N七肽重复区域和N末端极性结构域的部分。在这些实施方案中,N肽设计为允许在?#24067;?#31283;定的构象受限三聚体的背景下呈现全长NHR。另外的N肽可以包括在N36和N51之间的任何序列。说明书?#20801;?#33267;终提及HIV gp160序列的所有编号均基于HIV-1分离物HXB2。
在其他实施方案中,N肽可以包含衍生自gp41蛋白质内的NHR直接上游或直接下游的序列的另外HIV序列。例如,嵌合肽可以包含gp41残基528至590(下文被称为"N63"


N肽还可以?#19988;?#29983;型HIV N螺旋七肽结构域的修饰形式,条件是所得到的肽是如本文描述的哺乳动物细胞的HIV感染的抑制剂,和/或能够生成靶向融合中间物的构象表位的中和抗体。具有在天然NHR中制备的修饰的N肽必须维持HIV N肽结构域的三聚能力和表面结构。例如,非中和、免疫优势区域(即最容易由免疫系?#21576;?#21035;并因此最影响诱导抗体的特异性的抗原决定簇亚基)可?#28304;?#22312;于用于生成N肽的N肽序列内。NHR(N36或N51,如适用的)的修饰形式可以具有从来自HIV?#23616;闔XB2的天然gp160序列的1个氨基酸变化、直到两个氨基酸变化、直到三个氨基酸变化、直到四个氨基酸变化、直到五个氨基酸变化、直到六个氨基酸变化、直到七个氨基酸变化或直到八个氨基酸变化。修饰可以包括氨基酸插入、缺失和/或取代。尽管一般地,为?#23435;?#25345;适当定位,修饰是取代。
NHR的丙氨酸扫描已鉴定免疫优势区域。该免疫优势区域生成非中和抗体,位于极端COOH末端部分中。氨基酸残基精氨酸579(R579)看起来对于非中和单克隆抗体结合是关键的;并且残基谷氨酰胺577(Q577)和亮氨酸581(L581)也参与结合,但取决于测试的单克隆而?#20801;?#21487;变贡献。涉及小鼠单克隆抗体结合的这些残基在分子底部处形成环,其可能代表在NHR中的免疫优势表位。有趣的是,内衬在三聚、N螺旋式卷曲螺旋的疏水口袋的氨基酸残基位于该假定免疫优势表位的进一步NH2末端。疏水口袋已鉴定为包含与新近鉴定的HIV中和抗体D5 IgG结合的结构域;因此,疏水口袋被认为含有假定的中和构象表位(参见美国专利号7,744,887)。因此,用于生成N肽的N肽结构域可以在使所述鉴定的非中和免疫优势结构域的抗原应答?#26723;阶?#20302;的尝试中进行修饰或缩短,使免疫应答借助于疏水口袋内的假定中和表位。例如,在N36或N51的修饰形式,N36的极端COOH末端部分可以在下述残基中的任?#25105;?#20010;或多个处突变:亮氨酸581(L581)、精氨酸579(R579)、谷氨酰胺577(Q577)和/或谷氨酰胺575(Q575)。优选每个残基突变为丙氨酸(A)氨基酸,因为丙氨酸可以参与α螺旋形成,并且因?#31169;?#19981;破坏肽的卷曲螺旋结构。另外,丙氨酸具有小侧链,并且因?#31169;允?#23545;于抗体最小的可能结合表面。甘氨酸或脯氨酸残基没有侧链并且可以视为用于这些突变的更佳选择;然而,所述氨基酸已知破坏α螺旋构象。在本发明的一个实施方案中,N肽包含在所有四个所述残基(L581A、R579A、Q577A和Q575A)处突变的序列,形成具有下述序列的指定为“N17Ala4”的N肽结构域:。突变的氨基酸是是有下划线的的。
N肽的N肽部分也可以进行修饰,以进一步使整体肽稳定。例如,N肽结构域可以进行修饰,以将更稳定的异亮氨酸残基掺入序列内。因此,例如,在本发明的一个实施方案中,N肽可以在“a”和“d”塞入位置处突变,以如下掺入所述异亮氨酸残基:指定“N17Ile?#20445;?#31361;变的残基是有下划线的)。
其他修饰可以在N肽序列中作出,以便寻求在三聚体稳定和/或疏水口袋呈现和/或D5表?#29615;?#38754;的优点。
已制备N51序列的修饰形式,以增加所得到的三聚体的稳定性和/或减少聚集倾向。此类肽的例子包括N51-2B和N51-3B。N51-2B具有下述序列:

。N51-3B具有下述序列:


N51修饰形式的其他例子包括表1中的肽。

应当理解如N51序列中例示的这些相同修饰同样可以应用于更短序列。
因此,适用于本发明组合物的特异性修饰包括在下述位置(全部指HXB2中的位置)处的取代:
。特异性修饰包括下述取代:


用于生成N肽的HIV gp41的N螺旋部分可?#28304;親IV-1、HIV-2、另一种HIV?#23616;?#25110;来自另一个慢病毒物种(例如猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)或绵羊髓鞘脱落病毒)的?#23616;?#20013;分离。在相似的HIV?#23616;?#21644;/或其他物种的免疫缺陷病毒中的相应N肽序列可以容易地鉴定并且是本领域已知的。另外,α螺旋、卷曲螺旋结构域已在其他有包膜病毒的膜融合蛋白质中鉴定(参见Singh等人,1999,J Mol Biol. 290:1031-41)。
此外,对于本文描述的肽序列中的每一种,N肽结构域可以延长一至十二个氨基酸,其不是gp41序列的部分。例如,Weissenhom等人(1997,Nature 387:426-430)使N36肽在NH2末端处延长五个氨基酸,并且在N36肽序列的COOH末端处延长七个氨基酸残基:

。因此,N肽可以进一步包含位于N36肽结构域的全部或COOH末端部分的COOH末端的七个另外氨基酸的全部或部分,具体地。因此,在一个实施方案中,N肽包含指定为


的N肽结构域。另外,N肽可以包含N36肽序列的全部或NH2末端部分加上位于所述N肽的NH2末端处的另外五个氨基酸,使N肽区域进一步延长到NH2末端区域内。因此,N肽可以进一步包含位于N36肽的NH2末端处的五个氨基酸的全部或部分,具体地ASQLL(SEQ ID NO:30)。
在某些实施方案中,可能需要基于肽的支架结构域,以维持N肽区域的构象。支架结构域是非HIV氨基酸序列,因此所得到的N肽?#20052;?#21512;N肽。支架结构域包含能够形成三聚卷曲螺旋的可溶性α螺旋结构域,并且在螺旋相位中融?#29616;罭肽,产生连续卷曲螺旋。
卷曲螺旋是由在彼此周围?#27801;?#34746;旋扭曲包裹的两个或更多个α螺旋组成的蛋白?#24335;?#26500;基序。氨基酸残基的相似模式决定卷曲螺旋的折叠,由通过字母“a”直到“g”指定的氨基酸的特征性七肽重复组成。已测定七肽重复的第一个和第四个位置,分别为“a”和“d”位置,形成卷曲螺旋的相互作用链的内部并且一般为疏水的。包含在嵌合N肽内的支架结构域形成在本发明的gp41肽模拟物内的三聚卷曲螺旋结构,以便模拟通过三个gp41胞外域的N螺旋形成的前发夹和发夹三聚体结构中存在的内部三聚卷曲螺旋。
在本发明的一个实施方案中,支架结构域融?#29616;罭肽区域的NH2末端。在另一个实施方案中,支架结构域融?#29616;罭肽区域的COOH末端。在再进一步的实施方案中,支架结构域可以这样分开,从而使得所述结构域的部分位于N肽区域的NH2和COOH末端处。
可以使用已知三聚化以使gp41三聚体稳定的任何卷曲螺旋基序。卷曲螺旋基序可以选自多个来源。在本文描述的嵌合N肽内的支架结构域特别包括公开于Suzuki等人中的异亮氨酸拉链基序(1998,Protein Eng. 11: 1051-1055;下文 “Suzuki-IZ”)和公开于Eckert等人中的GCN4-pIQI卷曲螺旋基序(1998,J. Mol. Biol. 284:859-865和国际专利申请公开号WO02/024735)及其截短和/或修饰形式。
Suzuki-IZ卷曲螺旋基序具有下述氨基酸序列:。包含Suzuki-IZ基序([(IEKKIEA)n;(SEQ ID NO:32)]n)的七肽重复的“a”位置是有下划线的。
GCN4-pIQI卷曲螺旋基序具有下述氨基酸序列:。该螺旋基序的“a”位置也是有下划线的。
IZ结构域是基于由Suzuki等人(1998,Protein Eng. 11: 1051-1055)描述的设计的修?#25105;?#20142;氨酸赖氨酸,其在溶液中是螺旋和三聚的。
Suzuki-IZ、GCN4-pIQI及其他支架结构域可以通过一个或多个氨基酸残基的添加、取代、修饰和/或缺失而改变。“Suzuki-IZ样”和“GCN4-pIQI样”支架结构域在本文中定义为卷曲螺旋基序,其分别包含“Suzuki-IZ”或“GCN4-pIQI?#26412;?#26354;螺旋的部分,或者所述各自卷曲螺旋的全部或部分的修饰形式。Suzuki-IZ样和GCN4-pIQI样支架结构域分别必须由Suzuki-IZ和GCN4-pIQI三聚卷曲螺旋结构域或其修饰形式的足够部分(即足够长度)组成,从而使得它们形成可溶性、三聚(螺旋式)卷曲螺旋。对于支架结构域的氨基酸序列中的变化的耐受将取决于改变的氨基酸是否发挥结构和/或功能作用。因此,本文使用的突变或修饰的支架蛋白质必须保留形成三聚卷曲螺旋的能力。另外,本发明的gp41肽模拟物包含三个N肽,其中至少一个由突变/修饰的支架结构域生成,必须保留以例如至少低纳摩尔浓度?#27573;?#20363;如1-5 nM中的效力抑制HIV传染性的能力,或结合识别位于N螺旋式卷曲螺旋中的构象表位的gp41特异性抗体的能力。支架蛋白质的修饰可以提供几个优点。例如,可以改变本发明的嵌合肽的外部表面,以增强生物利用度(例如增加肽的可溶性)、?#26723;?#27602;性并避免免疫清除。包含可替代支架的本发明的嵌合肽的多重形式的可用性将通过避免预存抗体帮助回避该问题。支架蛋白质还可以在使得嵌合肽的支架结构域更少免疫原性的尝试中,例如通过在其外表面上引入糖基化或聚乙二醇化位点进行修饰。此外,支架结构域可以进行修饰,?#28304;?#36827;所述肽模拟物与免疫原性载体或亲和树脂的缀合。
上文描述的IZ支架基序代表Suzuki-IZ卷曲螺旋基序的部分,其已在“e”和“g”位置中显著改变,并且具有在“a”位置处的异亮氨酸至谷氨酰胺(I→Q)取代(参见国际专利申请公开号WO02/024735)。“IZ”支架结构域的氨基酸序列是“a”位置是有下划线的),其中NH2末端?#19988;?#37232;化的,并且COOH末端是酰胺化的。
还可以生成IZ支架结构域的缩短形式用于掺入肽模拟物内。缩短的IZ样结构域的具体例子代表IZ支架的17个氨基酸:指定为“IZ17?#20445;弧癮”位置是有下划线的)。
当生成具有更长HIV序列区段的可替代肽模拟物时,为?#23435;?#25345;适当螺旋结构,该“IZ”支架可能需要延长一至几个氨基酸,生成“IZ样”支架结构域。例如,IZN23和IZN36是还公开于Eckert等人,2001,Proc Natl Acad Sci USA 98:11187-11192中的嵌合N肽。IZN36的氨基酸序列分别为IKKE

。肽的“a”位置是有下划线的。例如,IZN36的IZ样支架结构域可以延长一个或优选两个氨基酸。这可能是维持适当的“a”直到“g”间隔所需的,并且因此促进α螺旋构象的生成。选择为以这?#22336;?#24335;延迟支架结构域的氨基酸应允许邻近螺旋之间的静电作用(参见Suzuki等人,1998,Protein Eng. 11: 1051-1055)。当生成待稳定的嵌合N肽时,本领域?#38469;?#20154;员应当理解支架结构域可能需要最低限度改变,如对于IZN36可见的,以便维持所得到的肽的螺旋构象。可以对于其他支架作出类似改变。
在另一个实施方案中,支架结构域包含修饰的Suzuki-IZ样结构域,指定为“EZ”支架,具有下述氨基酸序列:“a”位置是有下划线的)。
在另一个实施方案中,细菌噬菌体T4?#23435;?#34507;白(fibritin)三聚(FT)序列的26氨基酸三聚基序用作支架结构域。基于?#23435;?#34507;白的类似基序是本领域已知的。
优选的嵌合N肽的一个例子是SZN51


如上所述,肽模拟物的支架结构域的氨基酸序列可以进行修饰和/或缩短;然而,在这样做时,所得到的嵌合肽必须保留形成三聚卷曲螺旋的能力,代表gp41的内部N螺旋式卷曲螺旋的稳定、可靠模拟物。
在某些实施方案中,嵌合N肽是?#24067;?#31283;定的。肽模拟物可以包含在螺旋相位中融?#29616;?#25903;架结构域的N肽,其中所述肽序列任选进一步包含位于NH2或COOH末端处,并且优选在嵌合肽的核心螺旋区域的外部的至少两个半胱氨酸残基。这些肽被称为CC嵌合N肽。在此类实施方案中,三个相同或基本上相似的含半胱氨酸嵌合肽随后经由分子间二硫键在同源三聚或异源三聚分子中?#24067;?#31283;定,所述分子间二硫键在氧化条件下在紧密结合的嵌合肽链上的并列半胱氨酸残基之间形成。通过使预形成的三聚卷曲螺旋暴露于氧化环?#24120;?#25110;通过在氧化条件下促进个别肽链结合成卷曲螺旋构象,形成?#24067;?#31283;定的同源三聚或异源三聚卷曲螺旋。添加的半胱氨酸残基位于嵌合肽的α螺旋结构域的外部,确保高构象自由,并且任选通过接头或间隔区与核心、嵌合肽序列分开。参见美国专利号7,811,577。
本文描述的CC嵌合N肽中存在的半胱氨酸残基是连续氨基酸残基。因此,本文描述的CC嵌合N肽可以包含位于肽的NH2或COOH末端处,在嵌合肽的核心α螺旋结构域的外部,并且任选通过接头/间隔区与核心α螺旋结构域分开的至少两个连续半胱氨酸残基。本文描述的CC嵌合N肽还可以包含在肽的NH2或COOH末端处,在嵌合肽的核心α螺旋结构域的外部,并且任选通过接头/间隔区与核心α螺旋结构域分开的确切的至少两个连续半胱氨酸残基。本领域?#38469;?#20154;员还可以设想本文描述的半胱氨酸残基不一定必须是连续残基,并且因此它能够包括在所述半胱氨酸残基之间的最低限度数目的氨基酸残基。然而,重要的?#21069;?#33009;氨酸残基不相隔足够远,以便允许相同多肽链上的半胱氨酸残基之间的分子内二硫键生成,使得它们不能在三聚卷曲螺旋构象中在个别CC嵌合N肽之间形成分子间二硫键。
两个连续半胱氨酸残基参与与在肽氧化后形成的紧密结合的CC嵌合N肽上的并列半胱氨酸残基的二硫键连接。在实施方案中,当存在两个连续甘氨酸残基时,甘氨酸残基代表间隔区,使半胱氨酸残基与核心嵌合肽序列的α螺旋结构域分开。甘氨酸间隔区确保半胱氨酸残基不卷入核心肽序列的螺旋二级结构中,帮助?#22836;?#25152;述半胱氨酸以参与二硫键。个别蛋白质之间(即分子间)或单条多肽链内(即分子内)的?#24067;?#20132;联可以通过半胱氨酸残基的氧化形成。二硫键通过半胱氨酸残基中的硫醇(—SH)基团的氧化形成。分子内二硫键使蛋白质的三级结构稳定,而分子间发生的?#20999;?#28041;及使涉及一?#21482;?#22810;种多肽的蛋白?#24335;?#26500;稳定。个别肽/蛋白质之间的?#24067;?#20132;联还可以通过化学选择性反应(例如硫醚键的形成)形成,所述化学选择性反应通过将独特的相互反应基团掺入待?#24067;?#36830;接的所述肽/蛋白质(每个区?#25991;?#24453;连接的一个)内施加(Lemieux G. A.和Bertozzi C. R.,1998,Trends Biotechnol. 16:506-513;以及Borgia,J. A.和Fields G. B.,2000,Trends Biotechnol. 15:243-251中综述)。加入嵌合肽的核心α螺旋结构域的半胱氨酸残基在氧化后产生二硫键,使通过三个相同的CC嵌合N肽形成的三聚结构?#24067;?#31283;定。
本文描述的半胱氨酸残基可以加入核心嵌合N肽的NH2末端或COOH末端,以生成CC嵌合N肽。例如,两个半胱氨酸残基可以改造为占据在CC嵌合N肽的NH2末端处的前两个氨基酸残基,其中支架卷曲螺旋结构域位于嵌合肽的NH2末端一半中。该排列确保两个改造的半胱氨酸残基最不可能干扰嵌合肽的N肽部分的α螺旋结构和/或所述HIV结构域的功能性,例如与C螺旋相互作用。可替代地,两个半胱氨酸氨基酸残基可以改造为占据在CC嵌合N肽的COOH末端处的最后两个氨基酸残基,其中支架;卷曲螺旋结构域位于嵌合肽的NH2末端一半中。如果由于定位邻近支架结构域的Cys-Cys序列的存在,经由嵌合肽的非HIV支架部分难以使CC嵌合N肽与免疫原性载体或亲和树脂缀合,则这可能是必要的。两个半胱氨酸残基还可以改造为占据在CC嵌合N肽的NH2末端处的前两个氨基酸残基,其中N肽结构域位于嵌合肽的NH2末端一半中。两个半胱氨酸残基可以改造为占据在CC嵌合N肽的COOH末端处的最后两个氨基酸残基,其中N肽结构域位于嵌合肽的NH2末端一半中。交换N肽和支架结构域的定向可以影响所得到的CC嵌合N肽抑制病毒宿主细胞膜融合的能力。
优选的CC嵌合N肽是CCIZN51:


在可替代实施方案中,稳定通过将亲电子部分掺入核心嵌合肽的?#25105;?#26411;端而发生,分别用于参与使所述肽之间的二硫键和/或硫醚键稳定。所述亲电子部分任选通过接头或间隔区与嵌合肽的α螺旋结构域分开。因此,所述结构可以通过三聚化和单个CC嵌合N肽与各自具有亲电子部分的两个衍生的嵌合N肽的?#24067;?#31283;定来获得,其中硫醚键在CC嵌合N肽的改造的半胱氨酸残基中存在的每个硫醇反应官能团和每个衍生的嵌合N肽的亲电子部分(例如烷基卤化物部?#21482;騇ichael受体)之间形成。在嵌合肽之间的二硫键或化学选择性?#24067;?#38190;连接确保肽单体(即,同源三聚或异源三聚卷曲螺旋结构的单一、嵌合肽亚基)即使在极低浓度下也不解离。
在某些实施方案中,稳定通过掺入功能性而发生,所述功能性能够介导核心嵌合肽的?#25105;?#26411;端的“点击(click)”化学?#21058;?#29992;于参与稳定所述肽之间的?#24067;?#38190;。所述“点击”部分任选通过接头或间隔区与嵌合肽的α螺旋结构域分开。在此类实施方案中,稳定的三聚体可以通过单一XX-嵌合N肽与两个Y衍生的嵌合N肽的反应而形成,其中"X"和"Y"代表每个衍生的嵌合N肽的“点击”反应对的同源部分(例如Huisgen 1,3偶极环化加成,其中"X"构成炔部分,并且"Y"构成叠氮化物部分)。嵌合肽之间的化学选择性?#24067;?#38190;连接确保肽单体(即,同源三聚体或异源三聚卷曲螺旋结构的单一、嵌合肽亚基)即使在极低浓度下也不解离。
可替代策略由Louis等人(2001,J. Biol. Chem. 276:29485-29489)用于生成在N螺旋结构域内的实际残基突变为半胱氨酸残基的gp41胞外域的内部、三聚卷曲螺旋,以通过分子间二硫桥稳定。通过使位于N螺旋区域内的gp41胞外域的残基576-578突变为半胱氨酸-半胱氨酸-甘氨酸(Cys-Cys-Gly),在掺入六螺旋束内的半胱氨酸残基之间生成二硫键。所述突变的氨基酸残基之一位于α螺旋结构域的“d”位置中,已知为七肽重复的两个位置之一,形成卷曲螺旋的相互作用链的内部并且在HIV-1进化枝中也是高度保守的(Dong等人,2001,Immunol. Lett. 75:215-220)。
使本文描述的CC嵌合N肽稳定的可替代方法是将半胱氨酸残基加入肽的相对末端。因此,最?#37232;?#22914;果经由位于所述肽的一个末端处的半胱氨酸残基之间的二硫键稳定的,由CC嵌合N肽形成的三聚卷曲螺旋不展示以高效力抑制HIV传染性的能力,或结合识别位于N螺旋结构域中的构象表位的抗体的能力,则本领域?#38469;?#20154;员可以生?#19978;?#20284;的?#24067;?#31283;定的三聚卷曲螺旋,其具有稳定位于CC嵌合N肽的相对末端处的半胱氨酸残基的能力。
?#26412;?#30001;上文描述的任何方法使本发明的三聚卷曲螺旋稳定时,重要的是在两个衍生的嵌合N肽内掺入的部分位于所述肽的相同末端处。随后可以测定稳定机制的位置是否影响?#24067;?#31283;定的嵌合肽的功能性。如果单体加入其中的末端比肽的相对末端更不稳定,则使稳定机制移动到相反末端可以具有进一步的稳定影响。通常,本文描述的嵌合N肽的N肽部分比肽的支架部分更不稳定。因此,将稳定单位从肽的支架末端移动到N肽末端可以增加所得到的三聚卷曲螺旋的稳定性。
模拟D5表位的三维结构并且由如本文描述,通过限制3个N-肽形成的三聚卷曲螺旋构象而稳定该三维结构。在CCIZ方法的可替代策略中,支架核心用于使N-肽?#21058;?#21644;定位,以便使其以如下方式定位,?#27492;亲?#30001;地自结合,并伴随三聚卷曲螺旋的形成。因此,在某些实施方案中,支架核心不包含两个邻近半胱氨酸残基(即CC)。支架核心含有用于-N肽的?#24067;?#36830;接的最低限度三个位置。所述连接位置维持在与支架核心的其他结构元件的最佳间隔和距离处,?#28304;?#36827;N-肽的自结合以形成三聚卷曲螺旋。支架核心作为包含三个或更多个反应基团的线性或环状化合物,由此肽可以是?#24067;?#36830;接的。因此,如本文使用的,多价或更具体而言三价肽?#21069;?#21547;?#24067;?#36830;接至支架核心的三个肽的化合物。支架化的三价肽的一般结构表示为:

支架化的肽的具体例子可以是含有半胱氨酸残基的任何N-肽,所述半胱氨酸残基能够与存在于支架上的一个或多个连接点处的溴化物或马来酰?#21069;?#37096;分反应,并随后形成?#24067;?#30827;醚键。
选择至少三个连接的位置,从而使得所得到的gp41肽模拟物中的D5表位构象类似gp41中的所述表位的天然构象。本发明的gp41肽模拟物受使用的支架类?#22270;此?#30340;结构影响,因为支架的大小和形状将影响肽模拟物的总体结构。基于本文提供的指导,本领域?#38469;?#20154;?#32972;?#20998;能够设计其构象紧密类似gp41的D5表位的天然构象的本发明肽模拟物。支架与N肽的连接点优选不位于D5表位内,因为此类连接将破坏表位的构象和/或可接近性。例如能够产生在不同位置处具有连接的几?#21482;?#21512;物,并且在实验上测定所述化合物在竞争结合测定(例如DCBA)中结合D5和/或抑制D5结合的能力作为适当表位呈递的量度。类似地,NHR在适当的卷曲螺旋构象中的呈现可以通过所述化合物在基于病毒进入抑制的测定中的效力进行评价。
优选选择具有NHR构象和/或D5表位的最佳呈现的化合物。还能够产生在氨基酸序列的相同或不同位置处连接的具有不同种类支架的几?#21482;?#21512;物,并且实验上测定所得到的化合物的NHR构象和/或D5表位的存在。
因此,N肽直接或间接地经由接头或通过在所述氨基酸序列内形成至少一个键而连接至支架。
合适的分子支架核心包括具有高达10个碳的个别环结构的单和多碳环化合物,或在环结构中具有除碳外的至少一个原子(最通常为氮、氧或硫)的杂环化合物。例子包括环丁烷、环戊烷、环?#21644;欏?#29615;辛烷、吡喃、吡咯烷、氧杂环戊烷、硫杂环戊烷、哌啶、噁烷、硫化环戊烷、氮杂环庚烷、氧杂环?#21644;欏?#30827;杂环庚烷、哌嗪、吗啉、硫吗啉及其衍生物。
碳环化学支架的一个例子是?#21576;??#21576;?1,3,5-三甲基环?#21644;?1,3,5-三?#20154;?坎普酸),其中在?#20154;?#23448;能团与二氨基乙烷衍生后引入硫醇反应性溴乙酰基团,如Xu等人(Xu,W.等人,2007 Chem Biol Drug Des 70: 319-328)中所述。坎普酸呈现有利的椅构象,其中在环?#21644;?#29615;上的三个羧基占据轴向位置,并且因此提供了有利的三轴定向以装配N肽。
在另一个实施方案中,N肽?#21058;?#33267;基于多个稠环结构或由多个稠环结构组成的支架。共享碳-碳键的两个碳环或杂环被说成是稠合的。合适的支架可以包括本文描述的先前碳环或杂环化合物中的?#25105;?#31181;的稠?#36153;?#29983;物。具体例子包括如美国专利号7,312,246中公开的胆固醇、胆酸及其衍生物和三联苯。
化学支架的其他例子包括如美国专利号7,524,821中所述的基于碳水化合物和支架化的马来酰?#21069;反兀?#20854;用于多价肽和蛋白?#39318;?#37197;。此类马来酰?#21069;反?#21033;用充分确定的、高度有效的硫醇基团与亲电子部分的迈克尔加成(Kitagawa等人,1976,J. Biochem.(Tokyo). 79:233-6;Peeters等人,1989,J. Immunol. Methods. 120:133-43)。因此,多价肽的拓扑学可以通过在刚性支架核心上的马来酰?#21069;?#23448;能团的限定空间定向控制。可以置换马来酰?#21069;?#30340;可替代的硫醇反应化合物是碘乙酸、溴乙酸、碘乙酰胺和吡啶基二硫化物。由吡啶基二硫化物形成的二硫键可通过本领域众所周知的方法切割。
本发明的优选实施方案?#21069;?#21547;核心分子的马来酰?#21069;反兀?#20854;中三个或更多个马来酰?#21069;?#21508;自连接至核心。本发明的另一个优选实施方案?#21069;?#21547;碳水化合物核心的马来酰?#21069;反兀?#20854;中三个马来酰?#21069;?#21508;自连接至核心。本发明的另外一个优选实施方案?#21069;?#21547;碳水化合物核心的马来酰?#21069;反兀?#20854;中三、四、五或六个马来酰?#21069;?#21508;自通过接头连接至核心。
本发明的优选实施方案?#21069;?#21547;胆酸核心的马来酰?#21069;反兀?#20854;中三、四、五个或更多个马来酰?#21069;?#21508;自连接至核心。本发明的另一个优选实施方案?#21069;?#21547;胆酸核心的马来酰?#21069;反兀?#20854;中三、四、五个或更多个马来酰?#21069;?#21508;自通过接头连接至核心。
本发明的优选实施方案?#21069;?#21547;环糊精的马来酰?#21069;反兀?#20854;中三个或更多个马来酰?#21069;?#21508;自通过接头连接至环糊精。本发明的优选实施方案?#21069;?#21547;至少两个核心的马来酰?#21069;反兀?#20854;中每个核心含有一个或多个马来酰?#21069;貳?#26412;发明的另一个优选实施方案?#21069;?#21547;多元醇核心的马来酰?#21069;反兀?#20854;中三个或更多个马来酰?#21069;?#21508;自连接至核心。本发明的进一步优选的实施方案?#21069;?#21547;多元醇核心的马来酰?#21069;反兀?#20854;中三个或更多个马来酰?#21069;?#21508;自通过接头连接至核心。
支架还可以是单糖、多元醇和寡糖。可以充当本发明的支架的单?#21069;?#25324;但不限于二?#28508;?#37230;、R和L?#26434;?#20307;和异头物形式的甘油醛、苏糖、赤藓糖、赤?#21644;?#31958;、核糖、阿拉伯糖、木糖、?#27492;?#31958;、核酮糖、木酮糖(xylulolse)、阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖、塔罗糖、阿洛酮糖、果糖、山梨糖和塔格糖。可以充当支架化合物的多元醇或聚?#21450;?#25324;但不限于丙三醇(glyceritol)、苏糖醇、赤藓醇、核糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、阿糖醇(lyxitol)、蒜糖醇、阿卓糖醇、葡糖醇、甘露醇、半乳糖醇、塔罗糖醇、山梨糖醇、艾杜糖醇、山梨糖醇、甘露醇、甘油、肌醇、麦芽糖醇、拉克替醇、卫矛醇和阿东糖醇。可以充当支架化合物的寡?#21069;?#25324;但不限于包含上文描述的单糖的任何组合的二糖和包含上文描述的单糖的环状寡糖。环糊精和环果聚糖(cyclofructin)是可以用于本发明的支架中的环状寡糖的例子。环糊精是环状(α-1,4)-连接的寡糖,并且包括但不限于5-13 α-D-吡喃葡萄糖、环甘露聚糖(cyclomannin)、环阿卓糖(cycloaltrin)和cyclogalactin。环糊精包含能够携带化合物的疏水核心。马来酰?#21069;反?#21487;以进一步包括包含反应性马来酰?#21069;?#37096;分的几个连接的核心化合物。化学支架核心还可以基于胆酸、胆固醇、环肽、卟啉和杯[4]?#32487;?#30899;水化合物和聚胺。具体聚胺应是三胺,例如二?#19988;一?#19977;胺五乙酸、五甲基二乙烯三胺、三-2?#24065;一?#33018;、二丙烯三胺等等。
支架还可以是非环状或线性分子,其含有可以充当N肽连接点的最低限度三个官能团。这类支架的例子包括但不限于三(2-羧?#19968;?膦盐酸盐;三琥珀酰?#21069;?#27688;基三乙酸酯;三-(2-马来酰?#21069;芬一?胺;TRIS(Boc-β-Ala-TRIS-(OH)3;和TREN(三(2-?#24065;一?胺)。TRIS支架在Cai等人,2007,Bioorganic Chemistry 35:327-337中描述。TREN(三(2-?#24065;一?胺)在Kwak等人,2002,J. Am. Chem. Soc. 124:14085-14091中描述。作为支架核心适合的另外结构可以在美国专利号7,604,804中?#19994;劍?#25152;述专利整体引入作为参考。
在本发明的另一个实施方案中,N肽?#21058;?#33267;基于或包含含有侧链的氨基酸的线性支架,所述侧链能够衍生用于连接至活化的N肽。所述氨基酸残基包括Lys、Arg、His、Glu、Asp、Cys、Sec及其衍生物。所述氨基酸残基可以是多肽链的部分,所述多肽链含有至少三个反应基团,其中反应基团之间的间隔是合适的,以最佳限制形成三聚卷曲螺旋的N肽的构象。
线性支架的一个例子包含肽Ac-X-Lys-X-Lys-X-Lys-X-NH2,其中三个同源或异源N肽可以连接至赖氨酸残基(RNH2)的ε氨基酸侧链,并且其中X可以是任何氨基酸,其提供足够间隔用于N肽的适当定向或修饰支架的电荷、疏水性或其他物理参数。在本发明的优选实施方案中,X是5-氨基戊酸。在另一个优选实施方案中,X是Arg或Glu。
?#19978;?#24615;支架限制的肽的具体例子包括

其中Ava代表δ-氨基戊酸。
线性支架的例子包括:


本领域?#38469;?#20154;员将认识到多?#21482;?#23398;可以用于将N肽?#24067;?#36830;接至支架核心上的反应官能团。在一个优选实施方案中,该连接包含在N肽上的硫醇基团和支架上的亲电子部分之间的硫醚键,因为所述键在水溶液中在中性或略碱性pH下容易形成,并且因为在N肽上的硫醇官能团可以作为半胱氨酸残基或作为硫醇衍生物在肽的?#25105;?#26411;端上提供。对氨基酸序列内部的硫醚键的位置可以容易地通过调节?#21355;?#21322;胱氨酸残基的位置进?#26800;?#33410;。在特别优选的实施方案中,充当硫醇官能团的前体的硫代乙酰官能团位于氨基酸序列的第一个氨基酸位置的N末端或最后一个氨基酸位置的C末端处,以便最佳限制氨基酸序列的构象。
其他种类的键也适合于限制本发明的免疫原性化合物的构象。例如,二硫键(也称为SS-桥)可以在?#21355;?#21322;胱氨酸残基之间选择性形成,而无需保护其他氨基酸侧链。此外,二硫键通过在碱性环境中温育容易地形成。优选地,二硫键在两个半胱氨酸残基之间形成,因为它们的硫氢基可容易地用于结合。在氨基酸序列内的SS-桥的位置通过调节?#21355;?#21322;胱氨酸残基的位置容易地调节。在特别优选的实施方案中,所述半胱氨酸位于氨基酸序列的第一个和最后一个氨基酸位置周围,以便最佳限制氨基酸序列的构象。
在另一个实施方案中,可以使用Se--Se二硒键。二硒键的优点是这些键是还原不敏感的事实。因此,包含二硒键的肽模拟物在例如存在于动物体内的还原环境下能够更好地维持其构象。此外,当?#21355;隨H基团存在于肽模拟物内时,二硒键是优选的,所述SH基团例如用于与载体的后续?#21058;?#21453;应。此类?#21355;隨H基团不能与二硒键反应。
在另一个实施方案中,使用复分解反应以便形成所述键。在复分解反应中,两个末端CC双键或三键借助于金属催化的重排反应连接。可接受的催化剂是Schrock钼(VI)或钨(VI)亚烷基或Grubbs钌卡宾。经由肽NH基团的烷基化例如烯丙基溴或炔丙基溴,或经由将具有含烯基或炔基侧链的非天然氨基酸掺入肽内,将该反应所需的末端CC双键或三键引入肽内。
在优选实施方案中,N肽和支架核心之间的键使用溴-硫醇?#21058;?#24418;成。例如,在支架核心上的溴乙酰部分?#21058;?#33267;?#21355;?#21322;胱氨酸的硫氢基部分,所述?#21355;?#21322;胱氨酸优选存在于肽的N末端处。可替代地,支架核心上的硫醇部分可以?#21058;?#33267;肽的NH2末端上或赖氨酸残基(RNH2)的ε氨基侧链上引入的溴乙酰部分,所述赖氨酸残基优选存在于肽的N末端处。
在进一步的实施方案中,天冬氨酸盐或谷氨酸盐残基的CO2H侧链?#21058;?#33267;胺官能团,以形成酰胺键。应认识?#25509;卫?#33018;可以以多?#22336;?#24335;引入支架核心内。例如,胺官能团可以构?#19978;?#24615;多肽支架内的赖氨酸残基的ε-NH2侧链。可替代地,肽的?#21355;隒O2H末端可以?#21058;?#33267;胺官能团,例如肽支架的?#21355;隢H2末端。在N肽的氨基酸序列内形成酰胺键的可替代方法是可获得的,所述方法是本领域已知的。
原则上,N肽和支架核心之间的键可以在免疫原性N肽氨基酸序列内的任何地方形成,只要目的表位的一级、二级和三级序列基本上得到维持。在一个优选实施方案中,连接在氨基酸序列的十个N末端和十个C末端氨基酸残基的任?#25105;?#20010;之间形成。优选地,连接在氨基酸序列的六个N末端和六个C末端氨基酸残基的任?#25105;?#20010;之间形成,优选在氨基酸序列的四个N末端和四个C末端氨基酸残基的任?#25105;?#20010;之间形成。当然,适合于形成内部键的位点取决于一个或多个目的表位的位置。在一个优选实施方案中,连接在免疫原性氨基酸序列的第一个和最后一个氨基酸残基之间形成。
考虑到维持N肽组?#27801;?#20998;的最佳间距以允许三聚体形成的上述重要性,应认识到对支架的连接点可以是直接的或可以通过添加接头分子进行修饰,所述接头分子增加N肽和支架的核心组?#27801;?#20998;之间的距离。接头包含原子的任何组合,所述原子可以包括但不限于碳、氮、氧、磷和硫,长度高达50个原子。一般地,本发明的间隔物/接头可以包括任何分子,所述任何分子可以结合三个N肽并将三个N肽放置在足够距离处,以允许N肽的三聚化呈现gp41前发夹中间物的构象正确模拟物,并?#39029;?#29616;处于其天然构象的D5中和表位。
接头可以是同双功能的,其中相同反应官能团存在于分子的两个末端处。例子包括但不限于1,2二氨基乙烷;1,3二氨基丙烷;腐胺;尸胺;草酸、丙二酸、琥珀酸、肥酸、3,3'-二硫代双(磺基琥珀酰?#21069;?#22522;丙酸酯);二琥珀酰?#21069;?#36763;二酸酯;乙二醇双(琥珀酰?#21069;?#29733;珀酸酯);己二酸二甲酯;二马来酰?#21069;?#22522;?#21644;椋?,5-二氟-2,4-二硝基苯?#29615;?#37240;二酰肼;碳酰肼;和N,N'-?#19988;一?双(碘乙酰胺)。
在本发明的优选实施方案中,坎普三酸支架的?#20154;?#23448;能团通过与同双功能分子二氨基乙烷反应进行修饰,以增加与环?#21644;?#29615;和N肽的距离。
可替代地,接头可以?#19988;?#21452;功能的,其中不同反应官能团存在于分子的?#25105;?#26411;端处。广泛多样的此类分子是可容易获得的,其种类包括胺/硫氢基反应性、羰基/硫氢基反应性、胺/光反应性、硫氢基/光反应性、羰基/光反应性及其他。具体例子包括但不限于磺基琥珀酰?#21069;?-(N-马来酰?#21069;?#30002;基)-环?#21644;?1-?#20154;?#37231;;4-琥珀酰?#21069;费?#22522;羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫代)甲苯;m-马来酰?#21069;?#33519;甲酰-N-羟基琥珀酰?#21069;?#37231;?#25442;?#22522;琥珀酰?#21069;?-(碘乙酰基)-氨基苯甲酸酯;琥珀酰?#21069;?-(对马来酰?#21069;?#33519;基)丁酸酯;3-(2-吡啶基二硫代)丙酰肼;N-羟基琥珀酰?#21069;?4-叠氮基水杨酸;二苯甲酮-4-碘乙酰胺;对叠氮基苯甲酰基酰肼;和5-氨基戊基马来酰?#21069;貳?#36824;可以采用不同长度的异双功能聚乙二醇(PEG)接头,并且具体种类的例子包括但不限于N-羟基琥珀酰?#21069;?PEG(n)-马来酰?#21069;罰籒-羟基琥珀酰?#21069;?PEG(n)-叠氮化物;和N-羟基琥珀酰?#21069;?PEG(n)-炔丙基。
在本发明的优选实施方案中,胆酸的烯丙型衍生物与2-氨基?#20234;?#37255;反应并且随后与γ-马来酰?#21069;范?#37240;反应,以增加与胆固醇环和N肽的距离。
本文描述的肽模拟物的N肽部分可以通过多?#22336;?#27861;产生。例如,它们可以是化学合成的。长肽可以在固相载体上合成,使用如由Kent等人,1985,“Modern Methods for the Chemical Synthesis of Biologically Active Peptides,” Alitalo等人(编辑),Synthetic Peptides in Biology and Medicine,Elsevier第29-57页描述的自动化肽合成仪。人工固相合成可以如例如Merrifield,1963,Am. Chem. Soc. 85:2149中所述或其已知改善执行。固相肽合成还可以通过Fmoc方法执行,所述Fmoc方法采用非常稀释的碱以去除Fmoc保护基团。液相合成通常仅对于所选更小的肽是可行的。关于制备紧密相关肽的混合物,参见例如Houghton,1985,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:1242-1246。肽模拟物可以作为连续肽或在它们形成后连接或联系的组分产生。
可替代地,本文描述的肽可以使用已知方法和表达系统通过表达嵌合肽编码DNA产生,所述嵌合肽编码DNA可以是编码整个嵌合肽的单一DNA。嵌合肽基因可以通过分子克隆到表达载体(例如pcDNA3.neo、pcDNA3.1、pCR2.1、pBlueBacHis2或pLITMUS28)内重组表达,所述表达载体含有合适的启动子和其他适当的转录调节元件,并且转移到原核或真核宿主细胞内以产生嵌合肽。表达载体在本文中定义为克隆DNA转录及其mRNA在?#23454;彼?#20027;中翻译所需的DNA序列。此类载体可以用于在多种重组宿主细胞中表达重组DNA,所述重组宿主细胞例如细菌、酵母、蓝绿藻、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。适当构建的表达载体应含有下述组分:用于在宿主细胞中自主复制的复?#30772;?#28857;;可选标记;有限数目的有用限制性酶位点;和活性启动子。表达载体可以包括但不限于克隆载体、修饰的克隆载体、特别设计的质粒或病毒。商购可得的哺乳动物表达载体可以适合于重组肽表达。另外,多种商购可得的细菌、真菌细胞和昆虫细胞表达载体可以用于在各自的细胞类型中表达重组模拟位。启动子定义为指导RNA聚合酶以结合DNA并起始RNA合成的DNA序列。强启动子是促使mRNA以高频率起始的启动子。此类操作的?#38469;?#21487;以在Sambrook等人,1989,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.中?#19994;劍?#24182;且是本领域普通?#38469;?#20154;员众所周知和可获得的。含有编码N肽的适当基因的表达载体可以经由许多?#38469;?#20013;的任?#25105;?#31181;引入宿主细胞内,所述?#38469;?#21253;括但不限于转化、转染、原生质体融合和电穿孔。个别分析含表达载体的细胞,以测定它们是否产生目的肽。肽表达细胞的鉴定可以通过几?#22336;?#27861;完成,所述方法包括但不限于与抗HIV肽抗体的免疫反应性。重组肽可以具有与相同有机合成的肽?#36824;?#20139;的另外和期望的结构修饰,例如腺苷酰化、羧化、糖基化、羟化、甲基化、磷酸化或肉豆蔻酰化。这些添加的特征可以通过重组表达系统的适当选择加以选择或视情况而定是优选的。
在宿主细胞中表达N肽基因后,可以回收N肽。几种蛋白质纯化操作是可获得的并适用的,包括通过下述的多种组合或个别应用,来自细胞裂解产物和提取物或条件化培养基的纯化:盐析、离子交换层析、反相层析、尺寸排阻层析、羟磷灰石吸附层析和疏水作用层析。另外,肽可以通过使用免疫亲和柱与其他细胞蛋白质分开,所述免疫亲和柱由对于肽特异性的单克隆或多克隆抗体制备。
本文描述的某些肽包括(CCIZN36)3和5螺旋已得到公开。参见例如Root等人,2003,Proc Natl Acad Sci USA 100:5016-5021;Root等人,2001,Science 291:884-888;Steger等人,2006,Journal Biol Chem 281:25813-25821;Wang等人,2009,Sheng wu gong cheng xue bao = Chinese journal of biotechnology 25:435-440;Bianchi等人,2005,Proc Natl Acad Sci USA 102:12903-12908;Bianchi等人,2009,Advances in experimental medicine and biology 611:121-123;Bianchi等人,Proc Natl Acad Sci USA 107:10655-10660;Eckert等人,2001,Proc Natl Acad Sci USA 98:11187-11192;Eckert等人,2001,Annual review of biochemistry 70:777-810;Eckert等人,1999,Cell 99:103-115;Hrin等人,2008,AIDS research and human retroviruses 24:1537-1544;Luftig等人,2006,Nature structural & molecular biology 13:740-747;和Montgomery等人,2009,mAbs 1:462-474。许多出版物已得到鉴定,其描述了用于限制基于NHR的肽作为用于反相改造的疫苗的基础的可替代方法。参见例如Bomsel等人,Immunity 34:269-280;Chen等人,J Biol Chem 285:25506-25515;Corti等人,PloS one 5:e8805;de Rosny等人,J Virol 75:8859-8863;Dwyer等人,2008,Protein Sci 17:633-643;Gokulan等人,1999,DNA and cell biology 18:623-630;Korazim等人,2006,J Molec Biol 364:1103-1117;Li等人,2009,Immunobiology  214:51-60;Louis等人,2001;J Biol Chem 276:29485-29489;Lu等人,J Pept Sci 16:465-472;Nelson等人,2008,Virology 377:170-183;Pan等人,Journal of the Formosan Medical Association = Taiwan yi zhi 109:94-105;Qi等人,Biochem Biophys Res Comm 398:506-512;Qiao等人,2005,J Biol Chem 280:23138-23146;Sabin等人,PLoS pathogens 6:e1001195;Sadler等人,2008,Biopolymers 90:320-329;Schuy等人,2009,J Structural Biol 168:125-136;Wexler-Cohen等人,2009,PLoS pathogens 5:e1000509;Zhang等人,2009,Vaccine 27:857-863。
考虑通过本文描述的方法生成的构象受限的卷曲螺旋结构包含同源三聚卷曲螺旋结构(即包含三个相同的N肽)或异源三聚卷曲螺旋结构(即包含不同,尽管基本上相似的三个N肽)。在一个实施方案中,本文描述的肽模拟物的异源三聚卷曲螺旋结构的异质性可以起因于位于包含卷曲螺旋结构的个别N肽的稳定区域中的氨基酸差异。本文描述的肽模拟物的异源三聚卷曲螺旋结构的异质性可以起因于位于卷曲螺旋内包含的个别N肽内的氨基酸差异。例如,异源三聚卷曲螺旋结构可以包含三个N肽,其中对于肽的三聚化能力重要的每个个别肽的七肽重复的“a”和“d”氨基酸位置是相同的,而对于疏水区外部的氨基酸位置(例如位置“f”)在三聚卷曲螺旋的个别肽中是不同的。重要的是,此类异源三聚结构仍可以鉴定为HIV gp41融合中间物的可靠模拟物,因为卷曲螺旋的功能类似于野生型结构的功能(例如抗病毒活性和/或可靠构象表位的生成)。
代表性gp41肽模拟物的三聚结构示意性?#20801;?#20110;图1A-B中。
本领域?#38469;?#20154;员可以例如通过测试其以高效力抑制HIV传染性的能力,或其结合识别位于gp41的N螺旋区域中的构象表位的抗体的能力,容易地测定当处于其三聚、?#24067;?#31283;定的构象时,所得到的CC嵌合N肽是否可靠展示N肽结构域。许多不同实验方法可以用于测定gp41肽模拟物是否可以形成所述内部卷曲螺旋的稳定、可靠模拟物。例如,可以执行设计为测量构象受限的gp41肽模拟物抑制HIV颗粒的传染性的能力的测定。在一个此类测定中,在不同浓度的gp41肽模拟物的存在下,由多种?#23616;?#30340;HIV-1感染HeLa细胞,所述HeLa细胞稳定表达人CD4和CCR5受体,并具有由HIV-2 LTR的tat应答片段驱动的β半乳糖苷酶报道基因。在使所述细胞温育特定时间段后,将细胞裂解并且定量β半乳糖苷酶活性。如果gp41肽模拟物保留通过干扰gp41融合中间物抑制HIV传染性的能力,则记录低β半乳糖苷酶活性。
因为本文描述的gp41肽模拟物代表gp41的内部、N螺旋式卷曲螺旋的稳定、可靠模拟物,所?#36816;?#20204;被认为可用作免疫原,以产生靶向HIV融合中间物的抗体应答。当施用时,gp41肽模拟物将可能对先前未感染的个体提供预防优点和/或通过减少受感染个体内的病毒载量水平提供疗效,因?#25628;?#38271;HIV感染的无症状期。
本文描述的肽模拟物可以通过多种途径中的一?#21482;?#22810;?#32440;?#34892;施用,所述途径例如经鼻、腹膜内、肌内、静脉内、经阴道或经?#32972;Α?#22312;每个实施方案中,肽模拟物在适当载体中或作为免疫原性组合物提供。例如,肽模拟物可以在?#23454;被?#20914;液、盐水、水、凝胶、泡沫、乳膏或其他适当载体中施用。可以配制包含肽模拟物和一般的适当载体和任选组分(例如稳定剂、吸收或摄取增强剂和/或乳化剂)的免疫原性组合物,并以一个或多个预防有效剂量施用于个体(未感染的或由HIV感染的)。在一个实施方案中,肽模拟物可以作为杀微生物试剂施用(或应用)并且干扰病毒进入细胞内。例如,肽模拟物可以包括在组合物中,所述组合物应用于粘膜表面或与粘膜表面接触,所述粘膜表面例如阴道、?#32972;?#25110;口腔粘膜。除肽模拟物之外,组合物包含适合于应用于粘膜表面或避孕装置(例如避孕套、宫颈帽、避?#24515;?表面的载体或基质(例如乳膏、泡沫、凝胶、足够粘稠以保持肽模拟物的其他物质、水、缓冲液)。肽模拟物可以例如通过应用泡沫、凝胶、乳膏、水或含有肽模拟物的其他载体而应用于粘膜表面。可替代地,它可以借助于阴道或?#32972;?#26643;剂应用,所述阴道或?#32972;?#26643;剂是含有肽模拟物的载体或基质,并且由在使用条件(例如阴道或?#32972;?#28201;度、pH、湿度条件)下?#22836;?#25110;递送肽模拟物(例如通过?#21040;狻?#28342;解、其他?#22836;?#26041;式)的材料制成。在所有实施方案中,肽模拟物的控制或定时?#22836;?逐步?#22836;擰?#22312;施用或插入后的特定时间?#22836;?可以通过例如将肽模拟物掺入组合物内实现,所述组合物逐步地或在限定时间段后?#22836;?#33647;物。可替代地,肽模拟物可以掺入在其施用或应用(例如进入阴道或?#32972;?#20869;)后立即或不久?#22836;?#32957;模拟物的组合物内。组合?#22836;?在插入后立即或不久、以及随着时间过去和在插入后的特定时间?#22836;?#19968;些药物)也可以是有效的(例如通过引入由两?#21482;?#26356;多种材料组成的组合物:来自其的?#22836;?#25110;递送在插入后立即或不久的一种和/或来自其的?#22836;?#25110;递送是逐步的一种和/或来自其的?#22836;?#22312;指定时期后发生的一种)。例如,肽模拟物可以掺入?#20013;头?#32452;合物内,例如美国专利号4,707,362中教导的那种。乳膏、泡沫、凝胶或栓剂可以?#19988;?#29992;于节育目的(例如含有?#26412;?#23376;剂或其他避孕药)的那种,尽管它不是必要的(例如它可以单独或与另一?#22336;潜?#23381;药例如抗菌或抗真菌药或润滑剂组合单独用于递送肽模拟物)。本发明的肽模拟物还可以通过使用避孕装置(例如避孕套、宫颈帽、避?#24515;?施用于个体,所述避孕装置包被有肽模拟物或以允许在使用条件下?#22836;?#30340;方式在其中掺入肽模拟物。如上所述,肽模拟物的?#22836;?#21487;以立即、逐步或在指定时间发生。因此,它们与HIV接触并结合HIV,并且减少或预防病毒进入细胞内。
一般而言,关于本发明的免疫原性组合物的组分的适当“有效量”或剂量的选择也基于采用的一?#21482;?#22810;种免疫原性组合物的肽模拟物的身份,以及受试者的身体状况,最尤其包括免疫接种受试者的一般健康、年龄和重量。使用方法和途径以及免疫原性组合物中的另外组分的存在还可以影响组合物的剂量和量。此类选择和有效剂量的向上或向下调整在本领域?#38469;?#20869;。诱导免疫应答优选保护性应答,或在受试者中产生外源效应,而无显著不利副作用所需的组合物量,取决于这些因素而改变。本文描述的免疫原性组合物的合适剂?#23458;?#36807;本领域?#38469;?#20154;员容易地确定。足以减少HIV感染的gp41肽模拟物的剂量(“有效剂量”)以这样的方式(例如通过注射、局部施用、静脉内)施用,所述方式完全或部分抑制HIV进入细胞内。将10 μg - 1000 μg的gp41肽模拟物、且优选50 μg - 300 μg的肽模拟物的剂量施用于哺乳动物,以诱导抗HIV或HIV中和免疫应答。在一个实施方案中,肽模拟物应以10 μg/ml - 1 mg/ml、且优选50 - 500 μg/ml之间的浓度,以足以构成免疫功效所需的总量的体积肌内给予。
在本发明的一些实施方案中,本发明的肽模拟物可以用于初免加强方案中。此类方法的初免组分可以包括但不限于DNA、遗传载体、肽或蛋白质。此类方案可以是同源或异源的。例如,在初?#38469;?#29992;后约二至四周,可以施用加强剂量(无论是同源还?#19988;?#28304;的),并且随后再次每当血清抗体滴度变小时。还可以使用多重初免施用,随后为最后一次初免施用后二至四周。异源加强可以涉及与用于初免的肽模拟物不同的肽模拟物。异源加强还可以涉及本领域已知的其他HIV预防剂,例如作为DNA或蛋白?#39318;?#20998;施用的重组gp120、gp140和gp160分子。
在本发明的一些实施方案中,本文描述的肽模拟物可以?#24067;?#32512;?#29616;?#20813;疫原性载体蛋白质,例如以增强对肽模拟物的免疫应答。此类生物缀合方法是本领域?#38469;?#20154;员众所周知的,并?#21307;?#35748;识到可以采用多种载体蛋白质和缀合化学。
适合于患者施用的免疫原性组合物将在制剂中含有有效量的肽模拟物,所述制剂保留生物活性,同时还促进在可接受的温度?#27573;?#20869;的贮存过程中的最大稳定性。包含以依照本发明的初免或加强剂量的肽模拟物的免疫原性组合物可以含有生理学可接受的组分,例如缓冲液、生理盐水或磷酸盐缓冲盐水、蔗糖、其他盐和聚山梨醇酯。本领域?#38469;?#20154;员应当理解还可以使用其他常规疫苗赋形剂,其制备制剂。
佐剂可以在含有本文描述的肽模拟物的免疫原性组合物的制备过程中添加或不添加。例如,尤其?#28304;?#21464;、粘稠和均?#26159;?#27687;化铝凝胶的形式,铝是人疫苗中的典型和优选佐剂。
这些肽模拟物可以与多种抗逆转录病毒剂组合使用,以抑制HIV复制和/或其他HIV蛋白质。可以与基于肽模拟物的组合物一起使用的抗逆转录病毒剂种类包括但不限于核苷逆转录酶抑制剂(NRTI)、非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)和蛋白酶抑制剂(PI)。其他HIV蛋白质包括gp120、gp140和gp160。编码HIV蛋白质的DNA载体也是合适的,并且可以编码HIV蛋白质包括但不限于gp120、gp140和gp160分子。
在某些实施方案中,本发明提供了用于施用本文描述的方案的试剂?#23567;?#35813;试剂盒设计用于在哺乳动物或脊椎动物受试者中诱导免疫原性应答的方法中。该试剂盒含有包含本发明的gp41肽模拟物的免疫原性组合物。优选地,在试剂盒中提供免疫原性组合物的多重预包装剂量用于多重施用。
该试剂盒还含有使用如本文描述的免疫原性组合物的说明书。该试剂盒还可以包括用于执?#24515;?#20123;测定的说明书、上文描述的多种载体、赋形剂、稀?#22270;痢?#20304;剂等等,以及施用组合物的仪器例如注射器、喷雾装置等。在其他组合物中,其他组分可以包括一次性手套、去污说明书、敷药棒或容器。
已参考附图描述本发明的优选实施方案,应当理解本发明并不限于这些精确实施方案,并?#20918;?#21270;和修饰可以通过?#38469;?#20154;员在其中实现,而不背离如所附权利要求中定义的本发明的精神或?#27573;А?
呈现下述非限制性实施例以更好地举例说明本发明。
实施例1
免疫原产生和表征
免疫原产生:合成肽
1. (CCIZN36)3
肽单体CCIZN36
使用固相Fmoc/t-Bu化学在自动化肽合成仪上合成。使用的树脂是H-Rink Amide ChemMatrix (Matrix-Innovation Inc.,St. Hubert,Quebec,加拿大)。用双重?#21058;?#36827;行酰化30分钟,每个循环使用超过树脂?#21355;?#27688;基5-10倍过量的氨基酸。用等摩尔量的HATU [2-(1H-9-氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基-脲(aminum)六氟磷酸酯]和2倍摩尔过量的DIEA (N,N-二异丙基乙胺)活化氨基酸。使用的侧链保护基团如下:三苯甲基用于半胱氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺和组氨酸;叔丁氧羰基用于赖氨酸和色氨酸;叔丁基用于谷氨酸、苏氨酸和丝氨酸;和2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰用于精氨酸。在合成结束时,通过用90%三氟乙酸、5%三异丙基硅烷、2.5%水和2.5% 3,6-二氧杂-1,8-辛烷二硫醇在?#26885;?#19979;处理3小时从树脂中切割肽。将肽溶液过滤并加入冷二乙醚以沉淀肽。沉淀的肽通过离心形成团块,并且随后将团块用冷二乙醚洗涤两次,以去除有机清除剂。将最终团块?#31245;錚?#37325;悬浮于25%乙酸水溶液中,并且冻干。
粗制肽通过反相HPLC进行纯化,在0.1%三氟乙酸的存在下使用Jupiter C18柱(250 x 30 mm,10μ,300A,Phenomenex,Inc.,Torrance,CA)与水/乙腈梯度。纯化的肽通过电喷雾质谱测定法进行表征。对于纯化肽测定的单一同位素质量为7541.22 Da (序列预测的质量为7542.24 Da)。
将纯化的CCIZN36 (35 mg)溶解于30 ml缓冲液(pH 7.5)中,所述缓冲液含有1 N胍、0.2M HEPES、1 mM EDTA、1.5 mM还原型?#20837;?#29976;肽和0.75 mM氧化型?#20837;?#29976;肽。在这些条件下,使CCIZN36缓慢氧化为该分子的?#24067;?#19977;聚体形式(CCIZN36)3。通过HPLC监测氧化反应的进程,并且在24小时后,通过将500μl三氟乙酸加入反应混合物来终止反应,所述反应混合物直接装载到Vydac?联苯基柱(22 x 250 mm,10-15μ,Grace,Deerfield,IL)上,并且通过反相HPLC进行纯化,使用在0.1%三氟乙酸的存在下的水/乙腈梯度,流速20 ml/分钟。通过RP HPLC/质谱法分析级分。将?#26434;?#20110;?#24067;?#19977;聚体的级分合并用于进一步使用。对于纯化的三聚体测定的单一同位素质量为22620.58Da (序列预测的质量为22620.681 Da)。
2. KTA(N51)3
通过在三价溴化物支架KTA-Br上连接三个带硫醇标签的单体N51肽S-乙酰基乙醇酸(acetylglycolic)-N51来合成三聚肽复合物。
KTA-Br是以坎普三酸(Kemp's triacid)为中心的对称三价支架。它根据Xu等人,2007,Chem Bio Drug Des 70:319-328中所述的方案合成,伴随在最后酰化步骤过程中使用溴乙酸酐的修饰。
肽N51使用Fmoc/t-Bu化学在自动化肽合成仪上通过固相合成。使用的树脂是H-Rink Amide ChemMatrix (Matrix-Innovation Inc.),100% PEG树脂。用双重?#21058;?#36827;行酰化30分钟,使用超过树脂?#21355;?#27688;基5-10倍过量的氨基酸。用等摩尔量的HATU [2-(1H-9-氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基-脲六氟磷酸酯]和2倍摩尔过量的DIEA (N,N-二异丙基乙胺)活化氨基酸。侧链保护基团如下:三苯甲基用于谷氨酰胺、天冬酰胺和组氨酸;叔丁氧羰基用于赖氨酸和色氨酸;叔丁基用于谷氨酸、苏氨酸和丝氨酸;和2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰用于精氨酸。在序列装配结束时,在等量N-羟基苯并三唑的存在下,通过S-乙酰基巯基乙醇酸五氟苯酯(SAMA-OPfp)的手动?#21058;?#23558;受保护的硫醇基引入肽N末端。保护硫醇的乙酰基可以在下一个连接步骤过程中通过?#21069;?#23481;易地去除。在合成结束时,用切割混合物(95%三氟乙酸、2.5%三异丙基硅烷、2.5%水)在?#26885;?#19979;处理?#31245;?#32957;树脂3小时。将树脂过滤并将溶液加入冷二乙醚,以便沉淀肽。在离心后,将肽团块用冷二乙醚洗涤两次,以去除有机清除剂。将最终团块?#31245;錚?#37325;悬浮于25%乙酸水溶液中,并且冻干。
粗制肽通过反相HPLC进行纯化,使用Jupiter C18柱(250 x 30 mm,10μ,300A)和在0.1%三氟乙酸的存在下的水/乙腈梯度,流速40 ml/分钟。在Jupiter C18柱(150 x 4.6 mm,5μ,300 A)上执行分析型HPLC。纯化的肽通过电喷雾质谱测定法进行表征。ESI谱?#20801;镜?#33655;状态+4至+7。解卷积质量为6051.6 Da (序列预测的质量为6051 Da)。
将纯化的肽前体S-乙酰基乙醇酸-N51(60 mg)溶解于8 ml pH 7-7.5缓冲液中,所述缓冲液含有6 N胍、0.1 N乙酸铵和0.5 N?#21069;貳?#20351;1.7 mg KTA-Br3溶解于1 ml三氟乙醇中,并且随后逐滴加入肽溶液中。通过LC-MS监测反应。在5小时后,通过将500μl TFA加入溶液中终止反应,并?#21307;?#28342;液直接装载到Vydac?联苯基柱(22 x 250 mm,10-15μ)上,并且通过反相HPLC进行纯化,使用在0.1%三氟乙酸的存在下的水/乙腈梯度,流速20 ml/分钟。通过质谱法进行进一步分析?#26434;?#20110;?#24067;?#19977;聚体的合并级分。ESI谱?#20801;镜?#33655;状态+14至+18。解卷积质量为18532.8 Da (序列预测的质量为18532 Da)。
3. KTA(N51-2B)3
通过遵循如对于KTA(N51)3合成所述相同的方案,经由在三价溴化物支架KTA-Br上连接三个带硫醇标签的单体N51-2B肽S-乙酰基乙醇酸-(N51-2B)来合成三聚肽复合物。
设计N51-2B序列以尝试产生更可溶和稳定的N51三聚体。Ile残基在"a"和"d"位置处加入,以优化三聚体形成,并且在肽的N末端部分中的"f"和"c"位置处进行取代,以有助于可溶性。使疏水口袋附近的一个Leu残基变成Ala残基,但维持作为疏水口袋的部分的Leu。
肽N51-2B使用Fmoc/t-Bu化学在自动化肽合成仪上通过固相合成。使用的树脂是H-Rink Amide MBHA resin LL (100-200 mesh,0.36 mmol/g)(EMD Biosciences,San Diego,CA)。S-乙酰基乙醇酸-N51-2B的合成、切割和纯化遵循如对于S-乙酰基乙醇酸-N51所述相同的方案。纯化的肽通过电喷雾质谱测定法进行表征。ESI谱?#20801;镜?#33655;状态+4至+7。解卷积质量为6109 Da (序列预测的质量为6109 Da)。
将纯化的肽前体S-乙酰基乙醇酸-N51 (10 mg)溶解于1ml pH 7.3缓冲液中,所述缓冲液含有6 N胍、0.1 N乙酸铵和0.5 N?#21069;貳?#20351;0.25等量KTA-Br3溶解于三氟乙醇中,并且逐滴加入肽溶液中。通过LC-MS监测反应。在4小时后,终止反应,并?#21307;?#28342;液直接装载到Vydac? C18柱(10 x 250 mm,5μ)上,并且通过反相HPLC进行纯化,使用在0.1%三氟乙酸的存在下的水/乙腈梯度,流速5 ml/分钟。通过质谱法进行进一步分析?#26434;?#20110;?#24067;?#19977;聚体的合并级分。ESI谱?#20801;镜?#33655;状态+14至+18。解卷积质量为18708.8 Da (序列预测的质量为18709 Da)。
4. KTA(N51-3B)3
通过遵循如对于KTA(N51)3合成所述相同的方案,经由在三价溴化物支架KTA-Br上连接三个带硫醇标签的单体N51-3B肽S-乙酰基乙醇酸-(N51-3B)来合成三聚肽复合物。
设计N51-3B序列以尝试产生更可溶和稳定的N51三聚体。序列是对原始N51中的Ala的单一变化。
肽N51-3B使用Fmoc/t-Bu化学在自动化肽合成仪上通过固相合成。使用的树脂是H-Rink Amide MBHA resin LL(100-200 mesh,0.36 mmol/g)(EMD Biosciences)。S-乙酰基乙醇酸-N51-3B的合成、切割和纯化遵循如对于S-乙酰基乙醇酸-N51所述相同的方案。纯化的肽通过电喷雾质谱测定法进行表征。ESI谱?#20801;镜?#33655;状态+4至+7。解卷积质量为6007.8 Da(序列预测的质量为6010 Da)。
将纯化的肽前体S-乙酰基乙醇酸-N51(5 mg)溶解于1ml pH 7.3缓冲液中,所述缓冲液含有6 N胍、0.1 N乙酸铵和0.5 N?#21069;貳?#20351;0.25等量KTA-Br3溶解于三氟乙醇中,并且逐滴加入肽溶液中。通过LC-MS监测反应。在4小时后,终止反应,并?#21307;?#28342;液直接装载到Vydac? C4柱(10 x 250 mm,5μ)上,并且通过反相HPLC进行纯化,使用在0.1%三氟乙酸的存在下的水/乙腈梯度,流速5 ml/分钟。通过质谱法进行进一步分析?#26434;?#20110;?#24067;?#19977;聚体的合并级分。ESI谱?#20801;镜?#33655;状态+14至+18。解卷积质量为18405.4 Da (序列预测的质量为18406 Da)。
5. 胆酸(N51)3
经由在三价三马来酰?#21069;?#32966;酸模板上连接三个带硫醇标签的单体N51肽S-乙酰基乙醇酸-N51来合成三聚肽复合物。
将胆酸钠1 (2 g,4.65 mmole)悬浮于25 ml THF (?#37027;?#21579;喃)中。将烯丙基碘(3.8 ml,1当量)加入混合物中,随后添加2.2 g氢化钠(60%)。将所得到的混合物在70℃下搅拌过夜,并且通过TLC和LC-MS进行监测。随后将水加入反应混合物和乙酸乙酯/1 N HCl中。将产物提取到有机层内,用盐水洗涤,并且在无水Na2SO4上?#31245;鎩?#25152;得的?#31181;破?#36890;过LC-MS进行表征,并且证实主要组分是分子量528.7 Da的三价烯丙基胆酸2。
烯丙基胆酸2 (300 mg,0.8 mmole)、半胱?#36153;?#37240;盐和偶氮二异丁腈(AIBN)(作为自由基引发剂)与?#29366;?5 ml,由氮脱气)在光反应器中混合。将混合物用UV灯在254 nm波长下照射,并且在?#26885;?#19979;搅拌经过三天。通过LC-MS和TLC监测反应。化合物3 (C39H73N3O5S3,MW=760.29)及其甲酯4 (C40H75N3O5S3 MW=774.25)的产物以1:1比获得。
将化合物4 (10 mg,1当量)溶解于1 ml DMF中,随后加入γ-马来酰?#21069;范?#37240;(3.6当量)、HATU (1当量)和三乙胺(2当量)。将反应搅拌2小?#24065;?#23436;成。在蒸发后,通过乙酸乙酯/ 1 N HCl、NaHCO3和盐水提取残渣。有机层在Na2SO4上?#31245;?#24182;过滤。将滤?#21495;ㄋ酰?#38543;后纯化以获得分子量1269.6 Da的化合物5;其中发现的(M+Na+)峰为1292.26 Da。
将纯化的肽前体S-乙酰基乙醇酸-N51(4.8 mg)溶解于0.2 ml pH 7缓冲液中,所述缓冲液含有20 mM Tris和0.5 N?#21069;貳?#23558;50 μg三马来酰?#21069;?#32966;酸溶解于50 μl DMF/TFE中,并且逐滴加入肽溶液中。通过LC-MS监测反应。在2小时后,反应完全,并?#21307;?#28151;合物直接装载到Jupiter C18柱(10 x 250 mm,10μ)上,并且通过反相HPLC进行纯化,使用在0.1%三氟乙酸的存在下的水/乙腈梯度,流速5 ml/分钟。通过质谱法进行进一步分析?#26434;?#20110;?#24067;?#19977;聚体化合物6胆酸(N51)3(ChA-(N51)3)的合并级分。理论平均分子量为19296 Da,,而发现的单一同位素峰为19289.6 Da。

6. 具有用于缀合的硫醇的胆酸(N51)3
经由在具有掩蔽的硫醇基团的三马来酰?#21069;?#32966;酸模板上连接三个带硫醇标签的单体N51肽硫代丙酸酰基-N51来合成三聚肽复合物。在连接后,去除掩蔽的硫醇以形成可缀合的胆酸-(N51)3。
将半胱胺(1.15 g)和乙酰氨基?#29366;?1 g)的混合物溶解于TFA (三氟乙酸)中,并且在?#26885;?#19979;搅拌3小时,以获得分子量148 Da的(S-乙酰氨基甲基)半胱胺7;而发现的(M+H)离子峰为149 Da。
将烯丙基胆酸2 (100 mg)与EDC (二氯化乙烯)、DIEPA (N,N-二异丙基乙胺)一起在DCM (二氯甲烷)中混合,随后添加溶解于DCM中的化合物7 (56 mg)。通过TLC监测反应并且发现在2小时内完成。在反应混合物用DCM稀释后,加入1 N HCl,并?#21307;?#21270;合物提取到有机层内。将有机层在Na2SO4上?#31245;錚?#24182;且浓缩以获得分子量658.97 Da的化合物8;而发现的(M+H)离子峰为659 Da。
将化合物8 (500 mg)、半胱?#36153;?#37240;盐和偶氮二异丁腈(AIBN)与?#29366;?5 ml,由氮脱气)在光反应器中混合。将混合物用UV灯在254 nm下照射,并且在?#26885;?#19979;搅拌经过三天。通过LC-MS和TLC监测反应进展。在反应完成后,将水加入反应混合物中,随后为乙酸乙酯/1 N HCl(1:1),以获得具有理论分子量889.5 Da;和观察到的分子量890 Da ((M+H)离子峰)的产物三氨基胆酸(化合物9)。
将化合物9,(50 mg,1当量)溶解于2 ml DMF中,随后加入γ-马来酰?#21069;范?#37240;(4.5当量)、HATU (4.5当量)和三乙胺(9当量)。将反应搅拌2小?#24065;?#23436;成。在蒸发后,用乙酸乙酯/ 1 N HCl、NaHCO3和盐水提取残渣。有机层在Na2SO4上?#31245;?#38543;后过滤。将滤?#21495;ㄋ酰?#24182;且纯化以获得理论分子量1384.6 Da的化合物10;发现的(M+H)离子峰为1385.6 Da。
肽N51使用Fmoc/t-Bu化学在自动化肽合成仪上通过固相合成。使用的树脂是H-Rink Amide ChemMatrix (Matrix-Innovation Inc.)。用双重?#21058;?#36827;行酰化30分钟,使用超过树脂?#21355;?#27688;基5-10倍过量的氨基酸。用等摩尔量的HATU [2-(1H-9-氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基-脲六氟磷酸酯]和2倍摩尔过量的DIEA (N,N-二异丙基乙胺)活化氨基酸。侧链保护基团如下:三苯甲基用于谷氨酰胺、天冬酰胺和组氨酸;叔丁氧羰基用于赖氨酸和色氨酸;叔丁基用于谷氨酸、苏氨酸和丝氨酸;和2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰用于精氨酸。在序列装配后,在HATU和三乙胺的存在下,在肽树脂上的N末端氨基?#21058;?#33267;DMF中的3-(三苯甲硫基)丙酸。在合成结束时,用切割混合物(92.5%三氟乙酸、2.5%三异丙基硅烷、2.5%水和2.5% 3,6-二氧杂-1,8-辛烷二硫醇)在?#26885;?#19979;处理?#31245;?#32957;树脂2小时。将树脂过滤并将溶液加入冷二乙醚,以便沉淀肽。在离心后,将肽团块用冷二乙醚洗涤两次,以去除有机清除剂。将最终团块?#31245;錚?#37325;悬浮于25%乙酸水溶液中,并且冻干。
粗制肽通过反相HPLC进行纯化,使用Jupiter C18柱(250 x 30 mm,10μ,300A)、在0.1%三氟乙酸的存在下的水/乙腈梯度,流速40 ml/分钟。在Jupiter C18柱(150 x 4.6 mm,5μ,300 A)上执行分析型HPLC。纯化的肽通过电喷雾质谱测定法进行表征。ESI谱?#20801;镜?#33655;状态+4至+7。解卷积质量为6022 Da (序列预测的质量为6023 Da)。
将纯化的肽硫代丙酸N51 (15 mg)溶解于5 ml 20 mM Tris缓冲液(pH 7.0)中。将溶解于2 ml乙腈溶液中的模板化合物10 (1.05 mg)加入肽溶液中。通过HPLC监测反应。在1小时后,将所得到的混合物直接装载到C18柱上,并且纯化以获得理论平均分子量19455 Da的产物11。ESI谱?#20801;镜?#33655;状态+13至+18。解卷积质量为19451.5 Da。
将化合物11 (5 mg)溶解于5 ml pH 4含有乙酸的水性缓冲液中。使乙酸汞(2.1 mg)溶解于2 ml乙腈中,并且逐滴加入肽溶液中。通过HPLC监测反应。在1小时后,将12 μl 2-巯基乙醇加入混合物中。将所得到的混合物在50℃下加热3小时,随后使用PD10脱盐柱(GE Healthcare Lifesciences,Piscataway,NJ)纯化,使用5%乙酸作为洗脱剂。ESI谱?#20801;镜?#33655;状态+13至+19。解卷积质量为19384 Da (序列预测的质量为19384 Da)。

免疫原产生:重组肽
1. 重组(CCIZN36)3
编码下文列出的肽序列的合成基因通过GeneArt?(Life Technologies Corporation,Carlsbad,CA)由合成寡核苷酸和/或PCR产物装配。使用NdeI和BamHI克隆位点,将片段克隆到pET20b_A092 (EMD Biosciences,Gibbstown,NJ)内。从经转化的细菌中纯化质粒,并且通过UV光谱法测定浓度。通过测序验证最终产物。在使用的限制位点内的序列一致为100%。质粒在使用前冻干。

根据制造商的说明书,用编码CCIZN36的基因的质粒转化BL21(DE3)pLysS感受态细胞(Invitrogen?,Life Technologies Corporation,Carlsbad,CA)。将经转化的细胞在具有50 μg/mL氨苄青霉素和34 μg/mL氯霉素的Luria-Bertani (LB)琼脂上铺平板,并且在37℃下生长过夜。从板中挑选几个集落,并且用单一集落接种具有抗生素的LB培养基,并且在37℃下伴随在225 rpm下的振荡生长过夜。还对于来自过?#21476;?#20859;基的每个集落制备甘油原种,并且甘油原种用作未来按比例扩大表达实验的原材料。具有抗生素的新型LB培养基用过夜预培养物的1:40稀释物接种,直至在600 nm处的光密度达到0.6-0.8。随后通过添加0.5 mM异丙基-b-D-半乳糖硫代吡喃糖苷(IPTG)诱导蛋白质表达。培养物在37℃下生长另外3-4小时,并且随后通过在4℃下以10,000xg离心15分钟收获细胞。将细胞团块贮存于-20℃下。
将细胞重悬浮于裂解缓冲液(50 mM Tris,pH 8.0、2 mM MgCl2、10 mM DTT、70 U/mL Benzonase? (EMD Biosciences,Gibbstown,NJ)、1X Roche Complete?蛋白酶抑制剂混合物(Roche Diagnostics Corp.,Indianopolis,IN))中,并且通过3次经过微射流机进?#36763;?#35299;。裂解产物随后通过离心得到澄清。SDS-PAGE和蛋白质印迹分析证实大多数CCIZN36产物在不溶性级分中检测到。相应地,通过反复匀浆化和离心步骤由不溶性级分制备洗涤的包涵体。最终洗涤的包涵体通过离心形成团块并且在-70℃下冷冻。
将纯化的包涵体(2 g)连同200 mg TCEP [(三(2-羧?#19968;?膦]一起溶解于具有0.1% TFA的50%乙腈水溶液中。溶液在?#26885;?#19979;维持过夜。第二天早晨,通过离心澄清制剂。将含有重组肽的上清液装载到Jupiter C18柱(250 x 30 mm,10μ,300A)上,并且通过反相HPLC进行纯化,使用在0.1%三氟乙酸的存在下的水/乙腈梯度,流速40 ml/分钟。在Vydac?联苯基柱(150 x 4.6 mm)上执行分析型HPLC,并且肽通过电喷雾质谱测定法进行表征。ESI谱?#20801;镜?#33655;状态+4至+11。解卷积质量为7510.1 Da (序列预测的质量为7506 Da)。
将纯化的肽前体(60 mg)溶解于80 ml缓冲液(pH 7.5)中,所述缓冲液含有1 N胍、0.2 M HEPES、1 mM EDTA、1.5 mM还原型?#20837;?#29976;肽和0.75 mM氧化型?#20837;?#29976;肽。通过HPLC监测氧化反应。在过夜后,通过将500μl TFA加入溶液来终止反应,并?#21307;?#28342;液直接装载到Vydac?联苯基柱(22 x 250 mm,10-15μ)上,并且通过反相HPLC进行纯化,使用在流速20 ml/分钟的0.1%三氟乙酸的存在下的水/乙腈梯度。分析型HPLC分析与上文描述的相同。通过高分辨率质谱法进一步分析?#26434;?#20110;?#24067;?#19977;聚体的合并级分。ESI谱?#20801;镜?#33655;状态+12至+27。解卷积质量为22524 Da (序列预测的质量为22511 Da)。
2. 重组(CCIZN51)3
编码下文列出的肽序列的合成基因通过GeneArt?由合成寡核苷酸和/或PCR产物装配。使用NdeI和BamHI克隆位点,将片段克隆到pET20b_A092内。从经转化的细菌中纯化质粒,并且通过UV光谱法测定浓度。通过测序验证最终产物。在使用的限制位点内的序列一致为100%。质粒在使用前冻干。

根据制造商的说明书,用编码CCIZN51的基因的质粒转化BL21(DE3)pLysS感受态细胞(Invitrogen?)。将经转化的细胞在具有50 μg/mL氨苄青霉素和34 μg/mL氯霉素的Luria-Bertani (LB)琼脂上铺平板,并且在37℃下生长过夜。从板中挑选几个集落,并且用单一集落接种具有抗生素的LB培养基,并且在37℃下伴随在225 rpm下的振荡生长过夜。还对于来自过?#21476;?#20859;基的每个集落制备甘油原种,并且甘油原种用作未来按比例扩大表达实验的原材料。具有抗生素的新型LB培养基用过夜预培养物的1:40稀释物接种,直至在600 nm处的光密度达到0.6-0.8。随后通过添加0.5 mM异丙基-b-D-半乳糖硫代吡喃糖苷(IPTG)诱导蛋白质表达。培养物在37℃下生长另外3-4小时,并且随后通过在4℃下以10,000 x g离心15分钟收获细胞。将细胞团块贮存于-20℃下。
将细胞重悬浮于裂解缓冲液中,并且通过3次经过微射流机进?#36763;?#35299;。裂解产物随后通过离心得到澄清。SDS-PAGE和蛋白质印迹分析证实大多数CCIZN51产物在不溶性级分中检测到。相应地,通过反复匀浆化和离心步骤由不溶性级分制备洗涤的包涵体。最终洗涤的包涵体通过离心形成团块并且在-70℃下冷冻。
将包涵体溶解于含有4 M尿素、20 mM HEPES和20 mM TCEP的缓冲液中。溶液在?#26885;?#19979;维持过夜。在离心后,将上清液装载到Vydac?联苯基柱(22 x 250 mm,10-15μ)上,并且通过反相HPLC进行纯化,使用在0.1%三氟乙酸的存在下的水/乙腈梯度,流速20 ml/分钟。在Vydac?联苯基柱(150 x 4.6 mm)上执行分析型HPLC。纯化的肽通过电喷雾质谱测定法进行表征。ESI谱?#20801;镜?#33655;状态+6至+11。解卷积质量为9419.4 Da (序列预测的质量为9417 Da)。
将纯化的肽前体(20 mg)溶解于40 ml缓冲液(pH 7.5)中,所述缓冲液含有1 N胍、0.2 M HEPES、1 mM EDTA、1.5 mM还原型?#20837;?#29976;肽和0.75 mM氧化型?#20837;?#29976;肽。通过HPLC监测氧化反应。在过夜后,通过将500μl TFA加入溶液来终止反应,并?#21307;?#28342;液直接装载到Vydac?联苯基柱(22 x 250 mm,10-15μ)上,并且通过RP HPLC进行纯化,使用在0.1%三氟乙酸的存在下的水/乙腈梯度,流速20 ml/分钟。分析型HPLC分析与上文描述的相同。通过高分辨率质谱法进一步分析?#26434;?#20110;?#24067;?#19977;聚体的合并级分。ESI谱?#20801;镜?#33655;状态+20至+27。解卷积质量为28241.6 Da(序列预测的质量为28248 Da)。
3. 重组SZN51
根据制造商的说明书,用编码SZN51的基因的质粒转化BL21(DE3)pLysS感受态细胞(Invitrogen。将经转化的细胞在具有50 μg/mL氨苄青霉素和34 μg/mL氯霉素的Luria-Bertani(LB)琼脂上铺平板,并且在37℃下生长过夜。从板中挑选几个集落,并且用单一集落接种具有抗生素的LB培养基,并且在37℃下伴随在225 rpm下的振荡生长过夜。还对于来自过?#21476;?#20859;基的每个集落制备甘油原种,并且甘油原种用作未来按比例扩大表达实验的原材料。具有抗生素的新型LB培养基用过夜预培养物的1:40稀释物接种,直至在600 nm处的光密度达到0.6-0.8。随后通过添加0.5 mM异丙基-b-D-半乳糖硫代吡喃糖苷(IPTG)诱导蛋白质表达。培养物在37℃下生长另外3-4小时,并且随后通过在4℃下以10,000 x g离心15分钟收获细胞。将细胞团块贮存于-20℃下。
将细胞重悬浮于裂解缓冲液中,并且通过3次经过微射流机进?#36763;?#35299;。裂解产物随后通过离心得到澄清。SDS-PAGE和蛋白质印迹分析证实大多数SZN51产物在不溶性级分中检测到。相应地,通过反复匀浆化和离心步骤由不溶性级分制备洗涤的包涵体。最终洗涤的包涵体通过离心形成团块并且在-70℃下冷冻。
将洗涤的包涵体(0.2 g)溶解于含有具有0.1% TFA的20 ml 15%乙腈/水中。在通过0.45um PVDF盘(Whatman)过滤后,将溶液直接装载到Vydac? C4柱(22 x 250 mm,300?)上,并且通过反相HPLC进行纯化,使用在流速15 ml/分钟的0.1%三氟乙酸的存在下的水/乙腈梯度。在Vydac? C4柱(150 x 4.6 mm)上执行分析型HPLC。纯化的肽通过电喷雾质谱测定法进行表征。ESI谱?#20801;镜?#33655;状态+5至+12。解卷积质量为9249.4 Da (序列预测的质量为9243 Da)。
4. 重组5-螺旋
将表达C末端带组氨酸标签的5-螺旋肽的冷?#25345;?#32452;大肠?#21496;?#32454;胞解?#24120;?#24182;且重悬浮于50 mM Tris-HCl,pH 8.0和0.3 M NaCl中。用微射流机(两次经过@ ~18,000 psi)制备裂解产物。通过离心收集不溶性级分,并且弃去上清液。通过使用50 mM Tris-HCl,pH 8.0、0.3M NaCl和0.05% Triton X-100的多轮重悬浮和离心来洗涤不溶性级分。将洗涤不溶性级分溶解于8 M盐酸胍(Gd-HCl)中。将胍可溶性提取物与IMAC树脂的浆混合,并且在65℃下混合一小时。允许浆冷却并允许树脂通过重力?#20004;怠?#23558;冷却的树脂转移至玻璃层析柱,并且用50 mM磷酸钠、20 mM咪唑、0.3 M氯化钠和8 M Gd-HCl,pH 8.0洗涤柱。用50 mM磷酸钠、300 mM咪唑、0.3 M氯化钠和8 M Gd-HCl,pH 8.0,从柱中洗脱5螺旋肽。将IMAC产物用三氟乙酸(TFA)和乙腈(ACN)分别掺料至0.1%和5%,并且在50℃下通过反相层析进行纯化。用5%至80% ACN的0.1% TFA溶液的线性梯度,从柱中洗脱5螺旋肽。将含肽级分合并,并且通过在氮气流下的蒸发去除ACN。使用Superdex? 200柱通过制备型尺寸排阻层析进一步纯化5螺旋肽,使用50 mM Tris HCl,pH 8.0和150 mM NaCl作为运行缓冲液。将含有单体5-螺旋肽的级分合并,无菌过滤并且以小等分试样在液氮中速冻用于在-70℃下的长期贮存。
肽表征
1. 圆二色性
所有测量均在J-810分光偏振计(Jasco,Inc.,Easton,MD)上在20℃下进行,使用0.1 cm径长的矩形石英试池。使用1秒时间应答和100 nm/分?#30001;?#25551;速度获得谱,并且对于五次采集求平均值。通过定量氨基酸分析测定原?#21495;?#24230;。对在乙酸钠(25-50 mM)、NaCl (50-150 mM),pH 4-4.5中的肽溶液执行标准测量。根据Chen等人,1974,Biochemistry 13:3350-3359,基于在222 nm下的摩尔椭圆?#22987;扑悝?#34746;旋百分?#21462;?#20351;用2℃/分钟增加,通过监测根据温度在222 nm下的CD信号中的变化测定热稳定性。由合作热解折叠过渡的中点测定解链温度(Tm)。对于具有Tm > 90℃的肽,还在2 M盐酸胍的存在下执行热变性实验。
2. 分析超速离心
所有分析超速离心(AU)实验均用XL-I超速分析离心机(Beckman Coulter,Inc.,Indianopolis,IN)在20℃下执行。对于?#20004;?#36895;度分析,样品以48,000 rpm在20℃下执行5小时,其中径向吸光度扫描大约每4分钟获得。g*(s)分析用程序DCDT+,版本2.2.1(John Philo,Thousand Oaks,CA)或Optima XL-I数据分析软件(Beckman Coulter,Inc.)执行。?#20004;?#24179;衡实验以三个不同装载浓度和三个不同转子速度(16,000、20,000和30,000)进行。使用Optima XL-I数据分析软件或使用Heteroanalysis版本1.1.33 (来自Analytical Ultracentrifugation Facility,Biotechnology and Bioservices Center of the University of Connecticut)计算分子量。
3. D5/5螺旋竞争结合测定(DCBA)
如先前Caulfield等人,2010,J Biol Chem 285:40604-40611中描述的,执行基于荧光共振能量转移(FRET)的体外结合测定。简言之,测定使用缀?#29616;?#38101;穴(Eu-D5)和重组gp41模拟物5螺旋(5H)的生物素化衍生物的D5 IgG(参见美国专利号 7,744,887)。生物素-5H与链霉抗生物素蛋白缀合的别藻蓝蛋白(APC)底物结合,以形成5H-SA-APC复合物。Eu-D5与5H的结合导致从Eu到APC的FRET。当反应系统在340 nm的波长处激发时,结合的Eu-D5量在665 nm的发射波长下进行测量,并且总Eu在620 nm的发射波长下进行测量。数据报告为10000×在665 nm处的信号与在620 nm处的信号的?#21462;?#19982;?#25105;?#32452;分竞争结合的试剂引起比值中的?#26723;汀?
4. p4-2R5中和测定
该中和测定如Joyce等人,2002,J Biol Chem 277:45811-45820中先前描述的执行,伴随下述修饰:将HeLa P4R5细胞以1000细胞/孔种植到384?#35013;?#20013;,并?#19994;?#20108;天在感染后48小时的免疫血清或分馏IgG的系列稀释物的存在下,用适当的HIV-1或SHIV病毒?#28304;?#32422;0.01的感染复数感染,并?#21307;?#32454;胞裂解并且使用化学发光底物(GalScreen?,Applied Biosystems?,Life Technologies Corp.,Carlsbad,CA)测量β-半乳糖苷酶活性。对于纯化IgG的分析,数据表示为IC50,定义为导致化学发光信号的50%减少的IgG浓度。对于血清分析,IC50定义为导致50%减少的化学发光信号的血清稀释度倒数。
结果
肽表征由通过CD光谱法进行二级结构评价和通过AUC进?#26800;?#32858;物状态的生物物理评价组成。D5表位的完整性和呈现在DCBA和P4/2R5中和测定中进行评估,以测量包含在前发夹中间物内的疏水口袋的适当呈现。
表2概括?#26031;?#20110;产生的肽构建体的数据。一般而言,肽的可溶性在3至5的pH?#27573;?#20869;是最佳的,因此CD和AUC测定在其中TFA抗衡离子导致pH ~3.5的水中执行,或在乙酸钠缓冲液pH 4中是最可靠的。在该pH?#27573;?#20869;,单体和三聚肽构建体?#20801;?#39640;百分比的α螺旋结构,与预测一致。基于NHR的肽构建体?#20801;?#38543;着pH增加,特别是在pH 6-8的?#27573;?#20869;,朝向聚集和沉淀的渐增趋势。单体N51、N51-2B和N51-3B肽均?#20801;?#20986;对于自结合的强优先度,如从观察到的与预测的分子量的AUC?#20154;?#35777;实的。然而,大多数这些构建体在接近中性pH下是相对不稳定的,并且?#20801;?#20986;显著聚集。通过添加SZ三聚化结构域使N51稳定的早期尝试是部分成功的,并且在溶液中该肽自装配以形成明显的三聚体-四聚体平衡。这些肽的螺旋性在全长N51背景下是最佳的,因为N51和SZN51的C末?#31169;?#30701;的Δ23形式都?#20801;?#20943;少的螺旋含量。通过在多个浓度和多个转子速度下的?#20004;?#24179;衡对N51和SZN51家族肽的AUC分析获得了变化相当大的计算的分子量值,表明分析模型没有精确地拟合所有数据。最可能的解释是,虽然这些肽?#20801;?#33258;结合的倾向,但该寡聚化是不受控制的,并且随着时间过去形成多重形式的渐增高级寡聚体和聚集物。相比之下,经由改造的二硫化物(CCIZN51)3的氧化或通过化学支架例如KTA(N51)3稳定的三聚N51肽?#20801;?#26497;高程度的二级结构,并且AUC具有接近统一的比例,意味着几乎没有三聚体的明显聚集或自结合。
通过测量其在DCBA测定中竞争结合5-螺旋的能力,来评价多种肽构建体对中和单克隆抗体D5呈现构象上正确的结合表位的能力。IC50值跨越多种构建体是可比较的,除了在N51-2B和N51-3B中使用的突变对D5结合具有明显的负面影响之外。尽管这些肽中的氨基酸取代都没有改变定义为L568、W571、G572和K574的关键D5接触残基,但共同突变L565A与L568紧密接近,并且可以对结合具有无法预测的作用。相比之下,这些肽?#20801;?#19982;天然N51可比较的对于病毒进入抑制的IC50值,表明突变没有不利地影响疏水口袋结合C-七肽重复肽的能力,并且因此充当融合的显性失活抑制剂。一般而言,跨越肽系列观察到的相对恒定的抗病毒活性提供了前发夹中间物结构的适当呈现得到维持的定性证据。?#26723;?#27880;意的是在KTA(N51)3中实现了对V570A的抑制效力的大约10?#23545;?#24378;。

实施例2
血清学
1. ELISA
通过针对直接加入链霉抗生物素蛋白包被的96?#35013;?Thermo Fisher Scientific,Inc.,Pittsburg,PA)的生物素化的肽测试免疫血清样品来测定血清终点稀释度。生物素化的肽以在PBS中的4 μg/ml浓度/孔在4℃下包?#36824;?#22812;。板用含有0.05% Tween-20的PBS(PBST)洗涤六次,并且用含有3% (v/v)脱脂奶粉的PBST(PBST-乳)封闭。将测试样品、免疫前和免疫样品稀释,以1:100开始,并且系列稀释4倍,在100 μl/孔的最终体积中八次。板在?#26885;?#19979;温育2小时,随后为用PBST的六次洗涤。五十微升HRP缀合的山羊抗豚鼠(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.,West Grove,PA)或山羊抗人(Invitrogen)二抗在PBST-乳中分别以1:5000或1:2000稀释,并且加入每个孔中,并且在?#26885;?#19979;温育一小时。将板洗涤六次,随后添加以100 μl/孔的底物(TMB;Virolabs,Inc.,Chantilly,VA),并且在3-5分钟显色后用TMB停止?#21644;?#27490;。抗体滴度测定为在450 nm下给出超过缀合对照孔的平均值加上2标准差的OD值的最高稀释度的倒数。
2. D5/5螺旋竞争结合测定(DCBA)
如先前Caulfield等人,2010,J Biol Chem 285:40604-40611中描述的,执行基于荧光共振能量转移(FRET)的体外结合测定。简言之,测定使用缀?#29616;?#38101;穴(Eu-D5)和重组gp41模拟物5螺旋(5H)的生物素化衍生物的D5 IgG。生物素-5H与链霉抗生物素蛋白缀合的别藻蓝蛋白(APC)底物结合,以形成5H-SA-APC复合物。Eu-D5与5H的结合导致从Eu到APC的FRET。当反应系统在340 nm的波长处激发时,结合的Eu-D5量在665 nm的发射波长下进行测量,并且总Eu在620 nm的发射波长下进行测量。数据报告为10000×在665 nm处的信号与在620 nm处的信号的?#21462;?#19982;?#25105;?#32452;分竞争结合的试剂引起比值中的?#26723;汀?
3. 中和测定
a. P4/2R5测定
测定如Joyce等人,2002,J Biol Chem 277:45811-45820中先前描述的执行,伴随下述修饰:将HeLa P4R5细胞以1000细胞/孔种植到384?#35013;?#20013;,并?#19994;?#20108;天在免疫血清或分馏IgG的系列稀释物的存在下,用适当的HIV-1或SHIV病毒?#28304;?#32422;0.01的感染复数感染。在感染后48小时,将细胞裂解并且使用化学发光底物(GalScreen,Applied Biosystems)测量β-半乳糖苷酶活性。对于纯化IgG的分析,数据表示为IC50,定义为导致化学发光信号的50%减少的IgG浓度。对于血清分析,IC50定义为导致50%减少的化学发光信号的血清稀释度倒数。
b. TZM-bl测定
中和测量为在如先前描述的在TZM-bl细胞中的单轮感染后的萤光素酶报道基因表达中的减少。参见Montefiori(2004)于Current Protocols in Immunology eds Coligan等人(John Wiley & Sons)12.11.1-12.11.15和Li等人,2005,J Virol 79:10108-10125。TZM-bl细胞得自NIH AIDS Research and Reference Reagent Program,如由John Kappes and Xiaoyun Wu投稿的。简言之,使200 TCID50病毒与一式两份的系列3?#26029;?#37322;的测试样品一起在150 μl的总体积中在37℃下在96孔平底培养板中温育1小时。将新鲜的受胰蛋白酶作用的细胞(在含有75 μg/ml DEAE右旋糖酐的100 μl生长培养基中的10,000个细胞)加入每个孔中。一组对照孔接受细胞和病毒(病毒对照),并?#20234;?#19968;组仅接受细胞(?#38236;?#23545;照)。在48小时温育后,将100 μl细胞转移到96孔黑色固体板(Costar?),用于使用Britelite Luminescence Reporter Gene Assay System(PerkinElmer Inc.,Waltham,MA)测量发光。中和滴度是在扣除?#38236;識LU后,与病毒对照孔相比较,在其下相对发光单位(RLU)减少50%的稀释度。通过在293T细胞中的转染制备分子克隆的ENV假型病毒的测定原种,并且如Li等人,2005,J Virol 79:10108-10125中所述在TZM-bl细胞中进?#26800;?#23450;。进化枝A、B和C参考Env克隆先前已得到描述。参见Li等人,2005,J Virol 79:10108-10125;Li等人,2006,J Virol 80:11776-11790;和Blish等人,2007,AIDS 21:693-702。
c. A3R5测定
该测定根据萤光素酶报道基因表达中的减少,测量在96孔微量稀释板中的中和。A3R5细胞(A3.01/R5.6)通过US Medical HIV Research Program(MHRP提供。这是人成淋巴细胞细胞系CEM的衍生物,其天然表达CD4和CXCR4,并且在MHRP下改造为表达CCR5。参见Folks等人,1985,Proc. Natl. Acad. Sci.(USA)82:4539-4543。细胞对通过大多数HIV-1?#23616;?#30340;感染是适当允许的。DEAE右旋糖酐用于在中和测定过程中的培养基中,以增强传染性。因为细胞系不含报道基因,所以必须使用携带在病毒基因组中的报道基因的分子克隆的病毒。携带海肾萤光素酶报道基因(Env.IMC.LucR病毒)的Env表达传染性分子克隆提供了用于中和测定的合适感染。报道基因的表达在感染后不久通过病毒Tat蛋白质反向诱导。萤光素酶活性通过发光进行定量,并且与初始接种物中存在的传染性病毒颗粒数目成正?#21462;?#27979;定对于?#21537;?#36890;容量在96孔培养板中执行。克隆细胞群体的使用提供了增强的精确度和均匀性。该测定已对于用通过在293T细胞中的转染产生的Env.IMC.LucR病毒的多轮感染进行标准化。
实施例3
HIV 350和365:豚鼠免疫原性
在第0、4和8周时,Duncan-Hartley豚鼠(HIV-350,n=8/组*)用100微克肽免疫原肌内免疫接种三次。在20 mM Hepes缓冲液,中性pH下重构的肽配制到180 μg羟基磷酸铝硫酸盐(Merck & Co.,Inc.)加上40 μg Iscomatrix Adjuvant?(CSL,Inc.)/剂量中。对于每只动物在第7 和1周时在血清分离管中经由全血收集血清样品,以及在第一次免疫接种前(取血前)的?#22797;?#34880;清收集。
研究HIV-350已测试肽构建体SZN51。表3a?#20801;?#20102;在研究中用于该组的免疫接?#22336;?#26696;。
在第0、4和8周时,Duncan-Hartley豚鼠(HIV-365,n=6/组)用30 μg肽免疫原肌内免疫接种三次。在20 mM HEPES缓冲液,中性pH下重构的肽配制到180 μg羟基磷酸铝硫酸盐(Merck & Co.,Inc.)加上40 μg Iscomatrix Adjuvant? (CSL,Inc.)/剂量中。对于每只动物在第3、7 和1周时在血清分离管中经由全血收集血清样品。血清学如实施例2中所述执行。
研究HIV-365评价(1)由合成KTA(N51)3、KTA(N51-2B)3、KTA(N51-3B)3、ChA(N51)3和重组(CCIZN51)3组成的一系列受限和稳定的N51三聚肽;和(2)与(CCIZN36)3随后为KTA(N51)3和5螺旋的方案相比较的同源(CCIZN36)3免疫接种。表3b?#20801;玖斯?#20110;研究的免疫接?#22336;?#26696;和组指定。血清学使用p4/2R5中和测定并且使用TZM-bl测定(病毒V570A)和A3R5测定执行。

结果
图2呈现了如在p4/2R5测定中针对病毒V570A测定的,关于N51肽系列的中和测定数据的总结。非?#24067;?#21463;限的重组SZN51肽明确地在其引发中和抗体应答的能力方面次于所有剩余肽免疫原。这明?#20998;?#23454;通过用CCIZ或化学支架核心的支架实现的N肽的?#24067;?#31283;定,对于引发所需功能免疫应答是关键的。
表4呈现了如在T=11时间点(对于两个动物个体在最后一次剂量后3周)测定的中和抗体滴度和作为计算的几何平均值的总结。一致地,对于所测试的所有病毒?#23616;輳?#21547;有与(CCIZN36)3或5-螺旋组合的N51肽的组在引发更高的中和抗体滴度方面优于单独的(CCIZN36)3。

实施例4
HIV 360:非人灵长类免疫原性
该NHP研究在两个阶段中进行,以(1)测试多次(CCIZN36)3免疫接种的给药效应,和(2)评价在用(CCIZN36)3初免的动物中的异源抗原施用的利益。
恒河猴(恒河猴(Macaca mulatta)),三只/组,在0、1和2个月时用100、300或1000 μg(CCIZN36)3进行免疫接种。在34周时,所有组均用另外剂量的100微克(CCIZN36)3进行加强。在加强免疫接种后几个月,将猴再分组,从而使得所有组均具有所有(CCIZN36)3剂量的相等表示。每组以4周间隔用下述方案进行免疫接种:组1给予(CCIZN36)3的两次免疫接种;组2用KTA(N51)3和5螺旋序贯免疫接种;并且组3用5螺旋和KTA(N51)3序贯免疫接种。在20 mM HEPES缓冲液,中性pH中重构的肽或5螺旋在180 μg羟基磷酸铝硫酸盐(Merck & Co.,Inc.)加上40 μg Iscomatrix Adjuvant?(CSL,Inc.)/剂量中配制。收集在所示时间点的全血用于血清并且用于血清学分析,指示结合和病毒中和测定。
表5总结?#26031;?#20110;完整研究的方案。

结果
图3和4概括?#26031;?#20110;整个研究的ELISA和DCBA测定结果。在第11周(剂量3后3周)时的ELISA和DCBA已?#20801;玖己?#24212;答,但在p4/2R5测定中,即便针对D5超敏V570A_HXB2病毒的中和抗体滴度也是低的(数据未示出)。所有动物随后在34周时施用第四个剂量的100 μg (CCIZN36)3。ELISA和DCBA滴度在该26周休息期后下降,并且如T=36周取血分析?#20801;荊?#20004;者均得到加强。尽管ELISA滴度未达到先前峰水平DCBA滴度,但功能D5样特异性的量度达到更高水平。然而,p4/2R5中和抗体滴度再一次低于?#19978;?#21069;豚鼠实验的预测,其中免疫接种的动物发展可比较的ELISA和DCBA应答。在该点时,将每组中的动物打乱,以消除任何可能的偏差,并且在另一个休息期后,将异源抗原以序贯组合用于三个研究组中的两个。在这种情况下,组1接受两个另外剂量的(CCIZN36)3,而组2接受KTA(N51)3随后为5-螺旋,并且组3接受5-螺旋随后为KTA(N51)3。ELISA和DCBA滴度在34和62周之间的中间休息期过程中已显著下降,但在免疫接种后得到加强。在接受异源抗原的组中明确观察到中和滴度中的重要差异,如由图5A-B和6所见的。在P4/2R5和A3R5测定中测量的中和抗体应答的量级和宽度在组2和3中得到显著增强。
图7A-B呈现了在研究的1期和2期过程中测定的P4/2R5中和抗体滴度的比较。针对V570A_HXB2的应答在?#25105;?#26102;期过程中未进行测量,但针对V570A的应答在异源组中在响应动物数目和中和抗体滴度量级方面明确得到增强。
实施例5
HIV 366:非人灵长类免疫原性
该NHP研究的目的是扩展研究HIV-360的结果,并测定在异源组中观察到的增强是否可归于KTA(N51)3或5螺旋的添加或是否需要两者。
恒河猴(恒河猴),六只/组,用100 μg/剂量的配制抗原进行免疫接种。一组接受所有三种测试抗原以100 μg/抗原的相?#28982;?#21512;物的一系列四次同源免疫接种。免疫接种在0、1、6和8个?#29575;备?#20104;。在20 mM HEPES缓冲液,中性pH中重构的肽或5-螺旋在180 μg羟基磷酸铝硫酸盐(Merck & Co.,Inc.)加上40 μg Iscomatrix Adjuvant?(CSL,Inc.)/剂量中配制。收集在所示时间点的全血用于血清并且用于血清学分析,指示结合和病毒中和测定。
表6概括?#26031;?#20110;完整研究的方案。组1和5含有与HIV-360中测试的?#20999;?#30456;同的抗原组合。另外,测试KTA(N51)3或5-螺旋(组2和3)同源施用的功效。组4测试序贯施用的(CCIZN36)3和KTA(N51)3的功效,而组6测试了其中所有免疫原在每个剂量时同时施用的多重抗原组合。

结果
图8A-B?#20801;?#20102;在P4/2R5和TZM-bl测定中测定的,在最后一次免疫接种后两周收集的T=38周血样,针对病毒V570A_HXB2的中和抗体滴度。在两个测定中最有效的中和滴度通过用单独的KTA(N51)3的同源免疫接种实现,尽管含有与(CCIZN36)3,或(CCIZN36)3和5-螺旋二者组合的该肽的组趋于比单独的(CCIZN36)3更好的功效。三种免疫原的组合混合物看起来与序贯施用并无显著不同。
在使用两个进化枝C层1病毒分离物Ce0393和MW965的A3R5测定中,独立地证实了对V570A_HXB2的阳性中和结果,如图9A-B中所示。对Ce0393的结果使用在38周时的剂量4后两周血样生成,并且对于Mw965使用在26周时的剂量3后两周血样生成。如对于V570A_HXB2超敏分离物观察到的,在同源KTA(N51)3组中观察?#38454;?#26377;力的中和滴度,而含有该肽的其他组相对于单独的(CCIZN36)3或5螺旋趋于朝向更高的滴度。事实上,在所有测定中,单独的5-螺旋在引发中和抗体滴度方面极?#37232;?#23613;管如通过ELISA测定的,它在免疫方面是有力的(数据未示出)。此外,该分析提供了这些免疫原诱导跨-进化枝保护的能力的证据,因为数据?#20801;?#20102;使用其序列衍生自进化枝B病毒分离物(HXB2)的肽,两个进化枝C病毒的阳性中和。
表7呈现?#26031;?#20110;所有组,在整个研究中收集的多个血样的中和滴度的几何平均值概括。如预期的,中和滴度在剂量3和4之间的12周休息结束时的第36周时显著下降。对于所有其他时间点,相对于同源(CCIZN36)3或5-螺旋(组2和3),KTA(N51)3组展示最高中和滴度,而含有N51的组也趋于比同源(CCIZN36)3或5-螺旋更高。

在聚集物中,来自研究HIV-366的结果提供?#26031;?#20110;下述假设的强烈支持:在研究HIV-360中观察到的增强中和功效可归于KTA(N51)3而不是5-螺旋的添加,并且直接支持受限的基于三聚N51的N-肽从功能免疫角度来看是优良的主张。














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本文标题:HIV1GP41前发夹中间物的稳定肽模拟物.pdf
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