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脓毒血症和全身炎症反应综合征的诊断.pdf

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毒血症 全身 炎症 反应 综合征 诊断
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摘要
申请专利号:

CN201280067006.X

申请日:

2012.11.14

公开号:

CN104204808A

公开日:

2014.12.10

当前法律状态:

授权

有效性:

有权

法?#19978;?#24773;: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/68申请日:20121114|||公开
IPC分类号: G01N33/68; C07K14/81; C07K16/00 主分类号: G01N33/68
申请人: 耶拿大学附属医院
发明人: M·基恩托夫; D·什默勒; T·都费尔; F·布朗克豪?#22266;?
地址: 德国耶拿
优?#28909;ǎ?/td> 2011.11.14 EP 11189024.0
专利代理机构: 上海专利商标事务所有限公司 31100 代理人: 陶家蓉
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法律状态
申请(专利)号:

CN201280067006.X

授权公告号:

||||||

法律状态公告日:

2016.08.24|||2015.01.07|||2014.12.10

法律状态类型:

授权|||实质审查的生效|||公开

摘要

本发明涉及用于对患有或疑似患有脓毒血症的对象的?#28388;?#21644;/或疾病后果进行诊断、预测或风险分级的方法,该方法包括在取?#36816;?#36848;对象的样?#20998;?#27979;定抗胰蛋白酶(ATT)或其片段的存在和/或水平和/或测定转甲状腺素蛋白(TTR)或其片段的存在和/或水平,其中ATT和/或TTR或其片段的存在和/或水平与?#28388;?#39118;险增加相关,并且其中如果ATT的水平低于特定截止值和/或其片段的水平高于特定截止值,则得到所述的?#28388;?#21644;/或不良疾病后果的风险增加,和/或如果TTR的水平低于特定截止值和/或其片段的水平低于特定截止值,则得到所述的?#28388;?#21644;/或不良疾病后果的风险增加。本发明通常涉及ATT和/或TTR或其片段在脓毒血症诊断中的用途,并且涉及SEQ?ID?NO.2-14的核苷酸。

权利要求书

权利要求书
1.  一种用于对患有或疑似患有脓毒血症的对象的?#28388;?#25110;疾病后果进行诊断、预测或风险分级的方法,所述方法包括步骤(a)-(c):
(a)在取?#36816;?#36848;对象的样?#20998;?#27979;定抗胰蛋白酶(ATT)或其片段的水平,
(b)其中ATT或其片段的水平与?#28388;?#25110;不良疾病后果的风险增加相关,并且其中
(c)如果ATT的水平低于特定截止值和/或其片段的水平高于特定截止值,则得到所述的?#28388;?#21644;/或不良疾病后果的风险增加;
和/或包括(d)-(f)的步骤:
(d)在取?#36816;?#36848;对象的样?#20998;?#27979;定转甲状腺素蛋白(TTR)或其片段的水平,
(e)其中TTR或其片段的水平与?#28388;?#25110;不良疾病后果的风险增加相关,并且其中
(f)如果TTR或其片段的水平低于特定截止值,则得到所述的?#28388;?#21644;/或不良疾病后果的风险增加。

2.  如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的ATT或其片段的水平和/或TTR或其片段的水平可优选通过选自以下选择的方法与所述的对?#28388;?#25110;疾病后果进行预测或风险分?#26029;?#20851;:
(a)与全体预定样?#20998;?#27700;平的中值的相关性,
(b)与全体预定样?#20998;?#30340;四分位的相关性,和
(c)与数学模型,诸如例如Cox回归的相关性。

3.  如前述权利要求中?#25105;?#39033;所述的方法,
(a)其特征在于,所述的ATT的水平的截止值为约2g/l,并且可以根据所分析的患者偏差约20%;
(b)其特征在于,所述的TTR的水平的截止值为约10mg/dl,并且可以根据所分析的患者偏差约20%。

4.  如前述权利要求中?#25105;?#39033;所述的方法,其特征在于,所述的ATT或其片段的水平和/或TTR或其片段的水平与?#28388;?#39118;险增加相关
(a)对于ATT低于正常群的中值水平
(b)对于ATT片段高于正常群的中值水平;和
(c)对于TTR及其片段低于正常群的中值水平。

5.  如前述权利要求中?#25105;?#39033;所述的方法,其特征在于,所述方法包括步骤(a)-(c):
(a)从对象中取样;
(b)测定所述的ATT或其片段的水平;和
(c)将所述的ATT或其片段的水平与?#28388;?#25110;存活的?#20811;?#20998;位风险关联;
和/或包括(d)-(f)的步骤:
(d)从对象中取样;
(e)测定所述的TTR或其片段的水平;和
(f)将所述的TTR或其片段的水平与?#28388;?#25110;存活的?#20811;?#20998;位风险相关。

6.  如前述权利要求中?#25105;?#39033;所述的方法,其特征在于,在一个或多个以下的时间点上取样:当所述对象首次进入医学机构或救护车时、当所述对象在?#26412;?#23460;时、当所述对象在重症监护室时、治疗前、治疗开始后、治疗开始24小时后、治疗开始48小时后和/或治疗开始72小时后。

7.  如前述权利要求中?#25105;?#39033;所述的方法,其特征在于,所述对象处于选自下组的病症中:感染的初级形式如脓毒血症,感染的递增形式如脓毒血症、严重脓毒血症和感染性休克。

8.  如前述权利要求中?#25105;?#39033;所述的方法,其特征在于,除了?#36816;?#36848;对象的?#28388;?#21644;/或疾病后果进行预测或风险分级以外,采用对取?#36816;?#36848;对象的样?#20998;蠥TT或其片段的水平和/或TTR或其片段的水平的测定来差异性地诊断所述对象是否可能患有全身性感染(SIRS)、早期脓毒血症、严重脓毒血症或感染性休克。

9.  如前述权利要求中?#25105;?#39033;所述的方法,其特征在于,所述样品选自下组:血浆样品、血清样品、全血样品、血液样品或其部分、淋巴液样品、尿样品和?#25105;?#21069;述样品的提取物。

10.  一种通过监测患有脓毒血症或脓毒血症类疾病的患者对特定药物的治疗响应就与所述疾病的严重性相关的个体患者治疗做出医学决定的方法,所述方法包括(a)-(d)的步骤:
(a)在选自下组的多个时间点上从所述对象中取至少两个样品,
i.在治疗开始之前,
ii.在治疗开始之后,和/或
iii.在一个或多个其他的时间点;
(b)测定所述样?#20998;蠥TT或其片段的水平,
(c)将所述样?#20998;蠥TT或其片段的水平与?#36816;?#36848;特定药物的阳性或阴性响应相关联;
(d)如果所述的ATT的水平在药物治?#30772;?#38388;增加和/或如果所述的ATT片段的水平在药物治?#30772;?#38388;减少,则得到所述阳性响应;
和/或包括(e)-(h)的步骤:
(e)在选自下组的多个时间点上从所述对象中取至少两个样品,
i.在治疗开始之前,
ii.在治疗开始之后,和/或
iii.在一个或多个其他的时间点;
(f)测定所述样?#20998;蠺TR或其片段的水平,
(g)将所述样?#20998;?#25152;述的TTR或其片段的水平与?#36816;?#36848;特定药物的阳性或阴性响应相关联;
(h)如果所述的TTR或其片段的水平在药物治?#30772;?#38388;增加,则得到所述阳性响应。

11.  一种在对象中差异性诊断疾病的方法,其中所述疾病选自下组:(i)全身性炎症(SIRS)、(ii)早期脓毒血症、(iii)严重脓毒血症或(iv)感染性休克,所述方法包括(a)-(d)的步骤:
(a)在取?#36816;?#36848;对象的样?#20998;?#27979;定ATT或其片段的水平,和
(b)将ATT或其片段的水平与(i)早期脓毒血症、(ii)严重脓毒血症或(iii)感染性休克关联,和
(c)其中如果所述的ATT的水平低于特定截止值和/或所述的ATT水解片段的水平高于特定截止值,则得到所述的ATT或其片段的水平与(i)早期脓毒血症、(ii)严重脓毒血症或(iii)感染性休克的所述相关性;
和/或包括(d)-(f)的步骤:
(d)在取?#36816;?#36848;对象的样?#20998;?#27979;定TTR或其片段的水平,和
(e)将所述的TTR或其片段的水平与(i)早期脓毒血症、(ii)严重脓毒血症或(iii)感染性休克关联,
(f)其中如果所述的TTR或其片段的水平低于特定水平,则得到所述的TTR或其片段的水平与(i)早期脓毒血症、(ii)严重脓毒血症或(iii)感染性休克的所述相关性。

12.  一种用于诊断脓毒血症或预测脓毒血症患者的预后的试剂盒,所述试剂盒包括:
(a)对ATT或其片段和/或TTR或其片段有特异性的抗体,和
(b)显示样?#20998;?#21547;有的所述的ATT或其片段的水平与预后的相关性的标准数据和/或显示所述的TTR或其片段的水平与预后的相关性的标准数据,以及任选的
(c)手册。

13.  一种具有SEQ ID NO.2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14中?#25105;?#24207;列的多肽。

14.  一种编码权利要求13所述的多肽的多核苷酸。

15.  一种特异性结合权利要求13所述的多肽的抗体。

16.  如权利要求13和/或SEQ ID NO.1所述的多肽在诊断脓毒血症的方法中的用途。

说明书

说明书脓毒血症和全身炎症反应综合征的诊断
?#38469;?#39046;域
本发明属于医学领域,更具体地属于诊断,并且更具体地属于脓毒血症的诊断和预后。
背景
本发明涉及感染性并发症的诊断的领域。术语“脓毒血症(Sepsis)?#24065;?#32463;用于描述多种与伴随感染的炎症的全身性表现相关的临床病症。因为与非感染性病因继发响应的炎症的临床相似性,鉴定脓毒血症已经称为一种特别有挑战性的诊断问题。在这个方面,已经提供了对“全身炎症反应综合征”(或“SIRS”)的定义,其通常指感染性或非感染?#28304;?#20260;的严重全身性反应,以及对相关的综合征“脓毒血症”、“严重脓毒血症”和“感染性休克”的定义(Bone等,Chest101:1644-53,1992)。SIRS可以与感染和多?#22336;?#24863;染病因,包含外伤相关。
尽管可得到抗生素和支持性治疗,脓毒血症仍然是发病和?#28388;?#30340;重要原因。已经研究了几个实验室测试,与对象的完全临?#24067;?#27979;联用来进行脓毒血症的诊断/预后(Giamarellos-Bourboulis等,Intensive Care Med.28:1351-56,2002)。
已经?#33268;?#30340;几?#22336;?#23376;标记物?#28304;?#36827;在人和几个动物物种中诊断和治疗监测脓毒血症。最广泛使用的标记物可能是CRP(C-反应蛋白)和PCT(原降钙素)。
也已经?#33268;?#20102;各种白介素作为脓毒血症的潜在生物标记。然而,它们现在由于缺少特异性而只有有限的用途。例如,Carrigan等(Clinical Chemistry50(8)(2004)1301-1314)报道了这些标记物在人类中的灵敏度和特异性:


可以在EP2060920A1中发现这种概况。
这些数据显示,即使在脓毒血症疾病模式已经充分被研究的人类中,现有标记物的灵敏度和特异性(甚至平均值)可以分别降至33%和66%,更不用说现有公开数据的均匀性。
这些数据显示,明?#28304;?#22312;对具有改善的诊断特性的新型诊断标记物的需求。因此,脓毒血症的诊断,尤其是脓毒血症的早期诊断,仍然在临床医学中非常需要。最优的诊断应该揭示具有患脓毒血症风险的人和处于脓毒血症的早期阶段的人。尤其是在全身性炎症中,即,在多处创伤的患者中,这样的诊断通常是非常困难的,因为其他病例过程干扰标准重症监护医学中所测的“正常”生理值和参数。
在患有全身性炎症的患者中诊断脓毒血症,例如,多发创伤的患者中的并发症,是非常具体的问题,在重症监护医学中对于该问题存在高度的需求。
因此,本发明的目的是提供用于诊断脓毒血症的灵敏和/或特异性的合适方法。
定义
在本申请中术语“脓毒血症”或“感染性并发症”含义相同并?#20918;?#29702;解为包括“脓毒血症”、“感染性并发症”、“严重脓毒血症”、“感染性休克”及其更早的阶段,所有的症状与伴随感染的炎症的全身性表现相关。
本文中,“全身炎症反应综合征”(或“SIRS”)被定义为对各种严 重临床创伤的全身炎症反应,这些创伤表现为两?#21482;?#26356;多种以下病症:1)体温>38℃或<36℃;2)心率>90跳/分钟;3)呼吸?#24503;剩?0次呼吸/分钟或PaCO2<32mm Hg;并且4)白细胞计数>12000/cu mm;<4,000/cu mm,或>10%未成熟(带)形式。当SIRS是确诊的感染性过程的结果时,其被称为脓毒血症(Bone RC,Balk RA,Cerra FB,Dellinger RP,Fein AM,Knaus WA等,脓毒血症和器官衰竭的定义与新型?#21697;?#36896;脓毒血症中应用的指南(Definitions for sepsis and organ failure and guidelines for the use of innovative therapies in sepsis.)ACCP/SCCM共识会议委?#34987;?The ACCP/SCCM Consensus Conference Committee.)美国胸科医师学会/美国重症医学会。(American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine.)Chest.1992年6月;101(6):1644-1655)。
本文中,“alpha-1-抗胰蛋白酶?#24065;?#34987;称为抗胰蛋白酶和“ATT”。alpha-1-抗胰蛋白酶或α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)是属于丝氨酸蛋白酶抑制蛋白超家族的蛋白酶抑制剂。其通常称为血清胰蛋白酶抑制剂。由于其抑制多种蛋白酶,α-1-抗胰蛋白酶也被称为α-1-蛋白酶抑制剂(A1PI)。其保护组织免受炎症细胞的酶的影响,尤其是嗜?#34892;?#31890;细胞弹性蛋白酶,并且在血液中具有1.5-3.5g/l的参?#30830;段В?#20294;是在严重炎症后该浓度可以上升许多倍。在其缺少时,嗜?#34892;?#31890;细胞弹性蛋白酶自由地?#21040;?#24377;性蛋白,弹性蛋白有助于肺部的弹性,这?#32440;到?#23548;致呼吸并发症,诸如在成年人中的肺气肿或COPD(慢性阻塞性肺病)以及在成年人或儿童中的硬化。
在本文中,?#30333;?#30002;状腺素蛋白”(TTR)是甲状腺激素甲状腺素(T4)和视黄醇的血清和?#32422;?#28082;运载体。这就是转甲状腺素蛋白为何得到其名字,转运甲状腺素和视黄醇。TTR原来被称为前白蛋白,因为其在电泳凝胶上比白蛋白跑得快。TTR的差异峰在13.8kDa处并且在本文中所要求的方法和试剂盒的内容中要求。
在本发明的内容中,术语?#33324;小薄ⅰ?#38408;值”、“截止”和“截止值”作为同义词使用。
本文使用的关于诊断或预后标记物的用途的术语“相关”是指比较患有或已知处于给定病症的风险的患者中;或已知没有给定病症的人中标记 物的存在或数量。如上述,患者样?#20998;?#26631;记物的水平可以与已知和具体诊断相关的水平比较。样品的标记物水平被称为与诊断相关?#24739;矗?#26412;领域?#38469;?#20154;员使用标记物的水平来确定患者是否具有特定类型的诊断,并且因此响应。或者,样品的标记物的水平可以与已知与良好结果(例如,没有疾病等)相关的标记物的水平相?#21462;?#22312;优选的实施方式中,标记物水平的概况与总体可能性或特定后果关联。
“预后”是指评价给定的过程或后果出现的可能性。这通常通过检测一?#21482;?#22810;种“预后指标”来确定。这些是标记物,在患者(或从患者处得到的样?#20998;?中其存在或含量表示给定过程或后果出现的可能性。例如,当从这样的患者?#26800;?#21040;的样?#20998;?#19968;?#21482;?#22810;种预后指标达到足够高的水平时,该水平可能标志着患者处于最终进入末期肾病(ESRD)的可能性增加,例如,患者具有成为“进展者”的可能性增加。
发明详述
本发明涉及对患有或疑似患有脓毒血症的患者的?#28388;?#21644;/或疾病后果进行诊断、预测或风险分级的方法,该方法包括
●测定取白所述对象的样?#20998;?#25239;胰蛋白酶(ATT)或其片段和/或测定转甲状腺素蛋白(TTR)或其片段的存在和/或水平,
●其中ATT和/或TTR或其片段的存在和/或水平与?#28388;?#21644;/或不良疾病后果的风险增加相关;并且,
●其中如果ATT(成熟片段;55kDa)的存在和/或水平低于特定的截止值和/或其片段的水平高于特定的截止值,则给出所述的?#28388;?#21644;/或不良疾病后果的风险增加,和/或
●如果TTR的存在和/或水平低于特定的截止值和/或其片段的水平低于特定的截止值,则给出所述的?#28388;?#21644;/或不良疾病后果的风险增加。
片段是图9中所示的那些。
本发明通常也涉及使用ATT和/或TTR或其片段用于脓毒血症的诊断。
多种蛋白酶在位于c-端的反应?#34892;?#29615;上消化α-1-抗胰蛋白酶。产生α-1-抗胰蛋白酶片段(参见附图)。SELDI-TOF-MS(表面增强激光解吸电离飞 行时间质谱)被称为一种用于分析和/或测定本发明内容中的这些片段的存在和/或水平的方法。
分析了240名患有感染性脓毒血症或SIRS的患者。本发明所要求的4789.7Daα-1-抗胰蛋白酶-片段作为一般区分SIRS和脓毒血症的一种标记物而受到关注。
本发明的方法也涉及比较待诊断个体/患者/对象的标记物的水平与预定值。预定值可以采取多?#20013;?#24335;。其可以是单个截止值:这可以是,例如,中值或平均值或参考群的75、90、95或99百分位。例如,这也可以是?#30333;?#20248;”截止值。给定标记物的最优截止值是对于产物的诊断灵敏度和特异性最大的该标记物的值。诊断灵敏度是由标记物(“真阳性”)正确识别携带疾病或发展该疾病风险的患者的相对分数(在?#25105;?#29305;定例子中取决于待回答的诊断或预后问题),并且诊断特异性是由标记物(“真阴性”)正确识别不携带疾病或发展该疾病风险的患者的相对分数(在?#25105;?#29305;定例子中取决于待回答的诊断或预后问题)。这可以通过截止值来优化最大阴性预测值或最大阳性预测值,取决于临床或经济需要。从而优化特异性和灵敏度。
因此,可以根据是否认为以同时鉴定“假阳性”的代价鉴定大多数处于风险中的对象是更合适的,或者是否认为?#28304;?#22833;几个处于?#26800;?#39118;险中的对象的代价而主要鉴定处于高风险中的对象是更合适的来采用阈值。
可以基于比较组来建立预定值,诸如在一个定义组中的风险是另一个定义组中风险的两倍的情况。其可以是?#27573;В?#20363;如,在测试群被等分(不等分)为各组,诸如低风险组、?#26800;?#39118;险组和高风险组,或分成四分位,最低的四分位是具有最低风险的个体而最高的四分位是具有最高风险的个体。
预定的值可以在根据它们的习惯、种族、遗传?#20154;?#36873;的特定参?#28909;?#20043;间变化。因此,所选的预定值可以考虑个体落入的分类。由本领域普通?#38469;?#20154;员通过不超过常规实验来选择合适的?#27573;?#21644;分类。
在某些实施方式中,并不依赖一组中的一个或多个标记物的特定阈值来决定从对象?#26800;?#21040;的标记物水平的概况是否是特定诊断/预后的指标。相 反,本发明可以采用评价作为全部整体的标记物组“概况”。在这样的一组标记物中变化的特定“指纹”模式可实际上作用为具体的诊断或预后指标。如本文所述,可?#28304;?#21333;个样?#20998;校?#25110;组中一个或多个成员的时间变化(或组响应值)?#26800;?#21040;变化模式。本文所述的组是指一组标记物。本文中,已知标记物中的一种可以与ATT和/或TTR结合。
可以通过各?#22336;?#27861;得出组响应值。一个示例是Cox比例风险分析。另一个示例是优化ROC曲线:这可以通过绘制特定组标记物的灵敏度与该组在各截止上的1-(特异性)的ROC曲线来实现。
在这些方法中,来自对象的标记物测量值的概况被一起考?#19988;?#25552;供诊断或预后的整体可能性(以数?#21046;婪只?#39118;险百分比表示)。在这样的实施方式中,在某些标记物亚组中的增加可能足以指示一名患者中的特定诊断/预后,而不同标记物亚组的增加可能足以指示另一名患者中的相同或不同的诊断/预后。也可以向组中的一个或多个标记物上施加加权因数,例如,?#24065;?#20010;标记物在鉴定特定诊断/预后中是特别高度可用之时,其可以被加权使得在给定的水平下其单独就足够表示阳性结果。相似地,可以提供加权因数使得没有一个给定水平的特定标记物能足够指示阳性结果,但仅当另一个标记物也作用于分析时表示结果。
在某些实施方式中,选择标记物和/或标记物组来展?#31181;?#23569;约70%的灵敏度,更优选至少约80%的灵敏度,甚至更优选至少约85%的灵敏度,更优选地至少约90%的灵敏度,和最优选至少约95%的灵敏度,与至少约70%的特异性,更优选至少约80%的特异性,甚至更优选至少约85%的特异性,更优选至少约90%的特异性,和最优选至少约95%的特异性组合。在特别优选的实施方式中,灵敏度和特异性都为至少约75%,更优选至少约80%,甚至更优选至少约85%,更优选至少约90%,并且最优选至少约95%。在本文中的术语“约”是指给定测量值的+/-5%。
在其他实施方式中,使用阳?#36816;?#28982;?#21462;?#38452;?#36816;?#28982;?#21462;?#35753;步比或风险比作为试验预测风险或诊断疾病的能力的测量。在阳?#36816;?#28982;比的示例中,值为1表示在“患病”和“对照”组中的对象中的阳性结果可能是相等的;大于1的值表示阳性结果更可能在患病组中;并且小于1的值表示阳性结 果更可能在对照组中。在阴?#36816;?#28982;比的示例中,值为1表示在“患病”和“对照”组中的对象中的阴性结果可能是相等的;大于1的值表示阴性结果更可能在患病组中;并且小于1的值表示阴性结果更可能在对照组中。在某些优选的实施方式中,优选选择标记物和/或标记物组来展示出至少约1.5或更多或者约0.67或更少的阳性或者阴?#36816;?#28982;比,更优选至少约2或更多或者0.5或更少,更优选至少约5或更多或者约0.2或更少,甚至更优选至少约10或更多或者约0.1或更少,并且最优选至少约20或更多或者约0.05或更少。在本文中的术语“约”是指给定测量值的+/-5%。
在让步比的示例中,值为1表示在“患病”和“对照”组中的对象中的阳性结果可能是相等的;大于1的值表示阳性结果更可能在患病组中;并且小于1的值表示阳性结果更可能在对照组中。在某些优选的实施方式中,优选选择标记物和/或标记物组来展示出至少约2或更多或者约0.5或更少的让步比,更优选至少约3或更多或者0.33或更少,更优选至少约4或更多或者约0.25或更少,甚至更优选至少约5或更多或者约0.2或更少,并且最优选至少约10或更多或者约0.1或更少。在本文中的术语“约”是指给定测量值的+/-5%。
在风险比的示例中,值为1表示在“患病”和“对照”组中终点(例如,死亡)的相对风险是相等的;大于1的值表示在患病组中风险更大;而小于1的值表示在对照组中风险更大。在某些优选的实施方式中,优选选择标记物和/或标记物组来展示出至少约1.1或更多或者约0.91或更少的风险比,更优选至少约1.25或更多或者0.8或更少,更优选至少约1.5或更多或者约0.67或更少,甚至更优选至少约2或更多或者约0.5或更少,并且最优选至少约2.5或更多或者约0.4或更少。在本文中的术语“约”是指给定测量值的+/-5%。
本领域?#38469;?#20154;?#34987;?#29702;解将诊断或预后指标与诊断或未来临床后果的预后风险相关联是一种统计学分析。例如,如统计学显著?#36816;?#24179;所示,超过X的标记物水平可能表示相?#26579;?#26377;低于或等于X的水平的患者,该患者更可能出现不良后果。另外,标记物浓度从基线水平上的变化可能是患者预后的反?#24120;?#24182;?#20918;?#35760;物水平变化的程度可能与不良事件的严重性相关。通 常通过比较两个或更多个?#28023;?#24182;?#33008;?#23450;置信区间和/或p值来确定统计学显著性。参见,例如,Dowdy和Wearden,(《研?#23458;?#35745;学》)Statistics for Research,John Wiley&Sons,New York,1983。本发明的优选置信区间是90%、95%、97.5%、98%、99%、99.5%、99.9%和99.99%,而优选的p值是0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、0.001和0.0001。
在其他的实施方式中,可以进行诊断或预后标记物的多重测定,并且可以使用标记物的时间变化来确定诊断或预后。例如,可以在初?#38469;?#27979;定对象样?#20998;?#30340;标记物浓度,并且再次在第二个时间上测定来自第二个对象样品的标记物浓度。在这样的实施方式中,从初?#38469;?#38388;到第二个时间的标记物增加可以是特定诊断或特定预后的指标。相似地,从初?#38469;?#38388;到第二个时间的标记物减少可以是特定诊断或特定预后的指标。
本文使用的“样品”是指用于诊断、预后或评价?#34892;?#36259;的对象(诸如患者)的目的得到的体液样品。优选的测试样品包含血液、血清、血浆、?#32422;?#28082;、尿、唾液、痰液和胸腔积液。另外,本领域?#38469;?#20154;?#34987;?#35748;识到一些测试样品在分离或纯化过程之后易于分析,例如,将全血分离为血清和血浆组分。
因此,在按照本发明的方法的优选实施方式中,所述样品选自血液样品、血清样品、血浆样品、尿样品或?#25105;?#21069;述样品的提取物。
在本发明的优选实施方式中,ATT和/或TTR或其片段的水平优选通过选自下组的替代的方法与?#28388;?#21644;/或疾病后果的预测或风险分?#26029;?#20851;:
●对应于全部预测定样?#20998;蠥TT和/或其片段的中值的相关性,
●对应于全部预测定样?#20998;蠥TT和/或其片段的四分位的相关性,和
●与数学模型的相关性,诸如例如Cox回归。
优选地,ATT的截止值是约2g/l,并且可以根据分析的患者偏离约5%、10%或甚至20%。
优选地,ATT片段的截止值为约4,18pmol/μl,例如,片段4789.7(SEQ ID NO.10表3;PMSIPPEVKFNKPFVFLMIEQNTKSPLFMGKVVNPTQK)对应于20ng/μl,并且片段50kD(4,18pmol/μl)可能根据分析的患者偏差约5%、10%或甚至20%。
TTR的截止值为约10mg/dl(参见图4),并且可以根据分析的患者偏离约5%、10%或甚至20%。
按照本发明,与?#28388;?#39118;险增加相关的ATT或其片段和/或TTR或其片段的水平是
●对于ATT低于正常群的中值水平,和/或
●对于ATT片段高于正常群的中值水平,和/或
●对于TTR低于正常群的中值水平。
所述的方法还可以包括以下步骤:
●从对象中取样,和/或
●测定ATT或其片段的水平,和/或
●测定TTR或其片段的水平,和/或
●将ATT或片段和/或TTR或其片段的水平与?#28388;?#25110;存活的各四分位风险相关。
本发明涉及方法,其中,在一个或多个以下的时间点取样:当对象首次进入医学机构或救护车时,当对象在?#26412;?#23460;时,当对象在重症监护室时,治疗前,治疗开始后,治疗开始24小时后,治疗开始48小时后,和/或治疗开始72小时后和/或诸如治疗开始10天、14天或甚至20天后。
对象患有选自下组的病症:需要抗微生物治疗的感染,感染的递增形式如脓毒血症、严重脓毒血症和感染性休克。
除了所述对象的?#28388;?#21644;/或疾病后果的预测或风险分级以外,本文使用对取?#36816;?#36848;对象的样?#20998;蠥TT或其片段和/或TTR或其片段的测定来差异性地诊断所述对象是否可能患有全身性感染(SIRS)、早期脓毒血症、严重脓毒血症或感染性休克。
所述的样品优选选自下组:血浆样品、血清样品、全血样品、血液样品或其部分、淋巴液样品、尿样品和?#25105;?#21069;述样品的提取物。
优选用诸如ELISA测试或质谱或表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)或LC-MS/MS的诊断试验来测定ATT或其片段和/或TTR或其片段的水平。
本发明涉及通过监测患有脓毒血症或脓毒血症类疾病的患者对特定药 物的治疗响应做出与疾病的严重性相关的个体患者治疗的医学决定的方法,该方法包括以下步骤,
●在选自下组的各时间点上从所述对象中取至少两个样品,
i.在治疗开始之前,和/或
ii.在治疗开始之后,和/或
iii.在一个或多个其他的时间点
●在取?#36816;?#36848;对象的所述样?#20998;?#27979;定ATT或其片段和/或TTR或其片段,
●将取?#36816;?#36848;对象的所述样?#20998;?#30340;ATT或其片段和/或TTR或其片段的水平与?#36816;?#36848;的特定药物的阳性或阴性响应相关联。
如果在药物治疗中ATT水平增加和/或如果在药物治疗中ATT片段的水平?#26723;停?#21017;得到所述阳性响应;和/或如果在药物治疗中TTR或其片段的水平增加,则得到所得阳性响应。
本发明优选涉及就与疾病的严重性相关的对象的个体患者治疗做出医学决定的方法,该方法包括以下步骤,
●从所述对象的至少一个样?#20998;?#22312;选自下组的各时间点上取至少两个样品,
i.在治疗开始之前和/或
ii.在治疗开始之后,和/或
iii.在一个或多个其他的时间点
●在取?#36816;?#36848;对象的所述样?#20998;?#27979;定ATT和/或TTR或其片段,并且
●将取?#36816;?#36848;对象的所述样?#20998;蠥TT和/或TTR或其片段的水平与特定治疗的需要相关联。
如果ATT的水平低于特定截止值和/或ATT水解片段的水平高于特定截止值,则得到ATT或其片段的水平与(i)早期脓毒血症、(ii)严重脓毒血症或(iii)感染性休克的所述相关性;和/或如果TTR或其片段的水平低于特定截止值,则得到TTR或其片段的水平与(i)早期脓毒血症、(ii)严重脓毒血症或(iii)感染性休克的所述相关性。
本发明优选涉及在对象中差异性诊断疾病的方法,其中所述疾病选自 (i)全身性炎症(SIRS)、(ii)早期脓毒血症、(iii)严重脓毒血症或(iv)感染性休克,所述方法包括以下步骤
(1)测定取?#36816;?#36848;对象的样?#20998;蠥TT和/或TTR或其片段的存在和/或水平,和
(2)将ATT和/或TTR或其片段的存在和/或水平与(i)早期脓毒血症、(ii)严重脓毒血症或(iii)感染性休克关联,
(3)其中如果ATT的水平低于特定截止值和/或ATT水解片段的水平高于特定截止值,则得到ATT和/或TTR或其片段的存在和/或水平与(i)早期脓毒血症、(ii)严重脓毒血症或(iii)感染性休克的所述相关性;和/或
(4)其中如果TTR的水平低于特定水平,则得到ATT和/或TTR或其片段的存在和/或水平与(i)早期脓毒血症、(ii)严重脓毒血症或(iii)感染性休克的所述相关性。
同时,本发明涉及诊断脓毒血症和/或预测患有脓毒血症的对象中预后的试剂盒,该试剂盒包括:对ATT或其片段和/或TTR或其片段有特异性的抗体、适配体、或另一种目标特异性分子、显示样?#20998;?#21547;有的ATT或其片段的量与预后之间的相关性的标准数据、和手册。
本发明也涉及用于诊断脓毒血症和/或预测患有脓毒血症的患者中的预后的LC-MS/MS试剂盒,其中由LC-MS/MS来确定ATT、TTR或其片段。这些与标准数据组比较。
优选监测以下的蛋白(SEQ ID NO.1)。如上述和下述,在脓毒血症中,全长蛋白与片段之比显示出以下的变化。
表2:α-1-抗胰蛋白酶
完整的氨基酸序列(N到C端;SEQ ID NO.1)

SEQ ID NO.14是不含其前导序列的上述蛋白并且具有以下序列。
EDPQGD AAQKTDTSHH DQDHPTFNKI TPNLAEFAFS LYRQLAHQSN STNIFFSPVS IATAFAMLSL GTKADTHDEI LEGLNFNLTE IPEAQIHEGF QELLRTLNQP DSQLQLTTGN GLFLSEGLKL VDKFLEDVKK LYHSEAFTVN FGDTEEAKKQ INDYVEKGTQ GKIVDLVKEL DRDTVFALVN YIFFKGKWER PFEVKDTEEE DFHVDQVTTV KVPMMKRLGM FNIQHCKKLS SWVLLMKYLG NATAIFFLPD EGKLQHLENE LTHDIITKFL ENEDRRSASL HLPKLSITGT YDLKSVLGQL GITKVFSNGA DLSGVTEEAP LKLSKAVHKA VLTIDEKGTE AAGAMFLEAI PMSIPPEVKF NKPFVFLMIE QNTKSPLFMG KVVNPTQK
表3:优选的片段:


表3显示了全长蛋白的片段。该表?#27493;?#29255;段分为对脓毒血症的诊断/预后较优选或较不优选(参见“等级?#20445;?表示非常优选而6表示仅仅优选)。
如上述,SEQ ID NO.10是本发明最优选使用的片段。
SEQ ID NO.4可能是非常优选使用的。
SEQ ID NO.5和/或7可能是优选使用的。
SEQ ID NO.3和/或8可以使用。
SEQ ID NO.1、2、6、9、11、12和13也可以使用。
在上述的方法中,可以删除一个或多个片段。在此公开并要求上述片段的?#25105;?#32452;合,而不必将它们全部写下,本领域?#38469;?#20154;员能够这样做。
本发明也涉及具有SEQ ID NO.2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14中?#25105;?#19968;个的序列的多肽。
另外,也包括编码按照SEQ ID NO.2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14所述的多肽的多核苷酸。
由于本发明涉及包括测定所述生物标记物的片段的方法,本发明也涉及特异性识别这些片?#26410;?#32780;允许它们的测定的物质。在优选的实施方式中,所述物质是抗体。在此,本发明也涉及与具有SEQ ID NO.2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14中?#25105;?#19968;个的序列的多肽特异性结合的抗体。
此外,本发明也涉及按照SEQ ID NO.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和/或14所述的多肽在用于诊断脓毒血症的方法中,优选上述的方法中的用途。
本发明还涉及AAT片段的参考标准,该片段由包括在适于切割的条件下用MMP-7孵育AAT的步骤的方法产生。这种参考标准的对于人工、合成参考标准的优势在于其与体内出现的AAT片段更相似。可以使用参比来确定确定的体内分子的分子量,确定浓度或作为其他参?#21462;?
附图说明
图1:患有SIRS和脓毒血症的患者的分类
患有非感染引起的SIRS的患者(SIRS-PCT+)和患有脓毒血症的患者(严重脓毒血症和感染性休克)通过2个决策树算法和鉴定标记物作为抑?#25343;?#30340;CM6.51及其与Trasylol治疗的关系来分类。A和B,分类树(顶部);CM=从CM10阵?#26800;?#21040;的聚类;C1=从Q10阵?#26800;?#21040;的聚类。使用峰聚类和用于区?#21482;?#32773;组(脓毒血症;SIRS-PCT+)决策树算法的接?#33527;?#25805;作特性 曲线分析(中间)和分类意义结果(底部);蓝色=训?#36153;?#21697;,绿色=盲测试样品,橙色=5个月后在分析的盲测试样品,红色=19个ICU测试样品,这些样品已经预期收集用于决策树验证。C,与Trasylol的标记物6.52(顶部)相邻的m/z区域的代表性概况,来自患有非感染引起的SIRS的单个个体(SIRS-PCT+)(中间),和来自CM10芯片上患有脓毒血症的单个个体(底部)。标记了用于内部校正的内部标准的峰(箭头)。
图2:经决策树算法研究的用于分类患有非感染引起的SIRS的患者(SIRS-PCT+)和患有感染引起的SIRS的SIRS患者(sSEPSIS)(严重脓毒血症/感染性休克)的第二替代性决策树,不考虑CM_6.51。
分类树;QC和C1=从Q10阵?#26800;?#21040;的聚类(上图);使用峰聚类和用于区?#21482;?#32773;组(SIRS-PCT+;sSEPSIS)的决策树算法的ROC曲线分析(右下图)和分类结果(左下图)蓝色=训?#36153;?#21697;,绿色=盲测试样品,橙色=5个月后在分析的盲测试样品,红色=19个ICU测试样品,这些样品已经预期收集用于决策树验证。
图3:SIRS-PCT+和sSEPSIS样品的标准化ProteinChip阵列概况的代表性示例
SIRS-PCT+和脓毒血症样品的标准化ProteinChip阵列概况的代表性示例。来自不同研究组的患者的代表性SELDI-TOF-MS蛋白?#21450;?#31034;于?#21644;肌?#24038;?#30418;?#29255;类型Q10;低?#27573;В?.4-5kd芯片类型Q10;峰聚类C1_4.7。中?#30418;?#29255;类型Q10;中间?#27573;В?2.5-15kd;峰聚类C1_13.8。右?#30418;?#29255;类型Q10;高?#27573;В?0-60kd;峰聚类QC_55.7。通过箭头和盒子来标出区分SIRS-PCT+和脓毒血症患者的峰聚类。
图4:鉴定和验证差异表达峰C1_13.8是转甲状腺素蛋白(TTR)
(A)TTR的Western-印迹分析;sSIRS=SIRS-PCT+患者样品;sSEPSIS=sSEPSIS患者样品;+=TTR阳性对照;-阴性对照。(B)以μg/ml计69个sSEPSIS和59个SIRS-PCT+样品的TTR浓度的盒图(C)在使用TTR特异性抗体(下图)或对照抗体的免疫消耗后样品的代表性标准化ProteinChip阵列概况,证实TTR与差异表达的标记物C1_13.8的关系。
图5:QC_55.7和C1_4.7的纯化和鉴定
(A)SIRS-PCT+和sSEPSIS样品的10%Maxi-PAGE显示了3个已经通过胶内消化、MS-和MALDI-TOF/TOF分析鉴定为α-1-抗胰蛋白酶(AAT)和?#23435;?#34507;?#33258;?FBG)的点(B)抗AAT-Western-印迹显示AAT以两种同?#20013;?#23384;在,较低的条带主要在sSEPSIS样?#20998;?#34920;达(C)对ATT进?#26800;?#30005;聚焦证明与来自SIRS-PCT+患者的样品相比,sSEPSIS样?#20998;?#22686;加的ATT片段化(D)为了证实在sSEPSIS患者中4.79kDa峰是通过切割AAT产生的,我们将AAT与小量来自sSEPSIS患者的血浆孵育;在sSEPSIS血浆的存在下,AAT被切割产生4.78kDa片段(E)在还原剂存在下杂质血清蛋白沉淀后的代表性ProteinChip阵列概况。通过与几乎不存在的白蛋白峰相比,在55.7kDa处AAT峰和28kDa?#27573;?#20869;双重标记的峰(55982.11+2H)的强度增加来证明AAT?#24739;?
图6:氨基酸序列
抗胰蛋白酶活性?#34892;?#30340;氨基酸序列(带有大小)。
图7:脓毒血症患者
来自具有抗胰蛋白酶蛋白片段的脓毒血症患者的SELDI谱。
图8:脓毒血症患者
通过LC-MS的方式在4个患者群内定量4.8kD抗胰蛋白酶片段。当与未感染的多处创伤和SIRS患者比较时,在感染后的患者群中的水平明显较高。在患有嗜?#34892;?#30333;细胞减少症和温和感染的患者中可能测量到中高浓度。
图9:α-1-抗胰蛋白酶全氨基酸序列(N到C端)及其片段。
图10:标记物水平仅在患有严重脓毒血症的患者中增加。
取自患有严重脓毒血症或严重SIRS的对象的样?#20998;?#30340;生物标记物水平与取自患有乳癌的对象的样品(Mamma-Ca)中的生物标记物水平的比较。
实施例
表1:患者的临床特性
数据以平均值±SD(数值在十分位左右)和百分比表示。SIRS-PCT-代表PCT血清水平<0.3ng/ml;SIRS-PCT+代表PCT血清水平>0.3ng/ml。*APACHE-II=急性生理学和慢性健康评估。这个尺度?#27573;?#20026;0-71,较高的 分数表示较大的疾病严重性。**SOFA=序贯性器官功能衰竭评分。对于六个器官?#20302;砈OFA上的各分项分数?#27573;?#20026;0-4,总分数0-24,较高的分数表示更严重的器官功能?#20064;?
材料和方法
本研究?#24515;?#30340;患者为2002年9月至2003年9月以及2006年1月至2006年3月进入麻醉和重症监护医学部的外科重症监护室(ICU)并分别满足按照ACCP/SCCM共识会议的脓毒血症标准或具有急性器官功能?#20064;?#30340;非感染性来源的SIRS标准(ICD-10-GM码)的患者。
在下述患者中获取血样:对于患有非感染性来源的SIRS的患者,在进入ICU后;对于67名SIRS患者(83%),在24小时内;对于7名患者(8.6%),在48小时内;对于剩下的患者,在进入ICU后超过48小时;以及对于患有脓毒血症/感染性休克的患者,在第一次脓毒血症诱导的器官功能?#20064;?#24320;始之后24小时内。低于18岁的、怀孕的或缺少知情同意的患者被排除。进一步通过?#24515;?#24403;天的原降钙素血清浓度对患有非感染性来源的SIRS的患者分级。PCT血清水平<0.3ng/ml的被分类为PCT-阴性SIRS(SIRS-PCT-),升高的PCT血清水平被分类为PCT-阳性SIRS(SIRS-PCT+)。当地伦理委?#34987;?#25209;准这项研究。
按照标准化的方案;10ml动脉血被吸入EDTA管(德国奴姆布?#31243;?#30340;斯卡特德公司(Sarstedt,Nuembrecht))中;之后立即加入800μl的蛋白酶抑制剂混合物(Complete Mini,德国曼海姆的罗氏诊断公司(Roche Diagnostics GmbH、Mannheim))。对管进行温和混合并且在4℃下,3750rpm下离心(在管中部2516g)10分钟;血浆等份立即在-80℃下冷冻。总共收集来自159名个体患者的166个样品;在7名他们的状态改变(例如,从SIRS变为sSEPSIS)的患者中,在ICU停留期间的不同时间点收集两个样品,并且分配到相应的样品组。
在Series4000ProteinChip SELDI读数仪(加利福尼亚州赫尔克里斯的伯乐公司(Bio-Rad,Hercules,CA))读取上进行SELDI-TOF质谱;Biomek2000液体处理工作站(liquid-handling station)被用于样品稀释和ProteinChip 处理。样品在4℃下过夜解冻并且一式两份进行分析。等份分别对于第三次和第一次实验解冻1次或2次。在第二次实验中,使用已经用U9缓冲液变性并然后在-80℃下储存至分析的第一次实验剩余的等份。对于蛋白芯片分析,用60μl的变性缓冲液(9M尿素,1%Chaps)来变性40μl的样品并孵育30分钟。20μl变性的样品在0.1mol/L Tris-HCl,pH9.0(Q10)或0.05mol/L HEPES,pH7.3(CM10)中稀释1-5并且在合适的芯片预处理和洗涤之后分别加载在Q10ProteinChip阵列(强阴离子交换阵列;加利福尼亚州福利蒙特的Ciphergen生物?#20302;?#20844;司(Ciphergen Biosystems Inc,Fremont,CA))和CM10ProteinChip阵列(弱阳离子交换阵列;加利福尼亚州福利蒙特的Ciphergen生物?#20302;?#20844;司)上。在室温下在DPC MicroMix5振荡器(威斯康星州麦迪逊的普洛麦格公司(Promega,Madison,WI))上孵育30分钟后,用合适的缓冲?#21512;吹有?#29255;3次并且用水清洗2次。为了去除剩余的液体,ProteinChip在2950rpm下离心10秒并且空气干燥5分钟。在分析芯片之前,1μl的饱和能量吸收分子(EAM)溶液(5mg芥子酸溶于75μl乙腈和75μl1%三氟乙酸中)被施加于位点表面(spot surface)。在ProteinChip读数仪(PCS4000,加利福尼亚州福利蒙特的Ciphergen生物?#20302;?#20844;司)中用包含350激光照射的自动化数据收集方?#38468;?#34892;质量分析。使用1-200kDa的质量?#27573;В?#20854;被分为两个谱部分:1-30kDa和30-200kDa。对CM10芯片,激光能量对于1-30kDa和30-200kDa测量分别被设定为3000nj和4900nj(预?#26085;?#23556;3700nj和5500nj),对于Q10芯片,激光能量对于1-30kDa和30-200kDa测量分别被设定为3250nj和5200nj(预?#26085;?#23556;3750nj和5900nj)。对于各点,数据被平均到谱上。用已知的蛋白标准内部校准质量精度并且用一体化肽/蛋白分子量标准外部校准质量精度。
通过总离子电流(TIC)对谱进行标准化。在大多数示例中,尤其是第一决策树,这在两个不同的区域(1.5-200kDa和5.5-200kDa)进行;具有高于2.55和低于0.42倍平均标准化因数的标准化因数的?#29366;?#20998;析中排除。为了确保不同实验之间的峰强度的可比性,使用已经在第一次实验的标准化之后得到的外部标准化系数。对于各?#20013;?#29255;类型,使用Ciphergen快车软件(Express Software)(3.0版;加利福尼亚州福利蒙特的Ciphergen生物 ?#20302;?#20844;司)来检测三个不同区域(例如,m/z1500-10000、10000-30000、30000-200000)中的峰。在减去基线后在以下条件下检测峰聚类:对于首轮(first pass),S/N-比>5且最小峰阈值5%,对于次轮(second pass),S/N-比>2且聚类质量窗为0.1%-0.3%,取决于聚类?#36203;?#20998;析的聚类区域。然后各峰的强度值对于分析的各重复样品对取平均。3个不同m/z区域的峰数据输出为Microsoft Excel(华盛顿州雷蒙德市的微软公司(Microsoft,Redmond,WA))中的CSV文件。
使用Ciphergen生物标记物模式软件(BPS)5.0版进行CART分析。合并含有来自2个芯片类型的3个不同质量区域的峰数据的CSV文件以得到一个包括全部质量?#27573;?1.5-200kDa)的峰强度的文件。来自训练组的数据被输入到BPS中并?#33008;?#21069;述建立分类树。
使用SPSS18进行统计学分析。为了计算平均峰强度和产生第二决策树的个体标记物的?#22411;家?#21450;ROC曲线(图S2A-C),仅仅包含具有全部三种标记物的完整数据组的样品。
通过阴离子交换侧谱和/或一维SDS-PAGE来纯化蛋白。切下相应尺寸的点;胶内消化胰蛋白酶并且经过MS分析。详?#25913;?#23481;参见数据补充中的补充文本,该补充伴随本文的在线版本。
按照来自Glaser等的改良的方法?#24739;?1-抗胰蛋白酶(AAT)(15)。在免疫化学?#20302;?#19978;按照生产商的说明(福尼亚州布利市的贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter,Brea,CA))通过速率散射比浊法测量转甲状腺素蛋白(TTR)。
结果
为了测试SELDI-TOF MS区?#21482;?#26377;非感染引起的SIRS的患者和患有sSEPSIS的患者的能力,在来自按照临床ACCP/SCCM共有标准分组的患者的样?#20998;?#20998;析血浆蛋白分布。?#25216;?#26469;自159名个体患者的166个样品,来自患有严重脓毒血症或感染性休克(sSEPSIS)的患者的81个样品以及来自患有SIRS的无感染患者的85个样品。在7名状态改变(例如,从SIRS变为sSEPSIS)的患者中,包含两个样品并且分配到他们分别的样品组。患 有非感染性来源的SIRS的患者按照他们?#25216;?#24403;天的PCT血清浓度进一步分类为PCT-阴性(PCT<0.3ng/m1)SIRS患者(SIRS-PCT-)和PCT-阳性(PCT>0.3ng/ml)SIRS患者(SIRS-PCT+)。
用于鉴定诊断质量模式的方案包含以下步骤:(1)包括具有已知诊断的样品的训练组的分析,以得到决策树;(2)验证给定的决策树在来自同组的其他患者的测试组中的辨别能力;(3)通过在5个月后重复相同测试组的分析来测试这种辨别的再?#20013;裕?#20197;及(4)在独立的、盲测试组上重复分析。分配到训练、测试和预期测试组的SIRS-PCT-、SIRS-PCT+和sSEPSIS患者的临床特征示于表1。
精?#31471;?#27861;区别SIRS-PCT-阳性和sSEPSIS患者但?#19988;?#36182;于与Trasylol治疗相关的抑?#25343;?
PCT无法区分SIRS和sSEPSIS患者样品
我们首先评估在我们的研究组中用于区?#21482;?#26377;感染性和非感染性引起的SIRS的患者的PCT的诊断值。SIRS(n=75;PCT=6.79[中值];3.38-11.50[25-75百分位])和sSEPSIS(n=72;PCT=4.02[中值];1.84-12.46[25-75百分位])样品的PCT中值并没有显著差异(p=0.62,秩和U检验(Mann Whitney U test))。ROC曲线分析揭示了PCT不足以区分SIRS和sSEPSIS患者样品(AUC=0.525;95%CI=0.428-0.621;在线补充图S1A)。如果我们观察PCT在训练、测试和预期测试组中仅区别SIRS-PCT+与sSEPSIS样品的辨别能力,上述结果也得到证实。
算法区分SIRS-PCT+患者与sSEPSIS患者并且在盲测试组中验证
接着我们提出问题,质量概况是否能进一步分类SIRS-PCT+与sSEPSIS患者。为此,用来自54名患者的谱来实施CART分析(sSEPSIS:n=31,PCT=25.84±75.4;SIRS-PCT+:n=23PCT=20.01±34.3;表1)。得到的分类算法揭示了6.5kDa处的峰对于区分sSEPSIS和SIRS-PCT+病例是重要的。两个图1中所示的示例算法使得能够分别正确鉴定96%和100%的sSEPSIS和SIRS-PCT+病例。为?#25628;?#35777;这些结果,使用包括77名来自相同血清 (SIRS-PCT+:n=36,PCT=16.98±26.1;sSEPSIS:n=41,PCT=15.82±33.1)的其他患者的盲测试组(表1)。同样,图1A/B所示的分类算法分别正确地预测37/36名患有sSEPSIS的患者和24/25名SIRS-PCT+患者(灵敏度=90.2%/87.8%,特异性=66.6%/69.4%(测试组:sSEPSIS的预测AUC=0.756/0.753))。
重复显示诊断蛋白模式分析随着时间的再?#20013;?#24182;且允许在独立测试组中进行临床验证
使用与训练组中相同的条件在5个月后再分析盲测试组。使用相同的决策树,我们得到了正确鉴定sSEPSIS(78%;29/37;AUC=0.841)和SIRS-PCT+(92.8%;26/28;AUC=0.872)患者的相似结果(图1)。为?#31169;?#19968;步验证,在19名ICU患者的独立盲样?#20998;?#37325;复该分析,在取样时和之后回顾时PCT-阳性按照常规临床标?#24613;?#20998;配到sSEPSIS(n=9)或SIRS-PCT+(n=10)组中。如图3所示,样品分别在77%/66%和100%/100%的sSEPSIS和SIRS-PCT+病例中被正确鉴定。
CM_6.51?#24739;?#23450;为与治疗相关的抑?#25343;?
之后我们尝试鉴定第一差异表达的标记物CM6.51。在2002/2003,当从这项研究中收集样品时,经过冠状动脉?#26376;?#31227;植手术(CABG)的患者共同都接受了抑?#25343;?#26469;减少手术期间的失血和输血的需要;大多数我们的SIRS-PCT+患者接受过心脏手术(表1)。在98名心脏手术患者中的70名中,可以得到抑?#25343;?#21058;量的回顾性评价;大多数(94.29%)接受的总Trasylol剂量为从0.5高至8百万KIU。抑?#25343;?#26159;具有6.512kDa的分子量的天然蛋白酶抑制剂。通过比较在CM10芯片上施加后的SELDI-TOF谱与来自接受的SIRS-PCT+患者的谱得到了CM_6.51?#19988;蛛拿?#30340;证据(图1)。6512.74Da处的标记物CM_6.51对应于6512.78Da处的抑?#25343;?#23792;;另外,CM_6.51仅存在于SIRS-PCT+患者(样品162;5百万KIU)?#26800;?#26159;在未接受的sSEPSIS患者(样品140)中几乎不存在。CM_6.51峰强度与接受超过1.5百万KIU的SIRS患者中施用的的总剂量相关(皮尔森相关系数=0.848;p<0.001)。因此,CM_6.51确实区分不同的患者组,其反映了在这些经过心肺分流术 的患者中的预防性给予;但是,其不是感染性SIRS(严重脓毒血症/感染性休克)/具有器官功能?#20064;?#30340;非感染性SIRS的病理生理标记物。
替代性区分决策树不依赖CM_6.51
为了产生替代性决策树,我们评估了不同的分析设置,例如,排除上述的标记物CM_6.51。图2显示?#35828;?#20108;决策树,在学?#30333;?#20013;区分sSEPSIS与SIRS-PCT+患者(93%灵敏度,95%特异性)。有趣的是,这三种树包括2个已经在第一决策树中显示为重要预测因子的聚类(4.7kDa,13.8kDa)。在Q10表面上检测到具有大约55.7kDa的分子量的另外的主要分裂(splitter)。所得的标准化的ProteinChip阵列概况的代表性示例示于图3。该决策树在测试组中的第一次验证得到85.3%和86.1%的灵敏度和特异性(图2)。在5个月后重复该验证,分别为86.4%和92.8%(图2)。在独立盲重组测试组中施用该决策树再次得到正确鉴定88.8%和90%的患有sSEPSIS和SIRS-PCT+的患者(全分类算法的ROC曲线下的面积(ROC积分)AUC=0.911,图2)。在预测SIRS-PCT+和sSepsis的第一测试样品和独立盲测试样?#20998;?个相关标记物的独立ROC面积分别在0.895-0.933(QC_55.7)、0.656-0.910(C1_13.8)和0.712-0.922(C1_4.7)的?#27573;?#20869;(在线补充图S2A-C)。
差异表达的蛋白的鉴定使得能通过常规免疫试验和SELDI-TOF MS免疫捕获来验证
为了鉴定差异表达的蛋白,使用其中?#34892;?#36259;的蛋白峰以高丰度存在的样品。为了鉴定13.8kDa蛋白部分4,样品p218的等份通过阴离子交换色谱的分离后得到的部分通过12%Mini-PAGE纯化。m/z55.7kDa处的峰在10%Maxi-PAGE上纯化;切下相应尺寸的点并?#21307;?#20869;胰蛋白酶消化。所得的片段的MALDI-TOF/TOF分析和随后的MASCOT检索能鉴定标记物C1_13.8为转甲状腺素蛋白(TTR)。首先通过Western印迹分析将TTR指定为差异表达的13.8kDa蛋白,显示TTR主要在SIRS-PCT+患者中表达,同时其不在sSEPSIS患者中检测到(图4A)。其次,在69个sSEPSIS和59个SIRS-PCT+ 样?#20998;?#27979;量TTR;平均浓度分别为7.15mg/dl(95%CI=6.35-7.95)和10.7mg/dl(95%CI=10.0-11.5)(图4B),证明C1_13.8的峰强度与常规TTR免疫试验结果相关(图S2B)。最后,使用TTR特异性抗体的免疫消耗导致与使用对照抗体后观察到的峰强度相比,13.8kDa峰强度的明显?#26723;?图4C)。
为了鉴定m/z55.7kDa处的峰,在10%Maxi-PAGE上纯化后得到的3个点的分析(图5A)鉴定了α-1-抗胰蛋白酶(AAT)和?#23435;?#34507;?#33258;?FBG)。在SIRS-PCT+和sSEPSIS患者中的Western-印迹分析显示FBG表达中没有差异(数据未显示);其中AAT以两种同?#20013;?#23384;在,在sSEPSIS样?#20998;?#20027;要是较低的条带(图5B)。这使我们假设AAT在sSEPSIS的患者中被?#21040;狻?#20026;了证明这个假设,我们通过等电聚焦分析了AAT-同?#20013;汀?#22914;图5C所示,我们观察到与来自SIRS-PCT+患者的样品相比在sSEPSIS的样?#20998;?#26356;明显的AAT片段化。这个结果与Vissers等的发现相符,其已经显示AAT由在验证位点处嗜?#34892;?#31890;细胞?#22836;?#30340;金属蛋白酶切割(16)。预期的片段为4790Da,其正好是sSEPSIS患者在Q10芯片上4.79kDa处观察到的第三重要的差异峰。为了证明该峰是由sSEPSIS患者中的AAT切割产生的,我们将AAT(德国勒沃库森的拜尔生命公司(Bayer Vital GmbH,Leverkusen))与小量的来自sSEPSIS患者的血浆孵育;如图5D所示,在sSEPSIS血浆存在下AAT被切割产生4.78kDa片段,其在对照样?#20998;?#19981;存在。这个结果与在sSEPSIS样?#20998;?#35266;察到的55.7kDa峰?#26723;?#34920;达(在线补充图S2C)伴随着50kDa?#27573;?#20013;峰强度增加(数据未显示)的发现相符。最后,为?#31169;?#19968;步证明55.7kDa峰对应于AAT,我们首先免疫捕获AAT。仅观察到55.7kDa和双重标记的28kDa-峰的峰强度的小幅下降(数据未显示),我们随后基于Glaser等(15)的改良方法通过在还原剂存在下沉淀杂质血浆蛋白来?#24739;疉AT。如图5E所示,与其他蛋白(例如,白蛋白)的峰强度相比,AAT的?#24739;?#19982;28kDa?#27573;?#20869;的双重标记的峰和55.7kDa的明显增加并行,进一步支持55.7kDa峰就是AAT。






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本文标题:脓毒血症和全身炎症反应综合征的诊断.pdf
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