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利用DNA纳米折纸结构作为信号放大探针的检测方法.pdf

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利用 DNA 纳米 折纸 结构 作为 信号 放大 探针 检测 方法
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摘要
申请专利号:

CN201410229096.9

申请日:

2014.05.28

公开号:

CN104133053A

公开日:

2014.11.05

当前法律状态:

授权

有效性:

有权

法?#19978;?#24773;: 授权|||实质审查?#32435;?#25928;IPC(主分类):G01N 33/48申请日:20140528|||公开
IPC分类号: G01N33/48; C12Q1/68 主分类号: G01N33/48
申请人: 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司
发明人: 何丹农; 颜娟; 宋世平; 樊春海
地址: 200241 上海市闵行区江川东路28号
优?#28909;ǎ?/td>
专利代理机构: 上海东方易知识产权事务所 31121 代理人: 唐莉莎
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法律状态
申请(专利)号:

CN201410229096.9

授权公告号:

||||||

法律状态公告日:

2016.08.24|||2014.12.10|||2014.11.05

法律状态类型:

授权|||实质审查?#32435;?#25928;|||公开

摘要

本发明涉及一种利用DNA纳米折纸结构作为信号放大探针的检测分析方法,其特征在于,将生物素分子通过折纸的过程?#24230;?#21040;DNA纳米结构上,所制备的产物为含有多生物素活性位点的DNA纳米结构,此结构可作为信号放大探针应用于生物检测领域中,从而实现抗原、抗体、蛋白质、DNA、RNA、多肽、细胞等目标物的高灵敏度检测。

权利要求书

权利要求书
1.  一种利用DNA纳米折纸结构作为信号放大探针的检测分析方法,其特征在于,将生物素分子通过折纸的过程?#24230;?#21040;DNA纳米结构上,所制备的产物为含有多生物素活性位点的DNA纳米结构,此结构可作为信号放大探针应用于生物检测领域中,从而实现抗原、抗体、蛋白质、DNA、RNA、多肽、细胞等目标物的高灵敏度检测。

2.  根据权利要求1所述利用DNA纳米折纸结构作为信号放大探针的检测分析方法,其特征在于,所述的DNA纳米结构由DNA通过自组装、?#30001;臁?#25240;叠等技术构成的一类纳米结构,组成此结构的单链DNA,可经过如巯基、或生物素、或氨基修饰。

3.  根据权利要求1所述利用DNA纳米折纸结构作为信号放大探针的检测分析方法,其特征在于,包括以下几个步骤:
(1)长链DNA溶液中,加入订书钉链DNA,混合均匀后由高温缓慢降至室温;
(2)向(1)步骤所得产物中,加入连接分子,混合均匀后水浴中连接;
(3)构建基于特定生物分子的检测系统;
(4)将(2)步骤所得产物应用到(3)步骤中的检测系统中;或通过纳米载体应用到(3)步骤中的检测系统中。

4.  根据权利要求3所述利用DNA纳米折纸结构作为信号放大探针的检测分析方法,其特征在于,所述长链DNA为合成的长链DNA、或噬菌体M13、或经过滚环扩增技术所得的长单链DNA;所述订书钉链DNA,为多条能与长链DNA互补杂交的单链DNA,其中一条或多条为生物素修饰。

5.  根据权利要求3所述利用DNA纳米折纸结构作为信号放大探针的检测分析方法,其特征在于,步骤(1)所述高温为95℃,室温为25℃,降温时间为12小?#24065;?#19978;。

6.  根据权利要求3所述利用DNA纳米折纸结构作为信号放大探针的检测分析方法,其特征在于,所述连接分子为亲和素、或链霉亲和素 、或链霉亲和素标记的?#22791;?#36807;氧化物酶。

7.  根据权利要求3所述利用DNA纳米折纸结构作为信号放大探针的检测分析方法,其特征在于,所述与连接分子作用条件为25~37℃,水浴30分钟以上。

8.  根据权利要求3所述利用DNA纳米折纸结构作为信号放大探针的检测分析方法,其特征在于,所述特定生物分子为蛋白、抗原、肿瘤标志物、一段DNA,或RNA序列、多肽或肿瘤细胞。

9.  根据权利要求3所述利用DNA纳米折纸结构作为信号放大探针的检测分析方法,其特征在于,所述检测系统为蛋白质微阵?#34892;?#29255;、或基因芯片、或微流控蛋白?#24066;?#29255;、或酶联免疫吸附试验,方式为三明治法、或间接法、或竞争法。

10.  根据权利要求3所述根据权利要求3所述利用DNA纳米折纸结构作为信号放大探针的检测分析方法,其特征在于,所述纳米载体为纳米金、或纳米银、或磁性纳米粒子。

说明书

说明书利用DNA纳米折纸结构作为信号放大探针的检测方法
技术领域
本发明属于DNA纳米技术发展及应用领域,涉及一?#32440;?#29983;物素分子通过折纸方式?#24230;?#21040;DNA纳米结构上从而制备出信号放大探针,通过此探针与亲和素、链霉亲和素、或链霉亲和素标记的?#22791;?#36807;氧化酶的连接从而将此信号放大探针应用于生物检测领域中,从而实现抗原、抗体、蛋白质、DNA、RNA、多肽、细胞等目标物的高灵敏度检测的分析方法。
背景技术
癌症是导致人类死亡的主要疾病之一,我国的癌症发病?#39135;?#36880;年快速上升趋势。而多数肿瘤如果早期发现即有手术根治机会,因此提高肿瘤的早期检测水平是?#32435;?#30284;症临床疗效的关键之一,早发现、早诊断、早治疗成为当前癌症临床治疗的重要目标。在癌症初始阶段实现相关?#26800;?#30333;的痕量检测对于控制癌症恶化和有针对性治疗癌症无疑具有极为重要的意义。目前癌症的早期检测和筛查主要基于高特异性肿瘤标志物的血清学检测。然而,现有的血清学检测技术在灵敏度上存在明显的不足。因此,如何建立一种高灵敏度?#24535;?#36739;好特异性?#32435;?#29289;检测系统是目前分子诊断及癌症治疗等领域亟待解决?#32435;?#21629;科学问题。
新型的纳米材料以及结构的制备与应用不仅给纳米技术注入了新的活力,也给肿瘤早期诊断的研究及发展起?#21496;?#22823;的推动作用。目前利用纳米颗粒或纳米结构作为信号放大探针进行生物分子的高灵敏检测的研究已相当成熟,但尚未充分满足目前对于肿瘤早期诊断的检测限要求;近几年国际上基于DNA分子进行设计的纳米生物?#26149;?#32467;构,因其结构可控、且高效负载等优点而有望成为新一代的信号放大探针。在充分利用和发展纳米技术特有的优势的基础上,有望基于DNA纳米折纸结构制备高效及多功能的纳米生物?#26149;?#32467;构作为信号放大探针从而大大提升目前的肿瘤早期诊断水平,为抗肿瘤研究工作累计理论基础和实践经验。
发明内容
为克服现有技术的不足,本发明提供一种利用DNA纳米折纸结构作为信号放大探针的检测分析方法。
一种利用DNA纳米折纸结构作为信号放大探针的检测分析方法,其特征在于,将生物素分子通过折纸的过程?#24230;?#21040;DNA纳米结构上,所制备的产物为含有多生物素活性位点的DNA纳米结构,此结构可作为信号放大探针应用于生物检测领域中,从而实现抗原、抗体、蛋白质、DNA、RNA、多肽、细胞等目标物的高灵敏度检测。
所述的DNA纳米结构由DNA通过自组装、?#30001;臁?#25240;叠等技术构成的一类纳米结构,组成此结构的单链DNA,可经过如巯基、或生物素、或氨基修饰。
包括以下几个步骤:
(1)长链DNA溶液中,加入订书钉链DNA,混合均匀后由高温缓慢降至室温;
(2)向(1)步骤所得产物中,加入连接分子,混合均匀后水浴中连接;
(3)构建基于特定生物分子的检测系统;
(4)将(2)步骤所得产物应用到(3)步骤中的检测系统中;或通过纳米载体应用到(3)步骤中的检测系统中。
所述长链DNA为合成的长链DNA、或噬菌体M13、或经过滚环扩增技术所得的长单链DNA;所述订书钉链DNA,为多条能与长链DNA互补杂交的单链DNA,其中一条或多条为生物素修饰。
步骤(1)所述高温为95℃,室温为25℃,降温时间为12小?#24065;?#19978;。
所述连接分子为亲和素、或链霉亲和素 、或链霉亲和素标记的?#22791;?#36807;氧化物酶。 
所述与连接分子作用条件为25~37℃,水浴30分钟以上。
所述特定生物分子为蛋白、抗原、肿瘤标志物、一段DNA,或RNA序列、多肽或肿瘤细胞。
所述检测系统为蛋白质微阵?#34892;?#29255;、或基因芯片、或微流控蛋白?#24066;?#29255;、或酶联免疫吸附试验,方式为三明治法、或间接法、或竞争法。
所述纳米载体为纳米金、或纳米银、或磁性纳米粒子。
附图说明
图1 DNA纳米折纸结构负载链霉亲和素原子力显微镜下?#19978;?#32467;果;a箭头处为DNA纳米折纸结构;b箭头处为链霉亲和素。
具体实施方式
实施例1:
16μL引物DNA(1μM,序列为5’CCAGCCTAAGAGTTGAGCA3’)中依次加入12μL环DNA(2μM,序列为:5’TATGCCCAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGCACAATGGTCGGATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTCTCTGCCCTGACTTC3’),dNTPs (4 μL,10 mM), RCA buffer (4μL,10×), phi29 polymerase 4μL,10 U/μL),混合溶液终体积为40μL。然后30°C 水浴中扩增30 min。所得产物40μL 经过10%PAGE电泳,后割胶回收,去除小片段DNA及多余的环DNA及引物DNA。取回收所得产物3μL,加入milliQ水12μL,加入订书链1-3(100μM,序列依次为:
5’-CAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGTCTATGCC-3’
5’-CCCTGACTCACAATGGTCGGATTCCGTCTCTG-3’-生物素(biotin)标记
5’-TCTCAACTTCAACTCGTATTCTCAACTCGTAT-3’)各1μL,2μL TAE 缓冲?#28023;?0?#31890;?25mM Mg2+),总体积为20μL,溶液充?#21482;?#21512;均匀后置入高温 95°C后梯度降温至25°C。产物稀释到80 μLMilli-Q 水中,加入2μL10mM 链霉亲和素,37°C1h后,8000rpm离心5min后,去上清,加入100μLMilli-Q 水。取5μL滴到平整清洁云母表面,吸附3min后,Milli-Q滴流冲洗,原子力显微镜Tapping-mode?#19978;瘛?
实施例2:
16μL引物DNA(1μM,序列为5’CCAGCCTAAGAGTTGAGCA3’)中依次加入12μL环DNA(2μM,序列为:5’TATGCCCAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGCACAATGGTCGGATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTCTCTGCCCTGACTTC3’),dNTPs (4 μL,10 mM), RCA buffer (4μL,10×), phi29 polymerase 4μL,10 U/μL),混合溶液终体积为40μL。然后30°C 水浴中扩增30 min。所得产物40μL 经过10%PAGE电泳,后割胶回收,去除小片段DNA及多余的环DNA及引物DNA。取回收所得产物3μL,加入milliQ水12μL,加入订书链1-3(100μM,序列依次为:
5’-CAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGTCTATGCC-3’
5’-CCCTGACTCACAATGGTCGGATTCCGTCTCTG-3’-生物素(biotin)标记
5’-TCTCAACTTCAACTCGTATTCTCAACTCGTAT-3’)各1μL,2μL TAE 缓冲?#28023;?0?#31890;?25mM Mg2+),总体积为20μL,溶液充?#21482;?#21512;均匀后置入高温 95°C后梯度降温至25°C。产物稀释到80 μLMilli-Q 水中,加入2μL10mM 链霉亲和素-量子点,37°C1h后,8000rpm离心5min后,去上清,加入20μLMilli-Q 水。
  利用点样仪将10μL 1μg/mL AFP抗原固定在醛基化玻片表面,4°C环境下过夜后PBST洗涤三次,加入20μL 100μg/mL生物素标记的AFP抗体37°C孵育1h后,PBST洗涤并加入20μL上述制备的信号放大载体,37°C孵育1h,PBST洗涤后,荧光显微镜下检测。
实施例3:
16μL引物DNA(1μM,序列为5’CCAGCCTAAGAGTTGAGCA3’)中依次加入12μL环DNA(2μM,序列为:5’TATGCCCAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGCACAATGGTCGGATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTCTCTGCCCTGACTTC3’),dNTPs (4 μL,10 mM), RCA buffer (4μL,10×), phi29 polymerase 4μL,10 U/μL),混合溶液终体积为40μL。然后30°C 水浴中扩增30 min。所得产物40μL 经过10%PAGE电泳,后割胶回收,去除小片段DNA及多余的环DNA及引物DNA。取回收所得产物3μL,加入milliQ水12μL,加入订书链1-3(100μM,序列依次为:
5’-CAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGTCTATGCC-3’
5’-CCCTGACTCACAATGGTCGGATTCCGTCTCTG-3’-生物素(biotin)标记
5’-TCTCAACTTCAACTCGTATTCTCAACTCGTAT-3’)各1μL,2μL TAE 缓冲?#28023;?0?#31890;?25mM Mg2+),总体积为20μL,溶液充?#21482;?#21512;均匀后置入高温 95°C后梯度降温至25°C。产物稀释到80 μLMilli-Q 水中,加入2μL10mM 链霉亲和素-HRP,37°C1h后,8000rpm离心5min后,去上清,加入20μLMilli-Q 水。
将1μg/mL AFP抗原固定96?#35013;?#34920;面,4°C环境下过夜后PBST洗涤三次,加入50μL 100μg/mL生物素标记的AFP抗体37°C孵育1h后,洗涤并加入50μL上述制备的信号放大载体,37°C孵育1h,PBST洗涤后,加入100μL TMB溶?#28023;?#22235;甲基联苯胺),充分显色后,利用酶标仪检测。
实施例4:
16μL引物DNA(1μM,序列为5’CCAGCCTAAGAGTTGAGCA3’)中依次加入12μL环DNA(2μM,序列为:5’TATGCCCAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGCACAATGGTCGGATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTCTCTGCCCTGACTTC3’),dNTPs (4 μL,10 mM), RCA buffer (4μL,10×), phi29 polymerase 4μL,10 U/μL),混合溶液终体积为40μL。然后30°C 水浴中扩增30 min。所得产物40μL 经过10%PAGE电泳,后割胶回收,去除小片段DNA及多余的环DNA及引物DNA。取回收所得产物3μL,加入milliQ水12μL,加入订书链1-3(100μM,序列依次为:
5’-CAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGTCTATGCC-3’
5’-CCCTGACTCACAATGGTCGGATTCCGTCTCTG-3’-生物素(biotin)标记
5’-TCTCAACTTCAACTCGTATTCTCAACTCGTAT-3’)各1μL,2μL TAE 缓冲?#28023;?0?#31890;?25mM Mg2+),总体积为20μL,溶液充?#21482;?#21512;均匀后置入高温 95°C后梯度降温至25°C。产物稀释到80 μLMilli-Q 水中,加入2μL10mM 链霉亲和素-HRP,37°C1h后,8000rpm离心5min后,去上清,加入20μLMilli-Q 水。
将20μL 100μg/mL AFP抗体加入到20μL 1mg/mL的醛基化磁珠中37°C孵育1h,PBST洗涤三次后,加入10μL 1μg/mL AFP抗原,37°C反应1h,洗涤后加入生物素化的AFP抗体,连接后洗涤并加入20μL上述制备的信号放大载体,37°C孵育1h,洗涤后,加入100μL TMB溶?#28023;?#22235;甲基联苯胺),充分显色后,利用酶标仪检测。
实施例5:
16μL引物DNA(1μM,序列为5’CCAGCCTAAGAGTTGAGCA3’)中依次加入12μL环DNA(2μM,序列为:5’TATGCCCAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGCACAATGGTCGGATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTCTCTGCCCTGACTTC3’),dNTPs (4 μL,10 mM), RCA buffer (4μL,10×), phi29 polymerase 4μL,10 U/μL),混合溶液终体积为40μL。然后30°C 水浴中扩增30 min。所得产物40μL 经过10%PAGE电泳,后割胶回收,去除小片段DNA及多余的环DNA及引物DNA。取回收所得产物3μL,加入milliQ水12μL,加入订书链1-3(100μM,序列依次为:
5’-CAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGTCTATGCC-3’
5’-CCCTGACTCACAATGGTCGGATTCCGTCTCTG-3’-生物素(biotin)标记
5’-TCTCAACTTCAACTCGTATTCTCAACTCGTAT-3’)各1μL,2μL TAE 缓冲?#28023;?0?#31890;?25mM Mg2+),总体积为20μL,溶液充?#21482;?#21512;均匀后置入高温 95°C后梯度降温至25°C。产物稀释到80 μLMilli-Q 水中,加入2μL10mM 链霉亲和素-HRP,37°C1h后,8000rpm离心5min后,去上清,加入20μLMilli-Q 水。
  将20μL 1mg/mL AFP抗体加入到1mL 3nM的纳米金中37°C孵育1h,离心洗涤三次后,加入10μL 1μg/mL AFP抗原,37°C反应1h,洗涤后加入20μL 1mg/mL生物素化的AFP抗体,连接后离心洗涤并加入20μL上述制备的信号放大载体,37°C孵育1h,洗涤后,加入100μL TMB溶?#28023;?#22235;甲基联苯胺),充分显色后,利用酶标仪检测。
实施例6:
16μL引物DNA(1μM,序列为5’CCAGCCTAAGAGTTGAGCA3’)中依次加入12μL环DNA(2μM,序列为:5’TATGCCCAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGCACAATGGTCGGATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTCTCTGCCCTGACTTC3’),dNTPs (4 μL,10 mM), RCA buffer (4μL,10×), phi29 polymerase 4μL,10 U/μL),混合溶液终体积为40μL。然后30°C 水浴中扩增30 min。所得产物40μL 经过10%PAGE电泳,后割胶回收,去除小片段DNA及多余的环DNA及引物DNA。取回收所得产物3μL,加入milliQ水12μL,加入订书链1-3(100μM,序列依次为:
5’-CAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGTCTATGCC-3’
5’-CCCTGACTCACAATGGTCGGATTCCGTCTCTG-3’-生物素(biotin)标记
5’-TCTCAACTTCAACTCGTATTCTCAACTCGTAT-3’)各1μL,2μL TAE 缓冲?#28023;?0?#31890;?25mM Mg2+),总体积为20μL,溶液充?#21482;?#21512;均匀后置入高温 95°C后梯度降温至25°C。产物稀释到80 μLMilli-Q 水中,加入2μL10mM 链霉亲和素-HRP,37°C1h后,8000rpm离心5min后,去上清,加入20μLMilli-Q 水。
将20μL 1mg/mL CEA抗体加入到1mL 3nM的纳米金中37°C孵育1h,离心洗涤三次后,加入10μL 1μg/mL CEA抗原,37°C反应1h,洗涤后加入20μL 1mg/mL生物素化的CEA抗体,连接后离心洗涤并加入20μL上述制备的信号放大载体,37°C孵育1h,洗涤后,加入100μL TMB溶?#28023;?#22235;甲基联苯胺),充分显色后,利用酶标仪检测。

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