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一种杂交瘤细胞株11A2及其应用.pdf

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一种 杂交瘤 细胞株 11 A2 及其 应用
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摘要
申请专利号:

CN201410232584.5

申请日:

2014.05.29

公开号:

CN104130978A

公开日:

2014.11.05

当前法律状态:

授权

有效性:

有权

法?#19978;?#24773;: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):C12N 5/20申请日:20140529|||公开
IPC分类号: C12N5/20; C07K16/18; G01N33/68; G01N33/577; C07K14/765; C07K1/22 主分类号: C12N5/20
申请人: 齐智
发明人: 齐智; 史洁; 齐晓龙; 康延申; 松井彦明; 陈仙子; 牛德云
地址: 710016 陕西省西安市经开区凤城一路388号富?#36153;?#20809;小区3号楼1单元303室
优?#28909;ǎ?/td>
专利代理机构: 代理人:
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法律状态
申请(专利)号:

CN201410232584.5

授权公告号:

||||||

法律状态公告日:

2016.11.23|||2014.12.10|||2014.11.05

法律状态类型:

授权|||实质审查的生效|||公开

摘要

本发明涉及一种杂交瘤细胞株11A2及其应用。该杂交瘤细胞株11A2能够产生抗人血清白蛋白(humanserumalbumin,HSA)的单克隆抗体。其特征在于,其保藏编号为CGMCC?NO.9243。本发明的优点在于:杂交瘤细胞株11A2能够特异性的产生抗HSA的单克隆抗体,该抗体对抗原HSA具有超高的灵敏度和超强的特异性,可?#28304;?#21040;0.0012pg/ml(1.2fg/ml)的水平。利用本发明获得的细胞株11A2所产生的单克隆抗体,可用于人极微量白蛋白的检测、药物中残留人白蛋白的检测和纯化白蛋白等多种用途,具有很好的应用价值。

权利要求书

权利要求书
1.  一种杂交瘤细胞株11A2,其特征在于:在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)保藏,其保藏编号为CGMCC NO.9243。

2.  根据权利要求1所述的杂交瘤细胞株11A2,其制备方法的特征在于,按如下步骤获得:
① 用抗原人血清白蛋白(human serum albumin, HSA)免疫小鼠;
② 收集免疫小鼠的脾细胞,并与Sp2/0骨髓瘤细胞进行融合,用HAT培养基进行选择性培养;
③ 用HSA抗原包被ELISA平板,采用间接ELISA方法对杂交瘤细胞培养上清?#26800;?#25239;体含量进行检测,筛选获得一株稳定分泌抗HSA单克隆抗体的杂交瘤细胞株11A2。

3.  根据权利要求1所述的一种杂交瘤细胞株11A2产生的单克隆抗体,其特征在于所述的单克隆抗体与HSA发生抗原抗体反应,属IgG1亚型抗体。

4.  根据权利要求1所述的一种杂交瘤细胞株11A2的应用,其特征在于,杂交瘤细胞株11A2产生的单克隆抗体具有多种的应用。

5.  根据权利要求4所述的一种杂交瘤细胞株11A2的应用,其特征在于,杂交瘤细胞株11A2产生的单克隆抗体用于极微量或残留量白蛋白的检测。

6.  根据权利要求5所述的一种杂交瘤细胞株11A2的应用,其特征在于,将杂交瘤细胞株11A2产生的单克隆抗体用于极微量或残留量的白蛋白ELISA检测试剂?#23567;?BR>
7.  根据权利要求4所述的一种杂交瘤细胞株11A2的应用,其特征在于,将杂交瘤细胞株11A2产生的单克隆抗体用于纯化HSA。

8.  根据权利要求7所述的一种杂交瘤细胞株11A2的应用,其特征在于,将杂交瘤细胞株11A2产生的单克隆抗体制成用于纯化HSA的免疫亲和柱。

9.  根据权利要求1所述的一种杂交瘤细胞株11A2产生的单克隆抗体,可应用于工业化生产。

说明书

说明书一种杂交瘤细胞株11A2及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域。涉及一种杂交瘤细胞株及其应用,该杂交瘤细胞能够产生抗人白蛋白的单克隆抗体。
背景技术
人血清白蛋白(human serum albumin, HSA)是人体血液中最为重要的成份,含量达到42 g/L的水平。其主要功能是维持血液渗透压的平衡、运输人体营养物?#30465;?#20445;持细胞中内含物的稳定性等多种功能。人白蛋?#36164;?#19968;种血液?#26800;?#27491;常蛋白质,但在生理条件下尿液中仅出现极少量白蛋白。微量白蛋白尿反?#25104;?#33039;异常渗漏蛋白?#30465;?#23615;微量白蛋白作为糖尿病、肾病、心血管疾病等慢性病的早期诊?#29616;?#26631;,对尿中白蛋白定量检测具有重要的临床意义。因此,建立特异、灵敏的检测尿微量白蛋白的方法具有重要的应用价值,而该方法的关键在于抗白蛋白单克隆抗体的灵敏度和特异性,即白蛋白单克隆抗体的对抗原白蛋白特异性的高低,?#36884;?#23450;了检测尿中白蛋白的灵敏度和特异性,在临床上决定了是否能及早地发现病人代谢白蛋白出现异常,从而推测病人是否患有糖尿病、肾病、心脑血管等慢性病,这?#26434;?#21450;早发现病情,及早治疗具有重要的临床意义。
目前,用于检测尿中白蛋白含量的方法主要是酶联免疫吸附实验(ELISA),该方法检测白蛋白要比溴甲酚紫(BCP)法和溴甲酚绿(BCG)(这两种方法的灵敏度为1μg/ml)、蛋白质电泳法(0.5 μg/ml)的灵敏度和特异性要高的多,是目前检测尿中白蛋白早期诊断的主要方法。据报道,专利ZL2009201520440所述的一种人极微量白蛋白ELISA检测试剂盒,其灵敏度可?#28304;?#21040;0.15 ng/ml的水平。目前开发出的ELISA检测试剂盒中,最为灵敏的检测白蛋白的试剂盒是美国Cloud-Clone Corp公司生产的高敏人血清白蛋白检测试剂盒(货号HEB028Hu),其灵敏度可?#28304;?#21040;0.048 ng/ml(48 pg/ml)的水平。因此,美国Cloud-Clone Corp公司开发的检测微量人白蛋?#36164;?#21058;盒灵敏度是专利ZL2009201520440试剂?#26800;?.13倍,这?#26434;?#23615;中微量白蛋白的检测水平明显的提高了一个台阶。但是,在临床上,检测白蛋白灵敏度在pg?#31471;?#24179;(48 pg/ml)仍然?#24310;?#36798;到一些慢性疾病的早期检测要求,如妊娠子痫前期、2型糖尿病等疾病。在一些药物中,如人的细胞因子中残留的白蛋白的检测,要求其检测试剂盒具有更高的灵敏度。因此,开发出更为灵敏的白蛋白检测试剂盒具有重要的临?#24067;?#20540;。而解决这一问题最佳的途径,就是通过高灵敏度白蛋白单克隆抗体的开发,以提高检测白蛋白灵敏度。
另一方面,由于人白蛋白在临床上可以治疗休克、烧伤、创伤、低蛋白血症、急性血容量减少、癌症化?#21860;?#33145;水、癌症晚期及提高老龄人的机体免疫力等多种疾病。因此,人白蛋?#36164;?#29992;量越来越大,每针剂?#23458;?#24120;达10g或者25g,而大多数蛋白?#23460;?#29289;,如细胞因子、激素的剂量仅为μg或ng级,因此相对其他蛋白药物来说,人白蛋白的纯度要求更为?#32454;瘛?#21033;用抗体、抗原具有特异性识别的特点而进?#26800;?#20146;和层析技术,不仅可?#28304;?#24133;度的简化蛋白质的纯化步骤,而且纯化的效率更高,蛋白质的纯度更高,成本更低,这?#26434;?#20020;床病人用药的安全性和经济性具有重要的实用意义。
本发明的目的在于:提供一种能产生与人白蛋白(HSA)发生抗原抗体反应的单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用,其特征在于,该杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体要对抗原HSA具有超高的灵敏度和超强的特异性。
本发明的目的是这样实现的:一种杂交瘤细胞株11A2,其特征在于:在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)保藏,其保藏编号为CGMCC NO. 9243。保藏日期为2014年5月28日,保藏地址为?#26412;?#24066;朝阳区?#32972;?#35199;路1号院3号中国科学院微生物研?#20811;?
本发明中,一种杂交瘤细胞株的制备方法,其特征如?#28388;?#36848;。
① 将免疫抗原HSA与弗氏完全佐剂等体积混合并充分乳化,?#39592;?#27880;射Bal B/c小鼠,每次注射体积为0.2ml,蛋白质用量为50 μg/只,对小鼠实施基础免疫。
② 将免疫抗原HSA与弗氏不完全佐剂等体积混合并充分乳化,每隔2周?#39592;?#27880;射1次,重复4次,每次注射体积为0.2 ml,HSA用量为40 μg/只。将免疫原HSA与浓度为0.9%的生理盐水混合,在进行细胞融合前3天,对小鼠进行加强免疫,?#39592;?#27880;射,HSA用量为100 μg/只。
③ 按常规技术收集免疫小鼠的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞按6:1的比例,用PEG3350进行融合;用HAT培养液选择培养。融合后7-14天,取细胞培养上清,采用间接ELISA方法筛选分泌抗HSA的杂交瘤细胞株,?#36816;?#24471;阳性克隆株采用有限稀释法进行亚克隆。
④ 重复进行6次亚克隆和间接ELISA筛选,得到一株分泌HSA单克隆抗体的杂交瘤细胞株11A2。
本发明中,一种杂交瘤细胞株11A2产生的单克隆抗体,其特征在于是通过如下方法获得的。
① 通过细胞培养液获得:将杂交瘤细胞株11A2按1×106接种量接种到6 ml含20%胎牛血清的RPMI-1640培养基中,在37oC含5% CO2的细胞培养箱中培养3-5天,然后将细胞培养液在500×g离心5?#31181;櫻?#25910;集上清液,通过ProteinA或ProteinG亲和层析纯化,获得单克隆抗体。
② 通过动物腹水获得:将Bal B/c小鼠?#39592;?#27880;射0.5 ml石蜡油,7-14天后,每只小鼠?#39592;?#27880;射上述①所得的细胞1-2×106个,待小鼠?#20849;?#26126;显膨大后抽取腹水,在4oC下,8000×g离心20?#31181;櫻?#25910;集上清,通过ProteinA或ProteinG亲和层析纯化,获得单克隆抗体。
本发明中,一种杂交瘤细胞株11A2产生的单克隆抗体,其特征在于是通过如下方法进行鉴定抗体亚型的。
① 抗体纯度鉴定:将单抗用12% SDS-PAGE电泳进行纯度鉴定,如图1所示。通过Quantity-One(版本4.62)软件计算,抗体纯度为95%。
② 抗体亚?#22270;?#23450;:采用小鼠抗体分型试剂盒(Sigma公司生产)鉴定抗体亚型,测定结果表明,抗体亚型为IgG1 ?#24066;汀?
本发明中,一种杂交瘤细胞株11A2的应用,其特征在于,将杂交瘤细胞株11A2产生的单克隆抗体对HSA具有超高的灵敏度和超强的特异性。采用抗原HSA直接包被96孔板(Corning公司生产),直接ELISA法测定杂交瘤细胞11A2产生的单克隆抗体(mAb 11A2)特异性的识别能力。具体叙述如下。
用不同浓度的HSA直接包被96孔ELISA检测板,检测中设有空白对照、阴性对照和阳性对照。用3%脱脂奶粉(Non-fat milk)封闭检测板,?#26469;?#21152;入mAb 11A2抗体、生物素标记的羊抗鼠抗体(Biotin-Goat anti-mouse IgG1)、链?#39592;?#21644;素标记?#22791;?#36807;氧化物酶(Avidin-HRP)。然后加入TMB显色液后,用硫酸终止反应,最后在酶标仪450nm比色。结果表明(图2),杂交瘤细胞11A2产生的单克隆抗体(mAb 11A2)对抗原HSA识别的灵敏度和特异性可?#28304;?#21040;0.0012 pg/ml(1.2 fg/ml HSA)的水平,而与牛血清白蛋白(BSA)没有任何反应。可见,mAb 11A2识别HSA具有超高的灵敏度和超强的特异性。
杂交瘤细胞11A2细胞产生的单克隆抗体(mAb 11A2)对HSA特异性的识别能力和超高的灵敏度,具有多种应用,如?#28388;?#36848;。
① 用于极微量或残留人白蛋白的检测。
用商业化的人白蛋白单克隆抗体1(Sigma公司生产)包被96孔ELISA检测板,用3%脱脂奶粉(Non-fat milk)封闭检测板,然后加入待检测的样品,如人尿液(含极微量人白蛋白)或人细胞因子溶液(含残留人白蛋白)。检测中设有空白对照,即用PBS代替HSA;设有阴性对照,即用小牛血清白蛋白(BSA),浓度为50 mg/ml。用商业化的人血清白蛋白单克隆抗体2(Sigma公司生产)为阳性对照。?#26469;?#21152;入mAb 11A2抗体、生物素标记的羊抗鼠抗体(Biotin-Goat anti-mouse IgG1)、链?#39592;?#21644;素标记?#22791;?#36807;氧化物酶(Avidin-HRP)。加入TMB显色液后,用硫酸终止反应,最后在酶标仪450nm比色。同?#20445;?#22312;96孔板中,建立不同浓度的HSA,制作人白蛋白浓度标?#35760;?#32447;。
结果表明,杂交瘤细胞11A2产生的单克隆抗体(mAb 11A2)用于ELISA试剂?#26800;?#26816;测,可以检测到稀释后的尿液HSA的含量为1.4 fg/ml,人细胞因子溶液中HSA的残留量为2.6 fg/ml。
② 用于免疫亲和层析:用杂交瘤细胞株11A2产生的单克隆抗体(mAb 11A2,纯度为95%),与活化的基质或微珠交联后,制备抗体亲和层析柱。然后,将含HSA的样品加入层析柱上,弃掉流穿液和清洗液,最后把目的蛋白质,即与单克隆抗体具有高度特异性的HSA从层析柱上洗脱下来,达到纯化HSA的目的。结果发现,用mAb 11A2抗体免疫亲和层析,HSA的收率为95%,纯度为99%。与其他纯化方法相比,免疫亲和层析纯化HSA的效?#23460;?#27604;阳离子交换层析、阴离子交换层析和疏水层析三者之和(HSA的收率为72%,纯度为94%)还要高,因为以上三者都是非特异性的,而抗体抗原亲和层析,是特异性的。
综合上述,本发明的优点在于,本发明所获得的一种杂交瘤细胞株11A2能够特异性的分泌针对HSA的单克隆抗体,对HSA具有超高的灵敏度和超强的特异性。
本发明的优点还在于,利用本发明所获得的细胞株所产生的单克隆抗体,具有多种用途,对实际生产和临床应用上具有非常好的价值。
附图说明
图1:杂交瘤细胞株11A2产生的特异性单克隆抗体纯化后的SDS-PAGE电泳图。1表?#38236;?#20998;子?#24247;?#30333;质标准;2为单克隆抗体(不加还原剂DTT,也不加热煮沸);3为单克隆抗体在还原剂DTT的存在下,煮沸10?#31181;?#21518;,单克隆抗体分成了两个大小的片段。
图2:ELISA检测杂交瘤细胞11A2产生的单克隆抗体对抗原HSA的灵敏度和特异性实验。图中横坐标表示不同的浓度的HSA。其中,1是阳性对照;2是阴性对照;3?#24378;?#30333;对照。4-12表示不同浓度的HSA:4是1 ng/ml;5是100 pg/ml;6是10 pg/ml;7是1 pg/ml;8是100 fg/ml;9是10 fg/ml;10是1 fg/ml;11是0.1 fg/ml和12是0.01 fg/ml。
具体实施方式
实施例1  杂交瘤细胞株的建立。
一、材料与试剂。
1、材料:Bal B/c小鼠,6-8周龄,雌性。购自?#26412;?#21307;科大学动物中心。Sp2/0-Ag14骨髓瘤细胞购自美国ATCC。人血清白蛋白(HSA,用做免疫原)购自Sigma公司。
2、试剂:RPMI-1640、胎牛血清、双抗(青霉素和链霉素)、HAT和HT培养液购自Invitrogen公司。弗氏完全、不完全佐剂、石油?#36873;EG3350、HRP-羊抗鼠抗体购自Sigma公司。其他试剂为分析纯,均购自国药集团公司。
二、杂交瘤细胞株的建立。
1、动物免疫:基础免疫是将免疫原HSA与弗氏完全佐剂等体积混合并充分乳化,?#39592;?#27880;射Bal B/c小鼠。每只每次注射体积为0.2 ml,HSA的用量为50 μg/只。加强免疫是将免疫抗原HSA与弗氏不完全佐剂等体积混合并充分乳化,每隔2周?#39592;?#27880;射1次,重复4次,每次注射体积为0.2 ml,HSA用量为40 μg/只。将免疫原HSA与浓度为0.9%的生理盐水混合,在进行细胞融合前3天,对小鼠进行加强免疫,?#39592;?#27880;射,HSA用量为100 μg/只。
2、杂交瘤细胞的制备。
① Sp2/0骨髓瘤细胞的准备:选择生长状态良好的细胞,浑圆透亮,排列整齐,呈半致密分布。用培养?#21512;?#28068;一次后,用10 ml培养液将Sp2/0骨髓瘤细胞轻轻吹下。
② 脾细胞的准备:取加强免疫后3天的小鼠,摘除眼球采血供分离阳性血清。颈?#30416;?#23558;小鼠?#28388;潰?#29992;75%酒精消毒小鼠体表5?#31181;櫻?#38543;即放入超净台内小鼠解剖板上,左侧卧位,用7号针头固定四肢。无菌打开?#39592;?#21462;出脾脏,用DMEM培养?#21512;?#28068;,并仔细去掉周围附着的结缔组织。随后将脾脏转移到另一个盛有DMEM培养液的平皿?#23567;?#20197;弯头针?#36153;?#20303;脾脏,用小针头在脾脏上插孔,并用镊子?#36153;梗?#20351;脾细胞充分释?#29275;?#21046;成脾细胞悬液。
③ 饲养细胞的制备:取一只健康的小鼠,摘眼球采血,颈脱臼处死,体表消毒和固定后,从大腿上剪开皮肤,暴露腹膜,酒精棉球消毒腹膜。用10 ml注射器,12号针头,注射5-10 ml HAT培养基到?#39592;唬?#21491;手固定注射器,左手持酒精棉球轻轻按摩?#20849;浚?#25277;回?#39592;?#20869;液体,注入已准备好的容器?#23567;?
④ 细胞融合:将上述制备的Sp2/0骨髓瘤细胞与脾细胞混合于一支50 ml的带盖的无菌离心管中,500×g离心5?#31181;櫻?#19978;清要充分吸净,以免影响PEG3350的作用。将融合管置于?#32456;?#20013;,轻轻振?#21561;?#37096;,使两种细胞充?#21482;煸取?#29992;1 ml吸管将预热的PEG3350在60秒内缓慢加到融合管中,轻轻摇匀,立即滴加37oC预热的DMEM,使PEG3350失去作用。加入5 ml的HAT培养基,轻轻悬浮沉淀细胞,再加入适量的?#39592;?#24040;噬细胞,最后补加HAT至50 ml。分装于96孔细胞培养板,然后将培养板置37oC,5% CO2细胞培养箱内培养。5天后用HAT培养基换出一半培养基。融合后7-14天,观察杂交瘤细胞的生长情况,待其细胞培养上清变黄或克隆分布?#37327;?#24213;面积的1/10以上?#20445;?#21560;取适量细胞上清,采用间接ELISA法筛选分泌抗HSA的杂交瘤细胞株,?#36816;?#24471;阳性克隆株采用有限稀释法进行亚克隆。
⑤ 杂交瘤细胞株的筛选:经过上述6次亚克隆和间接ELISA筛选,得到一株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为11A2,并于2014年5月28日在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)保藏,其保藏编号为CGMCC NO. 9243。保藏地址为?#26412;?#24066;朝阳区?#32972;?#35199;路1号院3号中国科学院微生物研?#20811;?
三、杂交瘤细胞株11A2产生的单克隆抗体的效价测定。
将11A2细胞在含20%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养传代,每3天传代一次,传代到20代后进?#26800;?#20811;隆抗体测定。
① 细胞培养液上清效价测定:将20代细胞按1×106接种量接种到6 ml含20%胎牛血清的RPMI-1640培养基中,在37oC含5% CO2细胞培养箱中培养3-5天,然后将细胞培养液在500×g离心5?#31181;櫻?#25910;集上清,用间接ELISA法测定细胞上清液?#26800;?#20811;隆抗体效价,结果表明上清效价为1:10,000-1:80,000。
② 小鼠腹水效价测定:将Bal B/c小鼠?#39592;?#27880;射0.5 ml石蜡油,7-14天后,每只小鼠?#39592;?#27880;射上述①所得的细胞1-2×106个,待小鼠?#20849;?#26126;显膨大后抽取腹水,在4oC下,8000×g离心20?#31181;櫻?#25910;集上清液。用间接ELISA法测定上清?#26800;?#20811;隆抗体,效价为1:1×105-1:4×105。
四、杂交瘤细胞株的传代培养。
将细胞株11A2在含有20%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养传代,每3天传代一次,传代到90代后,细胞株11A2仍然能生长良好、稳定传代,培养液上清效价仍然可?#28304;?#21040;1:10,000-1:80,000的水平。可见,本发明所得的细胞株11A2能够稳定传代,可以持续、稳定产生抗HSA的单克隆抗体。
实施例2  应用细胞株11A2制备抗HSA的单克隆抗体。
一、单克隆抗体的制备。
将Bal B/c小鼠?#39592;?#27880;射0.5 ml石蜡油,7-14天后,每只小鼠?#39592;?#27880;射1-2×106个杂交瘤11A2细胞,待小鼠?#20849;?#26126;显膨大后抽取腹水,在4oC下,8000×g离心20?#31181;櫻?#25910;集上清。然后,用nProteinA Sepharose 4 Fast Flow填料(GE Healthcare公司生产)纯化腹水上清。弃掉流穿液和冲洗液,然后用甘氨酸-HCl,pH3.0洗脱?#21512;賜选?#25910;集洗脱液,用Tris-HCl,1M,pH9.0缓冲液中和至pH7.0,最后得到抗HSA的单克隆抗体(mAb 11A2)。
二、单克隆抗体mAb 11A2的鉴定。
1、抗体纯度鉴定:用12%SDS-PAGE电泳鉴定mAb 11A2的纯度。电泳图如图1所示,1表?#38236;?#20998;子?#24247;?#30333;质标准;2为单克隆抗体(不加还原剂DTT,也不加热煮沸);3为单克隆抗体在还原剂DTT的存在下,煮沸10?#31181;?#21518;,单克隆抗体分成了两个大小的片段。电泳凝胶照片通过Quantity-One(版本4.62;BioRad公司)软件计算,单克隆抗体mAb 11A2的纯度为95%。
2、抗体亚?#22270;?#23450;:采用小鼠抗体分型试剂盒(Sigma公司生产)鉴定抗体亚型,具体操作参照厂家提供的说明书进?#23567;?#27979;定结果表明,抗体亚型为IgG1 ?#24066;汀?
3、抗体与抗原的灵敏度和特异性鉴定:采用抗原HSA直接包被96孔板(Corning公司生产),直接ELISA法测定单克隆抗体mAb 11A2特异性的识别能力。本实验重复3次,每个样品有3个?#32431;住?#20855;体方法如?#28388;?#36848;。
① 用HSA直接包被96孔板,浓度?#26469;?#20026;1 ng/ml,100 pg/ml,10 pg/ml,1 pg/ml,100 fg/ml,10 fg/ml,1 fg/ml、0.1 fg/ml和0.01 fg/ml。检测中设有空白对照,即用PBS代替HSA;设有阴性对照,即用小牛血清白蛋白(BSA),浓度为50 mg/ml。用商业化的人血清白蛋白单克隆抗体(Sigma公司生产)为阳性对照。4oC包被过夜。
② 用3%脱脂奶粉(Non-fat milk)于37oC封闭60?#31181;印?#29992;TBS缓冲?#21512;?#26495;3次。加入浓度为0.5 μg/ml的mAb 11A2抗体,在37oC培养60?#31181;櫻?#29992;TBS缓冲?#21512;?#26495;3次,在吸水纸上用力拍打,充分除去残留的缓冲液。然后,加入生物素标记的羊抗鼠抗体(Biotin-Goat anti-mouse IgG1,1:50,000稀释),在37oC培养60?#31181;櫻?#29992;TBS缓冲?#21512;?#26495;6次,在吸水纸上用力拍打,充分除去残留的缓冲液。再加入链?#39592;?#21644;素标记?#22791;?#36807;氧化物酶(Avidin-HRP, 1:5,000稀释),在37oC培养60?#31181;櫻?#29992;TBS缓冲?#21512;?#26495;6次,在吸水纸上用力拍打,充分除去残留的缓冲液。
③ 加入100 μl TMB显色,用1 N硫酸终止反应,最后在酶标仪450 nm比色。
结果判断标准采用:P/N值(阳性孔OD值/阴性孔OD值)大于2.1为阳性;P/N?#26723;?#20110;或小于2.1为阴性。
根据以上结果判断的标准和进一步数据分析显示(图2),杂交瘤细胞11A2产生的单克隆抗体(mAb 11A2)对抗原HSA识别的灵敏度和特异性可?#28304;?#21040;0.0012 pg/ml(1.2 fg/ml HSA)的水平,而与BSA没有任何反应。由此可见,mAb 11A2识别HSA具有超高的灵敏度和超强的特异性。
实施例3  细胞株11A2产生的单克隆抗体用于人白蛋白检测试剂?#23567;?
由于本发明基于所述的细胞株11A2产生的单克隆抗体(mAb 11A2)对抗原HSA具有超高灵敏度和超强的特异性,可?#26434;?#29992;于检测极其微量或残留的HSA的含量。具体方法叙述如下。
1、检测试剂?#26800;?#35797;剂。
① 包被抗体:商业化的人血清白蛋白(HSA)单克隆抗体1和2(Sigma公司生产),抗体浓度为1 μg/ml。
② 检测样品:人尿样(微量HSA)或人细胞因子溶液(残留HSA)。
③ 检测抗体:本发明所述的一种mAb 11A2单克隆抗体,浓度为0.5 μg/ml。
④ 底物:四甲基联苯胺(TMB):100 ml/瓶。
⑤ 封闭液:3%脱脂奶粉。
⑥ TBS缓冲液:Tween-20为0.05%,Na2HPO4和NaH2PO4缓冲液,pH7.4, 20 mM。
⑦ 生物素标记的羊抗鼠抗体(Biotin-Goat anti-mouse IgG1):1:50,000稀释。Thermo Fisher公司生产。
⑧ 链?#39592;?#21644;素标记?#22791;?#36807;氧化物酶(Avidin-HRP):1:5,000稀释。Thermo Fisher公司生产。
2、检测试剂?#26800;?#26816;测方法。
① 用商业化的人血清白蛋白单克隆抗体1(Sigma公司生产)包被96孔板(Corning公司生产)。4oC包被过夜。
② 用3%脱脂奶粉(Non-fat milk)于37oC封闭60?#31181;印?#29992;TBS缓冲?#21512;?#26495;3次。
③ 加入待检测的样品,人尿液用0.9%生理盐水稀释或人细胞因子溶液,上样量为100 μl。同?#20445;?#29992;不同浓度的HSA做蛋白质标?#35760;?#32447;,分别是1 ng/ml,100 pg/ml,10 pg/ml,1 pg/ml,100 fg/ml,10 fg/ml,1 fg/ml、0.1 fg/ml和0.01 fg/ml。检测中空白对照:用PBS代替HSA;阴性对照:用小牛血清白蛋白(BSA),浓度为50 mg/ml;阳性对照:商业化的人血清白蛋白单克隆抗体2(Sigma公司生产)。37oC培养60?#31181;櫻?#29992;TBS缓冲?#21512;?#26495;3次,在吸水纸上用力拍打,充分除去残留的缓冲液。
④ 加入浓度为0.5 μg/ml的mAb 11A2抗体在37oC培养60?#31181;櫻?#29992;TBS缓冲?#21512;?#26495;3次,在吸水纸上用力拍打,充分除去残留的缓冲液。
⑤ 加入生物素标记的羊抗鼠抗体,在37oC培养60?#31181;櫻?#29992;TBS缓冲?#21512;?#26495;6次,在吸水纸上用力拍打,充分除去残留的缓冲液。
⑥ 加入链?#39592;?#21644;素标记?#22791;?#36807;氧化物酶(Avidin-HRP),在37oC培养60?#31181;櫻?#29992;TBS缓冲?#21512;?#26495;6次,在吸水纸上用力拍打,充分除去残留的缓冲液。
⑦ 加入100 μl TMB显色,用1 N硫酸终止反应,最后在酶标仪450 nm比色。
本实验重复3次,每个样品有3个?#32431;住?#32467;果判断标准采用:P/N值(阳性孔OD值/阴性孔OD值)大于2.1为阳性;P/N值小于或等于2.1为阴性。根据不同浓度?#26434;?#19981;同的OD值,绘制HSA标?#35760;?#32447;。
根据以上结果判断标准、HSA标?#35760;?#32447;,结果显示,该微量检测试剂盒可以检测到经过稀释后的尿液HSA的含量为1.4 fg/ml。人细胞因子溶液中HSA的残留量为2.6 fg/ml。
实施例4  细胞株11A2产生的单克隆抗体用于免疫亲和层析。
一、免疫亲和层析柱的制备。
1、材料和试剂。
① 材料:细胞株11A2产生的单克隆抗体(mAb 11A2);活化层析填料(NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow, GE Healthcare公司生产);微株(GE Healthcare公司生产)。
② 试剂:平衡缓冲液(0.2 M NaHCO3, 0.5 M NaCl, pH8.3)。封闭缓冲液(0.5 M 氨基乙醇,0.5 M NaCl,pH8.3)。冲洗缓冲液(0.1 M Tris-HCl,pH8.9)。
2、制备方法。
详细的操作方法见厂家说明书。将活化层析填料或微珠用平衡缓冲液平衡后,加入mAb 11A2单抗进?#20449;剂?#29992;封闭缓冲液封闭未?#21058;?#30340;填料或微珠,再用冲洗缓冲液冲?#24202;?#26512;柱或微珠,免疫亲和层析柱制备完成。
经过检测,mAb 11A2免疫亲和填料或微珠的亲和量为:40 mg HSA/ml。
二、用免疫亲和层析柱纯化HSA。
1、材料和试剂。
① 材料:mAb 11A2单克隆抗体?#21058;?#30340;免疫亲和层析填料。
② 试剂:平衡缓冲液(20 mM Na2HPO4和NaH2PO4, pH7.2);冲洗缓冲液(20 mM Na2HPO4和NaH2PO4, pH7.2);洗脱缓冲液(20 mM Na2HPO4和NaH2PO4, 2M NaCl, pH7.2)。
2、方法。
① 装柱和平衡:将?#21058;?#22909;mAb 11A2层析填料或微珠上柱,用平衡缓冲液平衡5个柱体积,流速为1 ml/?#31181;印?
② 上样:按照亲和量40 mg HSA/ml计算样品的上样量。
③ 冲洗杂质:样品上样后,弃掉流穿液(Flow through),用冲洗缓冲液(Wash Buffer)冲洗10个柱体积。
④ 洗脱目的蛋白质:用洗脱缓冲液(Elution Buffer)洗脱结合在填料柱上的HSA,洗脱体积为2个柱体积。
⑤ 平行试验:用阳离子交换柱(SP Sepharose 4 Fast Flow,GE Healthcare公司生产)、疏水柱(Phenyl Sepharose 4 Fast Flow,GE Healthcare公司生产)、阴离子交换柱(Q Sepharose Fast Flow,GE Healthcare公司生产)对照。具体操作参照生产厂?#19994;?#35828;明书。
⑥ 纯度检测,用SDS-PAGE电泳检测纯化后HSA的纯度。用Quantity-One软件(版本4.62;BioRad公司)计算HSA的纯度。
结果显示,上样前HSA的纯度为70%,通过mAb 11A2免疫亲和层析柱纯化后HSA的纯度为99%,收率95%。通过阳离子交换柱、疏水柱和阴离子交换柱3步纯化后,HSA的纯度为94%,收率为72%,由此可见,杂交瘤细胞11A2产生的单克隆抗体(mAb 11A2)用于免疫亲和层析,显著特征在于,纯化HSA具有更高的纯度和收率,具有很好的工业化应用价值。

关于本文
本文标题:一种杂交瘤细胞株11A2及其应用.pdf
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