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分析 检测
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摘要
申请专利号:

CN201280066877.X

申请日:

2012.11.21

公开号:

CN104145026A

公开日:

2014.11.12

当前法律状态:

撤回

有效性:

无权

法?#19978;?#24773;: 发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):C12Q 1/68申请公布日:20141112|||实质审查的生效IPC(主分类):C12Q 1/68申请日:20121121|||公开
IPC分类号: C12Q1/68; G01N27/327; G01N27/02; G01N33/543 主分类号: C12Q1/68
申请人: ITI 苏格兰有限公司
发明人: H·舒尔茨; D·科里根; 蒂尔·巴赫曼
地址: 英国格拉斯哥
优?#28909;ǎ?/td> 2011.11.22 GB 1120118.3; 2012.07.17 GB 1212662.9
专利代理机构: 北京三友知识产权代理有限公司 11127 代理人: 庞东成;张培源
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法律状态
申请(专利)号:

CN201280066877.X

授权公告号:

||||||

法律状态公告日:

2016.08.03|||2014.12.10|||2014.11.12

法律状态类型:

发明专利申请公布后的视为撤回|||实质审查的生效|||公开

摘要

本发明提供了用于检测样?#20998;?#30340;分析物的方法,所述方法包括:(a)使样品与肽核酸(PNA)探针接触;(b)对样品进?#26800;?#21270;学阻抗谱(EIS)测定;(c)根据EIS测定结果确定分析物的存在、不存在、量和/或身份;其中所述分析物包含核酸;且其中在采取样品时样?#20998;?#30340;分析物的量与对样品进行EIS测定时样?#20998;?#20998;析物的量基本相同。

权利要求书

权利要求书
1.  一种检测样?#20998;?#20998;析物的方法,所述方法包括:
(a)使所述样品与肽核酸(PNA)探针接触;
(b)?#36816;?#36848;样品进?#26800;?#21270;学阻抗谱(EIS)测定;
(c)通过EIS测定结果确定所述分析物的存在、不存在、量和/或身份;
其中所述分析物包含核酸;
且其中在采取所述样品时所述样?#20998;?#30340;分析物的量与?#36816;?#36848;样品进行所述EIS测定时所述样?#20998;?#30340;分析物的量基本相同。

2.  如权利要求1所述的方法,其中,在步骤(b)之前?#36816;?#36848;样品没有进行扩增步骤和/或没有进行浓缩步骤。

3.  如权利要求1或2所述的方法,其中,所述分析物包含核糖体RNA和/或基因组DNA。

4.  如前述权利要求中?#25105;?#39033;所述的方法,其中,所述分析物核酸包含1000个以上的碱基(1kb)。

5.  如前述权利要求中?#25105;?#39033;所述的方法,其中,在步骤(b)之前没有进行PCR步骤。

6.  如前述权利要求中?#25105;?#39033;所述的方法,其中,在步骤(b)之前没有进行RTPCR步骤。

7.  如前述权利要求中?#25105;?#39033;所述的方法,其中,步骤(b)包括:
(i)?#36816;?#36848;分析物施加交流电压;
(ii)确定在所述分析物上的EIS测定的改变的速率;
(iii)根据改变速率数据确定所述分析物的存在、不存在、身份和/或量。

8.  如权利要求7所述的方法,其中,所述EIS测定是对电子转移阻抗Ret的测定。

9.  如权利要求7或8所述的方法,其中,所述EIS测定是由在Nyquist图中求得半圆特征的宽度而计算出的测定。

10.  如权利要求1~6中?#25105;?#39033;所述的方法,其中,步骤(b)包括:
(i)?#36816;?#36848;分析物施加交流电压,其中所述交流电压包含多个叠加的频率,所述多 个叠加的频?#39318;?#20197;通过电化学阻抗谱(EIS)来判别出所述分析物的存在;和
(ii)根据EIS数据确定所述分析物的存在、不存在、身份和/或量。

11.  如权利要求10所述的方法,其中,所述EIS数据包括由?#37259;?#25239;(x+iy)获得的数据参数,所述参数选自以下参数中的一个或多个:
·实数分量(x)
·虚数分量(y)
·模数或绝对值[r=|z|=(x2+y2)1/2]
·角[θ=tan-1(y/x)]
·主分量1
·主分量2。

12.  如权利要求10或11所述的方法,其中,所述多个频率在步骤(a)之?#24052;?#36807;统计分析和/或通过经验方法确定。

13.  如权利要求10~12中?#25105;?#39033;所述的方法,其中,叠加的频率的最小数量是2~20。

14.  如权利要求13所述的方法,其中,叠加的频率的数量是至少3~10。

15.  如权利要求10~14中?#25105;?#39033;所述的方法,其中,叠加的频率的数量是至少7。

16.  如前述权利要求中?#25105;?#39033;所述的方法,其中,步骤(b)包括?#36816;?#36848;EIS数据进行傅里叶变换的步骤。

17.  如前述权利要求中?#25105;?#39033;所述的方法,其中,向系?#25345;?#28155;加电解质以辅助EIS测定。

18.  如权利要求17所述的方法,其中,所述电解质是过渡金属络合物。

19.  如权利要求18所述的方法,其中,所述过渡金属络合物包括[Fe(CN)6]3-/4-体系。

20.  如前述权利要求中?#25105;?#39033;所述的方法,其中,在系?#25345;?#37319;用液体介质以辅助EIS测定。

21.  如权利要求20所述的方法,其中,所述液体介质是酸性或碱性的。

22.  如前述权利要求中?#25105;?#39033;所述的方法,其中,所述方法用于分析两?#21482;?#22810;于两种分析物,并?#19968;?#21253;括以下步骤:对每种分析物以一?#21482;?#22810;于一种标记物进行标记,以形成能通过其标记物而相互区分的经标记的分析物。

23.  如权利要求22所述的方法,其中,所述一?#21482;?#22810;于一种标记物适合于光学和/或电学检测。

24.  如权利要求23所述的方法,其中,所述标记物选自纳米颗粒、单分子、化学发光酶和荧光团。

25.  如权利要求24所述的方法,其中,所述标记物是包含一组分子和/或原子的纳米颗粒。

26.  如权利要求25所述的方法,其中,所述纳米颗粒选自金属、金属纳米壳、金属二元化合物和量子点。

27.  如权利要求23~26中?#25105;?#39033;所述的方法,其中,所述光学检测方法选自光学发射检测、光学吸收检测、光学散射检测、光谱位移检测、表面等离子体共振?#19978;?#21644;?#37259;运?#21560;附染料的表面增强拉曼散射。

28.  如权利要求23~27中?#25105;?#39033;所述的方法,其中,所述光学检测是光学发射检测并且包括以下步骤:用能激发所述标记物的光照射所述经标记的分析物,和检测?#37259;运?#36848;标记物的光发射的频率和强度。

29.  如权利要求28所述的方法,其中,所述光是激光。

30.  如权利要求28或29所述的方法,其中,所述光选自红外光、可见光和紫外光。

31.  如权利要求30所述的方法,其中,所述光?#21069;?#20809;。

32.  如前述权利要求中?#25105;?#39033;所述的方法,其中,所述PNA探针包含间隔物部分和PNA部分。

33.  如权利要求32所述的方法,其中,所述间隔物部分包含选自以下基团的两个或多于两个基团:用于将所述间隔物附接至表面的末端基团;烷基;醚基;和羰基,并且/或者其中所述间隔物部分在其主链中包含3个或多于3个原子。

34.  如权利要求32或33所述的方法,其中,所述间隔物部分包含下式:

其中,T是能附接至表面的末端基团;R1、R2、R3、R4、R5和R6各自独立为有 机基团;w是整数0或1;x是整数0~15;y是整数0~15;z是整数0或1;n是整数0~10;m是整数0~15;并且其中[n.m+w+x+y+z]是至少3。

35.  如前述权利要求中?#25105;?#39033;所述的方法,其中,所述方法还包括在步骤(a)之前?#36816;?#36848;样品进行样?#20998;?#22791;步骤的步骤,其中,所述样?#20998;?#22791;步骤包括使所述核酸片段化,优选的是其中所述样?#20998;?#22791;步骤包括加?#20154;?#36848;样品和/或?#36816;?#36848;样品进行超声处理。

36.  如权利要求35所述的方法,其中,所述样?#20998;?#22791;步骤?#36816;?#36848;样?#20998;?#30340;核酸进行片段化,从而使核酸序列的平均长度为:小于1000bp(bp=碱基对)、小于800bp、小于500bp、20bp以上、30bp以上、40bp以上、50bp以上、60bp以上、70bp以上、80bp以上、90bp以上、100bp以上、110bp以上、120bp以上、130bp以上、140bp以上或150bp以上、20bp~800bp、30bp~600bp、40bp~500bp、50bp~400bp、60bp~350bp、70bp~300bp、80bp~250bp、90bp~200bp、100bp~180bp或者约120bp。

37.  一种用于检测包含核酸的样?#20998;?#30340;分析物的方法,所述方法包括:
(a)?#36816;?#36848;样品进行样?#20998;?#22791;步骤以使所述核酸片段化;
(b)使所述样品与肽核酸(PNA)探针接触;
(c)?#36816;?#36848;样品进?#26800;?#21270;学阻抗谱(EIS)测定;
(d)根据所述EIS测定结果确定所述分析物的存在、不存在、量和/或身份。

38.  如权利要求37所述的方法,其中,所述核酸的长度为1000bp以上,例如,大的核酸、gDNA或rRNA。

39.  如权利要求37或38所述的方法,其中,所述样?#20998;?#22791;步骤包括加?#20154;?#36848;样品和/或?#36816;?#36848;样品进行超声处理。

40.  如权利要求37~39中?#25105;?#39033;所述的方法,其中,所述样?#20998;?#22791;步骤将所述核酸片段化,从而使所得核酸序列的平均长度为:小于1000bp(bp=碱基对)、小于800bp、小于500bp、20bp以上、30bp以上、40bp以上、50bp以上、60bp以上、70bp以上、80bp以上、90bp以上、100bp以上、110bp以上、120bp以上、130bp以上、140bp以上或150bp以上、20bp~800bp、30bp~600bp、40bp~500bp、50bp~400bp、60bp~350bp、70bp~300bp、80bp~250bp、90bp~200bp、100bp~180bp或者约120bp。

41.  一种检测受试对象的伤口中的病原体的方法,所述方法包括通过执行如前述权利要求中?#25105;?#39033;所限定的方法来检测所述病原体的特征性核酸。

42.  如权利要求41所述的方法,其中,所述样品是?#36816;?#36848;受试对象的伤口采取的样品。

43.  如权利要求41或42所述的方法,其中,所述受试对象是人类。

44.  如权利要求41~43中?#25105;?#39033;所述的方法,其中,所述病原体是对治疗具有抗性的病原体。

45.  如权利要求41~44中?#25105;?#39033;所述的方法,其中,所述病原体选?#28304;?#32928;?#21496;?#21644;MRSA。

说明书

说明书分析物的检测
本发明涉及用于检测分析物的方法,所述方法利用增强的电化学阻抗谱(EIS)?#38469;?#26469;获取核酸分析物的数据从而进行检测。所述方法具有优点,因为其能在无需将核酸分析物扩增的情况下进行。这使程序得到简化,并可具有比已知检测方法高的速度,并因此能改善时间:结果比(TTR)和促进在近患者环?#25345;?#30340;此类检测的开发。本方法在对伤口的分析、特别是使伤口感染的病原体的分析方面尤其有利。
用于检测分析物的方法是生化分析领域公知的。在传统方法中,分析物被标记,通常用可被(例如,通过荧光检测)检测到的荧光标记物来标记,以便鉴定所述分析物。
过去?#25913;?#22312;DNA检测领域中,使用了纳米颗粒作为标记物。这些标记物将可能用于任何允许进行标记并涉及结合的体系,因而可以用与活细胞体系以及蛋白和核酸。已发现纳米颗粒能克服更传统的荧光标记物的多种局限性,包括成本、易用性、灵敏度和选择性(Fritzsche W,Taton T A,Nanotechnology14(2003)R63-R73“Metal nanoparticles as labels for heterogeneous,chip-based DNA detection”)。纳米颗粒已被用于许多不同的DNA检测方法中,包括光学检测、电学检测、电化学检测和重量分析检测(Fritzsche W,Taton T A,Nanotechnology14(2003)R63-R73“Metal nanoparticles as labels for heterogeneous,chip-based DNA detection”)。金纳米颗粒已经成功用在DNA杂交的检测中,所述检测基于胶体金标签的电化学剥取检测(Wang J,Xu D,Kawde A,Poslky R,Analytical Chemistry(2001),73,5576-5581“Metal Nanoparticle-Based Electrochemical Stripping Potentiometric Detection of DNA hybridization”)。半导体纳米晶体(也称作量子点)和金纳米颗粒的使用也已成功地作为荧光标记物用于DNA杂交研究(West J,Halas N,Annual Review of Biomedical Engineering,2003,5:285-292“Engineered Nanomaterials for Biophotonics Applications:Improving Sensing,Imaging and Therapeutics”)。
尽管通过在DNA检测方法中使用纳米颗粒替代此前的荧光标记物而发现了所述优点,但是仍然需要改善所述检测方法的灵敏度和选择性,特别是检测方法的速度。虽然各个检测方法均具有一定程度的灵敏度和选择性,但它们各自具有不同的局限性 并产生了不同的不准确度,且均都没有所需的那样快速,尤其是对于需要短时间(例如,约10分钟)取得结果的近患者环境测试而言尤其如此。
此外,对于这些方法,已将纳米颗粒标记与电泳结合以检测DNA(参见WO 2009/112537)。电泳被用来加速DNA在电极表面与互?#22266;?#38024;的结合。该方法由于可比已知检测方法具有更高的速度和灵敏度而具有优?#21860;?
除此以外,对于价廉简便的检测方法、特别是对于近患者环境的DNA的检测方法的需求也正在增加。为?#31169;档?#25104;本、简化方法和提高检测速度,已知可以完全省去标记。虽然不使用标记物的检测方法可能具有这些优点,但?#33576;?#20197;实现标记物所提供的检测的灵活性和灵敏性。
在过去,曾考虑用电化学阻抗谱(EIS)?#38469;?#26469;在使用或不使用标记物的情况下获得分析物的数据。以下参考文献提供了背景?#38468;冢?
EIS对于生物传感的应用的综述——Daniels,J.S.,Pourmanda,N.,“Label-Free Impedance Biosensors:Opportunities and Challenges”,Electroanalysis,19,2007,1239-1257。
EIS对于生物传感的应用的综述——Katz,E.,Willner,I.,“Probing Biomolecular Interactions at Conductive and Semiconductive Surfaces by Impedance Spectroscopy:Routes to Impedimetric Immunosensors,DNA-Sensors,and Enzyme Biosensors”,Electroanalysis15,2003,913-947。
不同尺寸的纳米级电极在KCl溶液中的阻抗谱的表征——Laureyn,W.,Van Gerwen,P.,Suls,J.,Jacobs,P.,Maes,G.,Electroanalysis,13,2001,204-211。
用于检测酶活性的AC阻抗和谱——Laureyn,W.,Van Gerwen,P.,Suls,J.,Jacobs,P.,Maes,G.,Electroanalysis,13,2001,204-211。
整合系?#25345;?#30340;AC阻抗和IDE——Zou,Z.,Kai,J.,Rust,M.J.,Han,J.,Ahn,C.H.,“Functionalized nano interdigitated electrodes arrays on polymer with integrated microfluidics for direct bio-affinity sensing using impedimetric measurement.”Sens.Acts.A,136,2007,518–526。
“In situ hybridization of PNA/DNA studied label-free by electrochemical impedance spectroscopy”,J Liu,S.Tian,P.Nielsen,W.Knoll,Chem.Commun.,2005,2969-2971。
就此能够看出,AC阻抗测定(也称作电化学阻抗谱,或EIS)通常涉及在两个电极 之间应用正弦小振幅(~10mV)交流电压扰动以及测定在其间所产生的作为AC频率的函数的电流,由此可以计算作为频率的函数的阻抗。此类阻抗谱的变化已据?#20801;?#21487;对在电极的特定表面膜中的探针-靶标结合提供灵敏的无标记物的测定方法,特别是在使用叉指形电极(IDE)(例如叉指形微型电极(IME)或叉?#24863;文?#31859;电极(INE))时尤其如此。然而,这些测定通常依赖于分析物与电极的结合的平衡、或分析物与附接至电极的探针的结合的平衡,因为这决定着结合在层中的靶标的量。EIS相应因此遵循平衡热力学。该程序需要平衡较长的时间,通过为数小时,且有时候需要在升高的温度下进行,以确保测定?#24052;?#20840;的探针-靶标结合。这?#22242;?#38500;了快速的时间:结果比(TTR)。
除此以外,已从理论上考虑了IDE的阻抗响应,并且分析通常利用?#23454;?#30340;等效电?#26041;?#34892;,所述等效电路在宽频率?#27573;?#36866;配于所述响应以得到用于等效电路元件(电阻器、电容器、沃伯格元件等)的参数,从该参数能够提取出指?#38236;?#21270;学响应变化的特征性物理参数(例如,扩散系数、浓度、层厚)。此外,通常采用在各频率下的连续测定。这些因素共同增加了上文所讨论的相对较大的时间:结果比,这?#19988;?#20026;它们均有助于延长的分析和测定时间。
因此,已知的EIS方法、尤其是无标记物的方法通常?#19979;?#19988;对于在本发明所需的近患者环境设定中使用不会提供令人满意的时间:结果?#21462;S2010/0133118公开了利用EIS在核酸检测中使用核酸探针。优选PNA探针,但也可以使用DNA探针。未采用样品的扩增,而是通过对样?#20998;?#20998;析物的浓缩来增强信号。该?#38469;?#26377;助于检测灵敏度,但浓缩步骤通常较长且涉及更为复杂的化学,这就意味着其具有与扩增步骤相同的缺陷。特别地,其不适用于在时间:结果比极为重要的近患者环?#25345;?#27979;试。
WO2009/122159公开了用于检测包括但不限于核酸的生物传感器。其采用PNA探针,通常用于检测mRNA和cDNA。然而,其在使用EIS进行分析之前也采用了扩增步骤。因此,其也存在与这里所描述的其它已知方法相同的缺陷。
在至今所描述的所有现有?#38469;?#26041;法中,需要在检测前增加样?#20998;?#26680;酸的量(通过浓缩或扩增),即使在采用了更为灵敏的EIS和无标记物检测?#24065;?#26159;如此。然而,如本文已提及的那样,扩增?#38469;?#31561;需要相当的时间和额外的化学和物理资源(?#20174;?#26448;料、方法步骤、设备等)。因此,核酸检测在速度和灵敏度很重要时呈现出独特的问题。
本发明的目的在于克服与上述现有?#38469;?#30456;关的问题。具体地,本发明的目的在于提供一种以良好的灵敏度和选择性检测核酸分析物的方法,该方法还具有改善的速度 以及时间:结果比,并且价廉且易于实施。
因此,本发明提供了用于检测样?#20998;?#30340;分析物的方法,所述方法包括:
(a)使所述样品与肽核酸(PNA)探针接触;
(b)?#36816;?#36848;样品进?#26800;?#21270;学阻抗谱(EIS)测定;
(c)由EIS测定结果确定所述分析物的存在、不存在、量和/或身份;
其中所述分析物包含核酸,且其中在采取样品时所述样?#20998;?#30340;分析物的量或浓度与?#36816;?#36848;样品进行EIS测定时所述样?#20998;?#30340;分析物的量和/或浓度基本相同。
在一些实施方式中,“在采取样品时所述样?#20998;?#30340;分析物的量或浓度与?#36816;?#36848;样品进行EIS测定时所述样?#20998;?#30340;分析物的量和/或浓度基本相同”可能仅意味着没有进行核酸扩增步骤。因此,本发明提供了用于检测样?#20998;?#20998;析物的方法,所述方法包括:
(a)使所述样品与肽核酸(PNA)探针接触;
(b)?#36816;?#36848;样品进?#26800;?#21270;学阻抗谱(EIS)测定;
(c)由EIS测定结果确定所述分析物的存在、不存在、量和/或身份;
其中所述分析物包含核酸,且其中在对样品进行EIS测定前没有进行核酸扩增步骤。
在另一个实施方式中,本发明提供了用于检测样?#20998;?#30340;包含核酸的分析物的方法,所述方法包括:
(a)?#36816;?#36848;样品进行样?#20998;?#22791;步骤以使所述核酸片段化;
(b)使所述样品与肽核酸(PNA)探针接触;
(c)?#36816;?#36848;样品进?#26800;?#21270;学阻抗谱(EIS)测定;
(d)由所述EIS测定结果确定所述分析物的存在、不存在、量和/或身份。
通常,样?#20998;?#22791;步骤包括对样品加热、超声或使用限制酶处理以使核酸片段化。通常采用加热或超声处理以避免限制酶所涉及的时间、费用和额外的?#32422;痢?#22312;优选实施方式中,通过加热或者其他方式使核酸片段化来制备样品,从而所得核酸序列的平均长度(或最小长度)为:1000bp以下(bp=碱基对)、900bp以下、800bp以下、700bp以下、600bp以下、500bp以下、20bp以上、30bp以上、40bp以上、50bp以上、60bp以上、70bp以上、80bp以上、90bp以上、100bp以上、110bp以上、120bp以上、130bp以上、140bp以上或150bp以上、20bp~1000bp、30bp~900bp、40 bp~800bp、50bp~700bp、60bp~600bp、70bp~600bp、80bp~600bp、90bp~600bp、100bp~600bp、100bp~500bp、100bp~400bp、100bp~300bp、110bp~200bp以及约120bp。在该实施方式中,通常,采取样品时样?#20998;?#30340;分析物的量或浓度与对样品进行EIS测定时样?#20998;?#30340;分析物的量或浓度基本相同。这通常意味着没有进行核酸扩增步骤。
在本发明的该方面,在样?#20998;?#22791;步骤中进行的加工处理不受特别限制,只要其使核酸片段化即可。通常,这使核酸序列的平均长度(或最小长度)处在上文所讨论的优选?#27573;?#20869;。通常但并非绝对地,所述加工处理是使核酸片段化的加热步骤。这在样品包含大的核酸如基因组DNA(gDNA)或核糖体RNA(rRNA)时特别优选。通常,?#28304;?#31867;大核酸的加热导致发生片段化形成1000bp以下的序列。常规PCR通常涉及加热以使核酸变性(将双?#37259;?#21270;为单链核酸以允许复制),但其在于避免片段化从而防止DNA样品的降解。这在文章“Effect of heat denaturation of target DNA on the PCR amplification”,Gene.,1993,123(2),241-244页”?#26800;?#20197;证实,其中Gustafson等声明:
“我?#19988;严允?#20986;,在PCR?#20174;?#24320;始时通常对模板DNA所采用的较长的变性时间(在pH7.0至8.0为1至7分钟)导致模板的显著降解。这可能导致大于500bp的PCR产物的产率显著?#26723;?#22810;达99%。…产物产率的这?#32440;档?#21487;能是由于模板或靶DNA因预扩增变性(PAD)而更多降解所致。我?#19988;?#27492;推荐在扩增较大的DNA时,不论模板溶液的起始pH为何值,均不应将模板DNA在PCR?#20174;?#21069;暴露于PAD?#34180;?
因此,当应对如基因组DNA等大核酸时,已避免了可能导致片段化的处理(例如加热处理),这?#19988;?#20026;其存在?#29616;?#32570;点。然而,本发明人令人惊讶地发现,在本发明的方法中片段化是合乎需要的:本发明人发现,片段化不会有害地干扰分析结果,而是可以提高EIS信号,并因此有助于完全避免对分析物扩增(如通过PCR)的需要。
加热时长和采用的温度将取决于所研究的样品的性质,还取决于周围介质的化学性质(pH、缓冲物、盐、催化剂的存在等)。这不受特别限制,只要实?#36136;实?#30340;片段化即可。通常采用10秒至1小时的时间,优选30秒至30分钟、1分钟至20分钟、2分钟至15分钟和3分钟至10分钟。通常,优选约5分钟。温度通常为60℃至100℃、70℃至99℃、80℃至99℃、90℃至99℃,且通常为约95℃。
由图20可以看出,基因组DNA在2xSSC中于95℃变性5分钟的同时导致了DNA片段化的增加和阻抗计信号的增加。已经对具有长杂交时间的玻璃微阵列评估 了DNA片段化的作用,而迄今尚未研?#25239;鼶NA片段化对用于阻抗计检测的基因组DNA结合的作用。如上文所强调,已知DNA在如95℃的高温温育会导致长链DNA的片段化并?#26723;蚉CR效率。据?#20801;荊珼NA热片段化会产生小于800bp的链。在不受理论束缚的情况下,对于在DNA在95℃温育5分钟后观察?#38454;?#22823;的EIS信号的最可能的解释是,更短的片段能够更好地接触到并结合探针序列,而探针序列驻留在电极表面附近。对于基于EIS的核酸杂交传感而言,在片段尺寸和信号增加之间存在着权衡。更长的片段将因其对溶液中的氧化还原探针的更强静电效应以?#24052;?#36807;更好地阻断隧道效应电流穿过传感层而诱?#20960;?#22823;的信号增加;然而,长片段的杂交效率将由于电极表面的空间位阻效应和可能的二级结构的形成而?#26723;汀?#22312;本文给出的实施例中,关于靶标片段化时间的数据?#20801;?#20986;存在着这种在探针长度、片段长度和EIS信号之间的关系。片段化数据表明,长度为约120bp的靶标链长可增加EIS信号,并因此可以在不进行扩增的情况下促进检测核酸的能力。与此相反,与基于EIS的核酸检测相关的许多文献报道了用短的(20bp)人工寡核苷酸获得的结果。
在本发明的背景下,在一些实施方式中,通常在不增加样?#20998;?#30340;分析物的量或浓度的情况下对样品进行EIS,例如,通过避免扩增或避免将多个样品以使得分析物浓缩的方?#38454;?#21512;,或者避免通过除去液体介?#35782;?#20351;样品浓缩。因此,在采取样品时样?#20998;?#30340;分析物的量和/或浓度与在对样?#20998;?#34892;EIS步骤时的样?#20998;?#30340;分析物的量和/或浓度基本相同。在该情形中,所述量或浓度不需要绝对相同,而?#29575;?#19978;绝对相同并非总是可能的,这?#19988;?#20026;标准的样?#20998;?#22791;?#38469;?#21487;能有时会较小程度的改变所述量或浓度。因此,基本相同是指相同的程度可以允许采用标准样?#20998;?#22791;?#38469;?#36827;行核酸检测。此类标准样?#20998;?#22791;?#38469;?#21487;能涉及裂解细胞和清洁样品?#21462;?#36824;可以进行某些纯化,只要这不会导致浓缩或扩增(例如,如果?#21451;?#21697;除去了可能干扰检测的物质)即可。在一些实施方式中,可以在几乎不进行或不进行样?#20998;?#22791;的情况下将样品?#28304;?#21697;形式导入至PNA探针。
因此,在一些实施方式,本发明在EIS测定之前没有使用扩增步骤也没有浓缩步骤。因此,在这些实施方式中,与现有?#38469;?#19981;同,并未采用PCR步骤或RTPCR步骤。
分析物不受特别限制,只要其为核酸即可。可以对任何核酸进行分析,但在典型的实施方式中,核酸分析物包含大的核酸,如核糖体RNA和/或基因组DNA(rRNA和gDNA)。特别优选的是,分析物是可提供强EIS信号的类型。因此,在一些实施 方式中,分析物核酸包含1000个碱基(1kb)以上,更优选为10kb以上、100kb以上、1Mb以上和5Mb以上。如上文所提及,通常基因组DNA可以被片段化或切割为更小的部分以有助于处理:因此,在一些实施方式中,gDNA分析物的尺寸可以为1Mb以上、2Mb以上、3Mb以上、4Mb以上或5Mb以上。与基因组DNA相比,核糖体RNA的尺寸可以更小,这?#19988;?#20026;其?#28304;?#37327;拷贝存在,这能给出更好的EIS信号。通常,rRNA分析物可以为1.0kb以上、1.1kb以上、1.2kb以上、1.3kb以上、1.4kb以上和1.5kb以上。作为另一种选择,rRNA分析物可以为1.6kb以上、1.7kb以上、1.8kb以上、1.9kb以上、2.0kb以上或2.5kb以上。作为再一种选择,rRNA分析物可以为3.0kb以上、3.5kb以上、4.0kb以上或4.5kb以上。如上文所提及,进而优选的是,该样品经过处理从而使核酸序列的平均长度为20bp以上、30bp以上、40bp以上、50bp以上、60bp以上、70bp以上、80bp以上、90bp以上、100bp以上、110bp以上、120bp以上、130bp以上、140bp以上或150bp以上。通常,加工后核酸序列的平均长度将为1000bp以下、900bp以下、800bp以下、700bp以下、600bp以下或500bp以下,因此优选长度为30bp~1000bp、40bp~900bp、50bp~800bp、55bp~600bp、60bp~500bp、70bp~400bp、80bp~300bp、90bp~200bp、90bp~180bp、90bp~150bp、100bp~140bp、110bp~130bp和约120bp。
PNA探针不受特别限制,只要其适用于检测所关注的分析物即可。因具有可提高EIS的检测灵敏度的能力,PNA探针是理想的(见图9和图10)。选择可与靶分析物结合的合适的PNA探针。
通常但并非绝对地,PNA探针还包含间隔物,因此该探针包含间隔物部分和PNA部分。间隔物部分意在优先附接于电极表面,以便?#22266;?#38024;的PNA部分抬起离开电极的表面。这可提高PNA探针的杂交效率。
间隔物的性质不受特别限制,只要其不会有害地干扰PNA的杂交效率即可。然而,在一些实施方式中,间隔物可能含有包含一个或多个以下基团的有机分子:能附接至表面的末端基团——优选末端氨基(其可以为伯、仲或叔氨基)、末端羟基或末端巯基;烷基;烯基;?#19981;?#37274;基;和/或羰基。间隔物基团的主链中的碳原子(直接处在电极和PNA部分之间的原子)的数目不受特别限制,只要提供充足的空间以提高杂交效率即可。在典型实施方式中,主链中可以有3个以上的原子、4个以上、5个以上、6个以上、7个以上、8个以上、9个以上、10个以上、11个以上或12个以上。 更通常而言,在主链中可以有5至30个原子、或6至25个原子、或7至24个原子或者8至23个原子。更通常地,主链中的原子数可以为9至23个、10至23个、3至18个、5至15个、5至13个和5至10个原子。
优选的间隔物的实例包括具有下式的化合物:

其中,T是能附接至表面的末端基团;R1、R2、R3、R4、R5和R6各自独立为有机基团;w是整数0或1;x是整数0~15;y是整数0~15;z是整数0或1;n是整数0~10;m是整数0~15;并且其中[n.m+w+x+y+z]是至少3的整数。在该式中,间隔物的主链中的原子数由w、x、y、z、n和m所确定且简单地为[n.m+w+x+y+z]。
T不受特别限制,只要其为能将探针的间隔物部分附接至表面(例如电极表面)的基团即可。然而,通常T选自以下基团:–NH2、-NHR7、-NR7R8、–SH、-SR9、-OH、-OR10。
在一些实施方式中,间隔物可以具有其中上式中的x为0的下式:

其中,所有变量具有与上文已进行的限定相同的含义。
通常,间隔物可以是具有?#25105;?#20197;下式的任何化合物:

其中,所有变量具有与上文已进行的限定相同的含义,且其中R7、R8、R9和R10各自独立地为有机基团。
如上文所提及,R1、R2、R3、R4、R5、R6R7、R8、R9和R10各自独立地为有机基团。在与本发明关联提及的所有实施方式中,在上文和下文中,有机基团没有特别限制,且可以为任何的官能团或任何原子,尤其是有机化学中常见的任何官能团或原子,包括H原子。因此,有机基团可以具有任何下述含义。有机基团可以包含?#37259;?#20803;素周期表的IIIA、IVA、VA、VIA或VIIA族的一个或多个原子,例如B、Si、N、P、O或S原子(例如,OH、OR、NH2、NHR、NR2、SH、SR、SO3H、PO4H2等)或卤原子(例如,F、Cl、Br或I),其中R是?#22270;短?#22522;(1至6个C原子)或高?#30701;?#22522;(7个C原子以上,例如,7至40个碳原子)。
有机基?#24222;?#36873;包含烃基。烃基可以包含直链、支链或环式基团。独立地,烃基可以包含脂肪族或芳香族基团。此外,独立地,烃基可以包含饱和或不饱和的基团。
当烃基包含不饱和基团时,其可包含一个或多个烯官能性和/或一个或多个?#34917;?#33021;性。当烃包含直链或支链基团时,其可包含一个或多个伯、仲和/或叔烷基。当烃 包含环式基团时,其可包含芳香环、脂族环、杂环基和/或这些基团的稠?#36153;?#29983;物。环式基团因此可以包括苯基、萘基、蒽基、茚基、芴基、吡啶基、喹啉基、噻吩基、苯并噻吩基、呋喃基、苯并呋喃基、?#37327;?#22522;、吲哚基、咪唑基、噻唑基和/或噁唑基以及上述基团的位置异构体。
烃基中的碳原子数不受特别限制,但优选的是烃基包含1至40个碳原子。因此,烃基可以是?#22270;短?#22522;(1至6个C原子)或高?#30701;?#22522;(7个C原子以上,例如,7至40个碳原子)。?#22270;短?#22522;可以为甲基、?#19968;?#19993;基、丁基、戊基或己基或者这些基团的位置异构体,例如异丙基、异丁基、叔丁基?#21462;?#29615;式基团的?#20998;?#30340;原子数不受特别限制,但优选的是环式基团的环包含3至10个原子,例如3、4、5、6或7个原子。
上述的包含杂原子的基团以及上述任何其它基团可以包含?#37259;?#20803;素周期表的IIIA、IVA、VA、VIA或VIIA族的?#25105;?#26063;的一个或多个杂原子,例如,B、Si、N、P、O或S原子或卤原子(例如,F、Cl、Br或I)。因此,有机基团可以包含有机化学中常见的任?#25105;?#20010;或多个官能团,例如羟基、?#20154;?#22522;、酯基、醚基、醛基、酮基、氨基、酰胺基、?#21069;?#22522;、巯基、硫醚基、硫酸基、磺酸基和磷酸基?#21462;?#26377;机基团还可以包含这些基团的衍生物,例如?#20154;?#37200;和?#20154;?#21348;化物。
另外,任何有机基团都可以包含两种以上的上文限定的有机基团和/或官能团的组合。
在一些实施方式中,R1、R2、R3、R4、R5、R6R7、R8、R9和R10均为?#22270;?#28919;基,且最为通常地其均为H原子。
通常,x+y大于或等于1。通常w为1。通常z为1。最为通常地,w和z均为1。
通常,控制n与m的乘积(作为对[n.m+w+x+y+z]的值的控制的一部分)以实现优选的主链碳原子数从而使该数如上所述。通常,n是整数1~3,且最为通常地,n是2。在一些实施方式中,m是整数1~5,且最为通常地,m是2或3。
一些更为典型的间隔物选自下式的化合物,其中,w=1,n=2,y=1,z=1且优选x=0:

其中,所有变量具有与上文已进行的限定相同的含义;m是整数1~7、1~6、1~5、1~4或1~3,例如,其中m为1、2、3、4、5、6或7;x是整数1~15、1~13、1~11、3~15、3~13、3~11、5~15、5~13或5~11;R3和R3’可以相同或不同,且R4和R4’可以相同或不同。优选地,R3和R3’相同且R4和R4’相同。更优选地,R3、R3’、R4和R4’均相同。通常,R3、R3’、R4和R4’?#38469;荋。
在大多数实施方式中,R1~R10均为?#22270;?#28919;基或H,且在最典型实施方式中,R1~R10均为H原子。一些最优选的间隔物具有以下式:


其分别在主链具有7、9、12和23个碳原子。
在所有上式中,波浪线表示间隔物到PNA的键附接点。通常,间隔物通过末端基团附接至电极表面。
EIS方法不受特别限制,只要其足以确定分析物的存在、不存在、身份和/或量即可。然而,EIS步骤优选包含以下子步骤:
i)对分析物施加交流电压,其中,所述交流电压包含多个叠加的频率,其足以通过电化学阻抗谱(EIS)区分出分析物的存在;和
ii)根据EIS数据确定分析物的存在、不存在、身份和/或量。
本发明的该方面优选利用了统计分析来确定在步骤(i)中所要叠加和施加的频?#39318;欏?#20197;该方式确定频率的统?#21697;?#27861;是本领域公知的,?#20918;?#39046;域?#38469;?#20154;员可以采用任?#25105;?#30693;方法来确定在本发明方法中使用的频?#39318;欏?#27492;类方法可以例如见于“Statistical methods in Experimental physics”(第2版),新加坡World Scientific Publications Co.Pte.Ltd.出版,F.James编著,(2006)ISBN981-256795。
必要?#24065;?#21487;采用其它的确定频?#39318;?#30340;方法。例如,对于特定系统(例如,特定电极/溶液/分析物组合),可以预先采用经验方法?#19994;?#21487;满足作为该特定系统的标准的频?#39318;欏?#28982;后可以在该体系中采用该标准,而无需在每次执行方法时都计算所需频率。也可以采用任何其它方法,不论实时或者预先地,只要其产生可采用的可行频?#39318;?#24182;且不会负面地影响TTR即可。
不论使用何?#22336;?#27861;来确定频?#39318;椋?#35813;组应该至少包括足以利用EIS区分出分析物的存在所需的最小数目的频率。在需要时?#27604;?#20063;可以在最小数?#23458;?#37319;用另外的频率。
在一些实施方式中,除所述频?#39318;?#20197;外或者替代所述频?#39318;椋?#25152;述方法可以涉及确定自身?#19978;?#23450;频?#39318;?#24182;因此有助于实现对分析物的存在和/或量的检测的其它参数。在?#25105;?#24773;形中,从通过数据分析提供最快的时间:结果比的角度选择频率和/或参数。
通常,频?#39318;?#21644;/或参数足以区分出分析物的存在或不存在。频?#39318;?#30340;规格不受特别限定,但其可以被限定为特定的单独频率的组、一定?#27573;?#20869;的频率的组和/或与其有间隔的单个频率(所述间隔限定了组中的其它频率)。
对使用叠加频率进行的EIS测定的结果分析优选是统计分析,并且无需采用等效电路分析,后者通常使得能进行更快的辨识。然而,并不排除等效电路法和任何其它方法,只要TTR不受负面影响即可。可以使用快速傅里叶变换(FFT)分析来提取必要的EIS数据,且该信息被用来提供分析物信息。此类FFT?#38469;?#26159;本领域公知的,且?#38469;?#20154;员可以根据需要在本发明中采用任何这类?#38469;酢?#22914;上所述,优选地可以根据EIS数据获得关于分析物存在或不存在的信息,且更优选地还可以确定所存在的分析物的量。
本发明证实可以利用在有限的频率?#27573;?#20869;的少数点(在实施例1(见下文)中在一个十进位的频率间的七个点)来实现EIS生物传感和辨识,这使得能够同时应用含有必需频率的多波形(实施例1中为多正弦(multisine))EIS扰动,并用快速傅里叶转换(FFT)分析来提取必要的信息。这类程序使得能够利用商购仪器在数?#32957;?#36827;行测定和分析,从而使得EIS测定能够在实际时程(realistic timescale)上进行快速稳健的检测。
在本发明中可以检测任何核酸分析物,且检测方法将取决于所涉及的分析物的类型。本发明中所采用的频?#39318;?#23558;取决于对于所研究的每个特定系?#25345;?#21457;生的结合的类型,以及系统自身的物理性质(电极类型、电极组成、电极尺寸、分析物组成、溶剂/液体介质类型、电解?#23454;?。对于类似系统,可以采用标?#35745;德首椋?#32780;对于新系统或分析物可以采用实时统计计算,如上文所说明。
如上文所述,EIS步骤不受特别限制。因此,作为选择,EIS步骤可以包括以下子步骤:
i)对分析物施加交流电压;
ii)确定在分析物上的EIS测定的变化速率;
iii)根据变化速率数据确定分析物的存在、不存在、身份和/或量。
在本发明的该方面,特别优选的是,EIS测定是对电子转移阻抗(Ret)的测定。对于实时进行的典型EIS测定而言,对于探?#32957;?#24418;成和探针靶标杂交特别敏感的一个参数是存在于系?#25345;?#30340;氧化还原对(例如,[Fe(CN)6]3-/4-)的电子转移阻抗(Ret)。该参数是本领域中公知的,且可以由EIS谱的Nyquist图中的半圆形特征的宽度来计算。
本发明的该方面提供了IDE测定规程,从而使得能进行对针对分析物(与电极表面或经由探针-分析物杂交)结合的EIS响应的原位动力学测定。与使用多个叠加频?#20351;?#36890;的是,这使EIS测定时间大大缩短。此外,与第一方面共通的是,可以检测任何分析物,且检测方法的?#38468;?#23558;取决于所涉及的分析物类型。某些分析物可与电极直接结合,而其它则可能与电极表面的探针或互补分子结合。Ret数据的确切性质将取决于对每个所研究的特定系统而设想的结合类型。
如上文已提及,在本发明的该方面,优选的是在溶液中存在氧化还原探针的两种氧化态(例如,铁氰化物和亚铁氰化物)。这确保了在整个方法中IDE处的直流电势被氧化还原探针的还原电势所固定,并且意味着可以在不使用外部参照电极的情况下在两个IDE之间施加电?#21860;?#36825;使得能够在IDE中的两个电极之间容?#36164;┘有?#24133;的EIS扰动电压以测定EIS响应。此类测定使得能够以与溶液接触的时间来测定EIS响应。
如上文所提及,目前已知的EIS规程测定的是对电极/分析物结合(或在探针附接至电极的情形中,是分析物/探针结合)的平衡的趋近。这导致EIS信号变化(通常是增加)至指?#37202;胶?#30340;恒定值。在这种情况下,由于测定在溶液中进行,实时地确定了平衡用时和平衡EIS信号,从而得?#38454;?#20339;的平衡测定。然而,时间:结果比是缓慢的,这?#19988;?#20026;在能确定结果前需要完全的平衡,而这通常是一个较长的过程,受分析物的结合和释放的速率所控制。在本发明的该方面,如上所述,使用了EIS信号的增加速率并对其进行分析以确定溶液中分析物的浓度;同?#24065;?#21160;力学方式测定电极/分析物结合(或分析物/探针结合)。这可以以快得多的TTR(数分钟或更快)实现,且无需达到完全平衡。
在本发明中,EIS数据优选包含由?#37259;?#25239;(x+iy)获得的数据参数。这些参数是本领域?#38469;?#20154;员所公知的,且可?#28304;?#20197;下参数中的一个或多个中选择:
·实数分量(x)
·虚数分量(y)
·模数或绝对值[r=|z|=(x2+y2)1/2]
·角[θ=tan-1(y/x)]
·主分量1
·主分量2
本发明中所采用的叠加频率的数目不受特别限制,只要其适合利用EIS的分析从 而?#36816;?#38656;精度给出分析物的性质和/或量即可。通常,叠加的频率的最小数目是2~20。更优选地,叠加的频率的最小数目是至少3~10,即至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10。最优选的是叠加频率的数目为约7。
如上所述,优选的是本发明的方法在液体介质中进行。优选地,对液体介质进行选择以便辅助进程。所述介质不受特别限制,只要所述方法不受损害即可,且可以采用酸性或碱性介质。
将参考附图对本发明进行更详细的说明,其中:
图1?#20801;?#20102;?#37259;源?#22411;金电极(Z值小)和叉指形微型电极(IME)的EIS数据的典型Nyquist图。
图2?#20801;?#20102;大型电极和叉指形电极的针对阳性对照和固定探针的实数分量(x)、虚数分量(y)、模数(r)、角(θ)、主分量1和主分量2v.s.频率的图。
图3?#20801;?#20102;?#37259;?#37319;用约23秒同步FFT分析的普通单正弦连续EIS测定的金蛋白大型电极(macroelectrode)(6700pM抗体)的EIS响应(黑色——记录时间大于2分钟;红色——在9?#32957;?#30340;5重多正弦EIS测定;?#28193;?#27599;9秒的15重多正弦EIS测定)。
图4?#20801;玖司?#26377;69聚体HCV DNA探针并且用1mM MCH封闭(菱形)、和与1μM互补靶标(ITI025)杂交(正方形)的改性金电极的Nyquist图的比较。阻抗测定在IDE对的电极间施加的直流电势为0V时在含10mM[Fe(CN)6]3-和10mM[Fe(CN)6]4-(加上探针或靶标)的2xSSC中进行。
图5?#20801;玖司?#26377;69聚体HCV DNA探针并用1mM MCH封闭(菱形)、与1μM非互补靶标(ITI012)杂交(正方形)、与1nM(三角形)和50nM(圆形)互补靶标(ITI025)杂交(正方形)的改性金电极的Nyquist图的比较。阻抗测定在IDE对的电极间施加的直流电势为0V时在含10mM[Fe(CN)6]3-和10mM[Fe(CN)6]4-(加上探针或靶标)的2xSSC中进行。
图6?#20801;?#20102;在探针(硫醇-DNA)层形成期间(菱形)、用MCH封闭后(正方形)、与1μM互补靶标杂交期间(三角形)和在杂交后洗涤期间(圆形)的EIS测定的Ret v.s.时间的图。
图7?#20801;?#20102;在对互补靶标(50nM)结合的EIS测定和20nM QD温育后的荧光测定;PMT设定为180。
图8?#20801;?#20102;金叉指形微型电极结构的掩膜布局,该微型电极结构包括4个装置?#37202;?#27604;对标记和加速提起(lift-off)处理的虚设金属线。每个电极上的指部(digit)的数目(N)优选为5至10。每个指部的长度优选为75μm至150μm。每个指部的宽度(W)?#36879;?#25351;部间的间隙的宽度(G)各自优选为1.5μm至10μm,且W和G优选相同。
图9?#20801;?#20986;在用1μM靶标杂交之前和之后的DNA探针的EIS响应(电子转移阻抗值(Rct)),而图10?#20801;?#20986;在用1μM靶标杂交之前和之后的PNA探针的EIS响应(Rct)。PNA和RNA探针的灵敏度的这一巨大差异是由于PNA是不具有DNA分子的带负电荷的磷酸主链的中性分子。带负电荷的核酸靶标的杂交导致电极表面的整体电荷的较大改变。这产生了用于感应电流EIS检测的带负电荷的电活性物种(铁氰化物/亚铁氰化物)的较大程度的排斥,而这进而导致电子转移阻抗值(Rct)的较大增加。
图11?#20801;?#20102;阻抗式大肠?#21496;?#29289;种鉴定的剂量响应曲线,所述鉴定利用大肠?#21496;?#29305;异性PNA探针(P51)与未经扩增的不同浓度的大肠?#21496;?6S rRNA杂交进行。
图12?#20801;?#20102;与基因组DNA杂交之前和之后的EIS响应(电子转移阻抗值(Rct)),所述基因组DNA提取自不同量的抗甲氧西林金黄色葡?#20122;?#33740;(MRSA)细胞(105至108个细胞/ml模拟伤口液(MWF)),以?#37259;?#22312;MWF掺入的108个细胞/ml甲氧西林敏感性金黄色葡?#20122;?#33740;(MSSA)的基因组DNA和缓冲液对照温育组(2xSSC)作为对照。
图13?#20801;?#20102;用回收自MRSA的DNA模板进行的测试的qPCR结果。图中?#20801;?#20102;WF中的细胞/mL浓度v.s.循环阈值。
图14?#20801;?#20102;qPCR数据,该数据展示出在?#30001;?#21475;液中的108细胞/ml MRSA提取之后的gDNA产率的变化。
图15?#20801;?#20102;(A)原型恒电位仪的图片,和(B)在引入23bp完全互?#26500;?#26680;苷酸(1μM)之前和引入之后10分钟的Nyquist图。
图16A、B和C分别?#20801;?#20102;在95℃热处理0、1分钟和5分钟后的MRSA gDNA生物分析仪数据。
图17?#20801;?#20986;在不进行热处理、在95℃加热1分钟和95℃加热5分钟后的MRSA样品的琼脂糖凝胶电?#23613;?
图18?#20801;?#20986;对在用提取自107细胞/mL悬浮液的MRSA gDNA杂交之前和之后的PNA改性金电极进行的EIS测定的Nyquist图和Randles电路-RS=溶液电阻,CDL=双层电容,RCT=电荷转移阻抗,ZW=Warburg扩散元件。
图19?#20801;?#20986;响应于MRSA基因组DNA与含有4种不同间隔物的探针的温育的信号增加比,所述MRSA基因组DNA提取自浓度为107细胞/mL的细胞悬浮液;n=3且误差?#37232;?#26631;?#35745;?#24046;。
图20?#20801;?#20986;靶标尺寸对EIS信号的影响:对(A)提取的MRSA gDNA和(B)当MRSA gDNA在2xSSC中95℃温育5分钟时利用DNA12000?#32422;?#30418;可观察到DNA片段化的Agilent Bioanalyzer分析;(C)对于在2xSSC中95℃变性0、1分钟或5分钟后MRSA gDNA温育的EIS响应;n=3且误差?#37232;?#26631;?#35745;?#24046;。
图21?#20801;?#20986;(A)MRSA基因组DNA的剂量响应曲线(n=5,且误差?#37232;?#26631;?#35745;?#24046;;线?#37232;?MRSA细胞/mL+3标?#35745;?#24046;);和(B)?#37259;訫SSA、大肠?#21496;?#21644;MRSA的特异性和非特异性信号变化(n=3,且误差?#37232;?#26631;?#35745;?#24046;)。
图22?#20801;?#20986;与掺入人伤口液中的提取自MRSA细胞的gDNA、和未经接种的人伤口液温育所引起的信号增加比;样品添加后10分钟测定的信号增加比;n=3,且误差?#37232;?#26631;?#35745;?#24046;。
图23?#20801;?#20986;与从106细胞/mL悬浮液提取后的MRSA和大肠?#21496;鷊DNA接触之后的传感器行为;n=3,且误差?#37232;?#26631;?#35745;?#24046;。
本发明的所有方面的方法相比已知方法都具有许多特别的优点:与近患者环境需要相容的以数秒至数分钟计的快速的时间:结果比(TTR);接入不同探针-靶标体系的宽广适用性;与用于增强的数据收集的快速多正弦EIS具有相容性;与电子控制和测定具有EIS检测相容性;和无标记物的检测。
本发明的方法可以用于检测单个分析物或同时检测多种不同分析物。
优选地,本发明的方法是无标记物的方法,即,不需要为辅助检测而标记分析物。然而,在某些情形中,可以采用标记物。例如,当所述方法用于同时检测多种不同分析物时,可以将每种不同分析物以可与该分析物相关的一个或多个不同标记物进行标记。作为选择,可以通过空间分隔检测多种分析物,例如在表面上以阵列设置用于分析物的探针组。对多种不同分析物的检测也称为多路复检(multiplexing)。
在本发明的电化学检测方法中,在液体介质中的溶液或悬浮液中对分析物进行检测。液体介质不受特别限制,只要其适于利用EIS的分析即可。优选地,液体介质包含电解质?#28304;?#36827;EIS测定。电解质是含惰性离子的溶剂或缓冲液(例如,PBS);通常 然后以低得多的浓度添加氧化还原活性物种。电解质不受特别限制,并且可以包括本领域已知的任何电解质。然而,优选含过渡金属氧化还原体系的电解质,例如Fe(II)/Fe(III)电解质体系。特别优选[Fe(CN)6]3-/4-。
如果使用多种不同标记物来标记不同的分析物,可以将其用生物素化检测探针引入。优选地,每种标记物对于电化学检测方法具有不同的氧化电势,因此在所获得的数据中将产生不同的信号峰。例如,当使用金属纳米颗粒作为用于不同分析物的标记物时(见下文),对于每种分析物可以使用具有不同氧化电势的不同金属。
在优选实施方式中,施加至电极的交流电势不受特别限制,且取决于所采用的介质。因此,在实践中,EIS的最大可能幅度被溶剂极限所固定(对于水为约2V,给出的rms幅度为约1V至2V)。因此,在水性介质中,电势可以为+1.0V至+2.0V,且优选+1.2V至+1.8V。当在体系中使用氧化还原物种时,被氧化的物种和?#25442;?#21407;的物种都存在,这通常导致可使用小于250mV的幅度。在更优选的实施方式中,施加在两个电极间的交流电压的幅度为约10mV均方根(rms)。这使得响应对于例如等效电路分析能被线性化。可以使用更高幅度的响应(且如果要采用统计学方法来提取特征信号,其可能不同/有利)。
在优选实施方式中,电学检测方法在?#37202;?#19978;进行。在本发明的多路复检实施方式中,当将标记物用于光学检测时,可以在将分析物用不同标记物进行标记后在一个?#37202;?#19978;同时进行光学和电学检测。作为选择,?#24065;?#23558;分析物分为两个等分试样并分别标记时,可以将其在标记后合并进行在一个?#37202;?#19978;的光学和电学检测,或者可以在两个分开的?#37202;?#19978;分别进行光学和电学检测。
利用EIS可以?#28304;?#22312;的分析物的量进行定量。定量数据可以通过积分?#26377;?#21495;峰获得,即,确定所产生的每个信号峰的图下方的面积。
采用标记的实施方式
在本发明的一些优选实施方式中,采用了标记物,特别是当需要进行多路复检时。所指的标记物不受特别限制,且优选选自纳米颗粒、单分子、靶标的固有组分(如特定核苷酸或氨基酸)和化学发光酶。合适的化学发光酶包括HRP和碱性磷酸酶。特别优选荧光标记物,这?#19988;?#20026;该标记物的光学检测易于与本发明的电化学方法结合。
优选地,标记物是纳米颗粒。纳米颗粒在本发明的这些实施方式中特别有利,因 为其可在电学检测方法中成功地操作。纳米颗粒与表面的接近度不特别重要,这使得检测更为灵活。在优选实施方式中,纳米颗粒包含分子的集合,因为这比使用单分子时在光学和电学检测方法中产生更大的信号。
优选地,纳米颗粒选自金属、金属纳米壳、金属二元化合物和量子点。优选的金属或其它元素的实例是金、银、铜、镉、硒、钯和铂。优选的金属二元化合物和其它化合物的实例包括CdSe、ZnS、CdTe、CdS、PbS、PbSe、HgI、ZnTe、GaAs、HgS、CdAs、CdP、ZnP、AgS、InP、GaP、GaInP和InGaN。
金属纳米壳是包含由薄金属壳包围的芯纳米颗粒的球?#25991;?#31859;颗粒。金属纳米壳的实例是由薄金壳包围的硫化金或二氧化硅?#23613;?
量子点?#21069;?#23548;体纳米晶体,其是具有高吸光性的发光纳米颗粒(West J,Halas N,Annual Review of Biomedical Engineering,2003,5:285-292“Engineered Nanomaterials for Biophotonics Applications:Improving Sensing,Imaging and Therapeutics”)。量子点的实例是CdSe、ZnS、CdTe、CdS、PbS、PbSe、HgI、ZnTe、GaAs、HgS、CdAs、CdP、ZnP、AgS、InP、GaP、GaInP和InGaN纳米晶体。
可以将任何上述标记物附接至抗体。
标记物的尺寸优选?#26412;?#23567;于200nm,更优选?#26412;?#23567;于100nm,进而更优选?#26412;段?nm至50nm,进而更优选?#26412;段?nm至50nm,进而更优选?#26412;段?0nm至30nm,最优选为15nm至25nm。
?#21271;?#21457;明的方法用于检测多种分析物时,每种不同分析物用可与该分析物相关的一?#21482;?#22810;种不同标记物进行标记。在本发明的该方面,标记物可以因其组成和/或类型而不同。例如,?#21271;?#35760;物是纳米颗粒时,标记物可以是不同的金属纳米颗粒。当纳米颗粒是金属纳米壳时,芯和壳层的尺寸可以变化以产生不同标记物。作为选择或除此以外,标记物具有不同的物理性质,例如尺寸、形状和表面粗糙度。在一个实施方式中,标记物可以具有相同的组成和/或类型以及不同的物理性质。
用于不同分析物的不同标记物优选可在光学检测方法和电学检测方法中相互区分开。例如,标记物可以具有不同的发射频率、不同的散射信号和不同的氧化电?#21860;?
在本发明的采用标记物的实施方式中(例如多路复检),所述方法通常还包含将分析物用一?#21482;?#22810;种标记物进行标?#19988;?#24418;成经标记的分析物的额外初始步骤。
标记分析物的方式不受特别限制,且许多合适的方法是本领域已知的。例如,当 分析物是DNA或RNA时,可以通过在配体或?#20174;?#24615;位点进?#24615;?#20132;后标记或通过未标记的靶标与标记物-寡核苷酸缀合探针的“?#34892;摹?#26434;交来进行标记(Fritzsche W,Taton T A,Nanotechnology14(2003)R63-R73“Metal nanoparticles as labels for heterogeneous,chip-based DNA detection”)。
本领域已知有许多不同方法用于将寡核苷酸缀合至纳米颗粒,例如硫醇修饰的和二硫键修饰的寡核苷酸自发地结合至金纳米颗粒表面、二硫键和三硫键修饰的缀合物、寡聚硫醇-纳米颗粒缀合物和?#37259;訬anoprobe(纳米探针)的膦修?#25991;?#31859;颗粒的寡核苷酸缀合物(见Fritzsche W,Taton T A,Nanotechnology14(2003)R63-R73“Metal nanoparticles as labels for heterogeneous,chip-based DNA detection”中图2)。
在一个实施方式中,DNA或RNA链均可被生物素化。生物素化的靶标链可以与寡核苷酸探针涂布的磁珠杂交。然后可以使链霉亲和素涂布的金纳米颗粒与捕获的靶链结合(Wang J,Xu D,Kawde A,Poslky R,Analytical Chemistry(2001),73,5576-5581“Metal Nanoparticle-Based Electrochemical Stripping Potentiometric Detection of DNA hybridization”)。磁珠使得能够磁性去除未杂交的DNA。
为进行EIS步骤,必须使用电极对。电极对不受特别限制,但在典型实施方式中,其为丝网印刷电极或大型金电极,或作为选择,其为叉指形电极(IED)。电极的材料不受特别限制,只要其不会干扰当核酸分析物与电极表面上的PNA探针结合时发生的化学过程即可。通常,电极由如金等惰性金属形成。图8中?#20801;?#20102;金叉指形微型电极结构的掩膜布局,该微型电极结构包括4个装置?#37202;?#27604;对标记和加速提起(lift-off)处理的虚设金属线。每个电极上的指部(digit)的数目(N)优选为5至10。每个指部的长度优选为75μm至150μm。每个指部的宽度(W)?#36879;?#25351;部间的间隙的宽度(G)各自优选为1.5μm至10μm,且W和G优选相同。
下面将仅通过示例的方式来进一步描述本发明。
实施例
实施例1.用于多频率分析的EIS参数的研究
为?#25628;?#31350;用在本发明的一个方面中的最佳参数,可以采用任何EIS设定。然而,通常将采用参与最终分析的电极、电解质、液体介质、分析物(和探针(如果使用探针))以确保所述参数尽可能地接近最?#36873;?
在该实施方式中,研究了商购自Abtech的金叉指形电极(IDE)上的探针-靶标杂交。利用了电化学清洁循环,在30至40次完全循?#20998;?#20197;50mV的扫描速?#35782;?#22312;50mM的H2SO4水溶液中的IDE对中的两个电极?#38469;?#21152;–0.6V至+1.65V(相对Ag/AgCl)的线性电势扫描,直?#37327;吹角?#27905;金电极的稳定循环伏安图(CV)为止。在制备DNA(69聚体ITI021)溶液之前,通过在用5mM的TCEP溶液切割二硫键保护的核苷酸后使其通过MicroSpinTM G-25柱(Amersham Biosciences,Buckinghamshire,英国)以使DNA探针纯化。
?#28304;?#22411;金电极和叉指形微型电极(IME)在大频率?#27573;?#20316;Nyquist图,这些图如图1所示;每个图?#20801;?#20986;明显的互补性靶结合的信号。
对阳性对照(结合有互补靶标的探针)和阴性对照(仅探针或具有非互补靶标的探针)就源自?#37259;?#25239;(可写作x+iy,其中i为(-1)1/2)的参数进行比较。这些参数是:
·实数分量(x)
·虚数分量(y)
·模数或绝对值[r=|z|=(x2+y2)1/2]
·角[θ=tan-1(y/x)]
·主分量1
·主分量2
通过将其对频率的对数作图来就这些量的每一种研究上述差异。
图2?#20801;?#20986;对于大电极(大型电极)和小电极(叉指形微型电极),实数分量和模数提供了相似的信息并且最好地区分?#37259;?#38451;性对照和固定化的探针的EIS信号,特别是在频率?#27573;?#30340;?#31995;?#19968;端。虚数分量最好地在频率?#27573;?#30340;中段区分出EIS信号。
为了优化时间:结果比(TTR),本发明选择了对于所有实验条件可最好地区分不同的EIS数据并且不需要采用如等效电流等拟合模型的最有用的频率?#27573;?#21644;最小的测量数。本实施例中的统计分析使用阳性对照和固定化探针的EIS信号之间的倍数变化确定了大型金电极和叉指形微型电极(IME)的7点最佳频率?#27573;А?
结果总结在表1中。
表1:基于对互补杂交与不具有靶标的固定化探针的比较的大型电极和叉指形微型电极的7点最佳频率?#27573;?以Hz计)总结结果
信号类型点数目大型电极的最佳?#27573;?/ENTRY>IME电极的最佳?#27573;?/ENTRY>模数7[4,44][3,30]实数分量7[3,44][3,30]虚数分量7[30,338][13,150]
可以注意到,对于两种类型的电极,模数数据和实数分量给出非常相似的EIS测定的最佳频率?#27573;В?#20854;跨越大约一个十进位(decade)的频率。对于两种类型的电极,虚数分量在比实数和模数数据略高的频率给出最?#30740;?#21495;,其?#37096;?#36234;大约一个十进位的频率。大型电极与IME的电极尺寸的极大变化对于测定的最佳频率?#27573;?#20960;乎没有影响,这与响应极大独立于电极区域相一致,从而简化了EIS测定。利用倍数变化相对互补相对模拟杂交的差式分析给出与对互补杂交相对固定探针信号的差式分析相似的最佳频率?#27573;?表2),从而证?#30340;?#22815;使用相同的测定?#27573;А?
表2:基于互补相对模拟杂交比较的大型金电极的7点最佳频率?#27573;?以Hz计)
信号类型点数目最佳?#27573;?/ENTRY>模数7[4,44]实数分量7[3,30]虚数分量7[20,255]
为了使这些数据能快速获得,已采用多正弦?#38469;?#26469;同时施加所需的多个频率,用FFT分析结果并提取这些数据。图3?#20801;?#20102;EIS Nyquist图的比较,其比较了此前使用的连续应用单正弦的方法与蛋白大型电极实验系统的5重多正弦(跨一个十进位的频率)和15重多正弦(跨两个十进位的频率)的EIS测定的测定响应。对于连续应用(对于5正?#20197;?秒,对于15正?#20197;?3秒),在PC上于数分钟实现了实验数据采集、分析和展?#23613;?#35813;多正弦实验的组分频?#26102;?#36873;择来跨?#25509;?#32479;计分析所确定的频率?#27573;В?#21518;者跨越了所示EIS Nyquist图中的半圆形电荷转移特征。所有数据极为接近的对应性(通常在0.05%之内)表面多正弦EIS方法产生了与EIS测定和分析相容的更为快速的数秒计的EIS参数提取(因此也更为快速的TTR),而无需牺牲测定的精确度。
实施例2.利用EIS研究实施动力学测定
在本实施例中,研究了商购自Abtech的金IDE上的探针-靶标杂交动力学。利用了电化学清洁循环,在30至40次完全循?#20998;?#20197;50mV的扫描速?#35782;?#22312;50mM的H2SO4水溶液中的IDE对中的两个电极?#38469;?#21152;–0.6V至+1.65V(相对Ag/AgCl)的线性电势扫描,直?#37327;吹角?#27905;金电极的稳定循环伏安图(CV)为止。在制备DNA(69聚体ITI021)溶液之前,通过在用5mM的TCEP溶液切割二硫键保护的核苷酸后使其通 过MicroSpinTM G-25柱(Amersham Biosciences,Buckinghamshire,英国)以使DNA探针纯化。
清洁后立即将巯基-DNA探针层在室温浸入10μM的DNA在2xSSC中的溶液,[Fe(CN)6]3-和[Fe(CN)6]4-各为10mM(10mM[Fe(CN)6]3-/4-)。电极一经浸入所述DNA溶液则开始时EIS测定,并让其运行3至4小时。如前所述,在这些实验整个过程中,在直流电压为0V时对IDE对中的电极间施加10mV RMS幅度的正弦曲线电压,由于相同浓度的[Fe(CN)6]3-和[Fe(CN)6]4-的存在确保了每个电极的直流电势被固定在[Fe(CN)6]3-/4-的还原电?#21860;?#28982;后,将经改性的表面用洗涤数分钟,并在室温用1mM的MCH水溶液封闭30分钟。在2xSSC缓冲液中洗涤10分钟到20分钟后,再次测定10mM[Fe(CN)6]3-/4-2xSSC缓冲液中的电极EIS信号以检查封闭步骤后的变化。然后将电极浸入溶于2xSSC且含有10mM[Fe(CN)6]3-/4-的靶标(互补或非互补)DNA中以允许仍在0V交流电压进行EIS测定。
图4?#20801;?#20102;这些69聚体巯基-DNA改性的探针电极在与1μM的互补靶标(ITI025)杂交之前和之后的典型阻抗图。高频率半圆是大型电极和IDE电极的共同特征,并且给出关于穿过电极表面的探?#32957;?#23618;的电荷转移的信息。在添加1μM的互补靶标后,?#37238;?#39057;率半圆的?#26412;度?#39044;期地增加,这?#19988;?#20026;在探针层中互补靶标与探针结合,而同时?#31995;?#39057;率的扩散特征保?#21482;?#26412;不变,这表明(如同预期)对电极间的扩散几乎没有影响。
图5?#20801;?#20102;以同样方式制备的IDE的另一实例。在该情形中,在封闭后,执行了负对照:在含1μM非互补性靶标(ITI012)和10mM[Fe(CN)6]3-/4-的2xSSC溶液中进行数小时的EIS监测。如同预期,在阻抗信号中没有观察到变化,从而表明没有非互补性靶标探针的结合。其后,将电极在2xSSC缓冲液中润洗,并测定在1nM互补性靶标DNA和10mM[Fe(CN)6]3-/4-的2xSSC溶液中的响应。1小时后,当响应稳定时,将电极浸入50nM靶标溶液并测定过夜。探针与1nM靶标之间的差异小但显著,同时对于50nM则易于看到差异。因此,EIS利用已确立的等候平衡的方法探测了互补靶标结合。
图6?#20801;?#20102;典型的实时进行的EIS测定:对于探?#32957;?#24418;成和探针-靶标咋花敏感的参数是[Fe(CN)6]3-/4-的电子转移阻抗(Ret),这已通过?#39029;?#27599;个EIS谱的Nyquist图中的半圆形特征的宽度进行了计算。在该图中已将其(作为电子转移的Ret)作为时间的 函数作图。
这些数据信息丰富,并且?#20801;?#20986;探?#32957;?#30340;建立(菱形)、封闭和洗涤(正方形)和探针-靶标杂化的动力学(三角形)。当金电极接触探?#32957;?#28342;液(菱形)时,Ret的值在第一个小时左右因探?#32957;?#30340;形成而升高,然后在3至4小时后降至稳态值,从而表明表面膜稳定。这通过除去探针溶液并洗涤而得到证实,因为观测值几乎没有变化。添加巯基己醇(MCH)以封闭任何残留金表面?#24067;?#20046;没有导致阻抗的变化,如同在具有[Fe(CN)6]3-/4-的缓冲液中测定随时间变化的阻抗那样,这再?#27779;?#23454;探?#32957;?#30340;稳定。确立?#23435;?#23450;的探?#32957;?#21518;,使用动力学?#38469;?#26469;监测含有互补靶标和铁/亚铁氰化物的溶液中的探针-靶标结合。在?#22266;秸肽?#19982;该溶液接触时(三角形),看到了因互补靶标探针结合所致的Ret的即刻增加。初始响应立刻发生,第一点?#20801;?#20986;Ret的增加且在一小时内其值不止翻了一番。
该方法使得能够每隔数秒进行EIS响应的动力学测定(参见多正弦IDF)。通常预期探针-靶标结合的增加速率是关于靶标浓度的一?#31471;?#29575;(?#27604;?#20063;就依赖于靶标浓度);因此,可以在数秒至数分钟的时间规模上进行EIS的增加速率分析以得到靶标浓度。令人满意的是,在此后数小时中阻抗增加变慢,从而?#20801;?#20986;长时间达到平衡响应的方法限制了平衡测定的TTR。在除去靶标溶液、洗涤并测定具有[Fe(CN)6]3-/4-的缓冲液中的响应(圆圈)时,在Ret瞬时变化后,值开始返回此前观测到的值,从而表面该响应指示着探针-靶标结合。
为了证实金电极上已发生探针层形成和杂交,使用了生物素标记的靶标,然后与链霉亲和素标记的Qdot(QD缓冲液中20nM)温育(在室温1小时)。
从所得荧光图像(图7)显而易见,如同预期,最高荧光强度的区域处于IDE的金指部。这证实杂交后观察到的Ret的增强是由于金IDE表面上的膜中的探针-靶标杂交所致。
实施例3.DNA和PNA探针的比较
DNA探针用EIS规程(图9)
清洁后,在30℃将金大?#22242;?#24335;电极(macrodisk electrode)与200nM巯基修饰寡核苷酸溶液+800mM巯基己醇的溶液在1M NaCl+5mM MgCl2+1mM EDTA中温育16小时。巯基修饰的寡核苷酸由制造商以具有?#24358;一?#20445;护基的二硫化物提供。在固 定?#24052;?#36807;与5mM TCEP温育30分钟随后用Illustra spin G-25微色谱柱(GE Healthcare)进行凝胶提取清洁而将所述?#24358;一?#20445;护基除去。将具有固定的探针的电极用1mM巯基己醇水溶液在30℃封闭1小时。然后用固定缓冲液(1M NaCl+5mM MgCl2+1mM EDTA)、1x PBS和1x PBS+10mM EDTA各自洗涤电极10分钟。
用具有Ag/AgCl参比电极和铂丝反电极(两者均?#37259;訫etrohm(Runcorn,英国),在杂交之前和之后与Autolab恒电位仪(Metrohm,Runcorn,英国)相连)的三电极系统进行EIS测定。在1mM K3[Fe(CN)6]+60mM KCl中于100,000Hz至0.1Hz(15?#21046;?#29575;)的频率?#27573;?#20197;10mV的幅度于0.24V进行EIS测定。电极分别与2xSSC中的1μM互补性人工靶标(20聚体寡核苷酸)在50℃杂交2小时和与不具有靶标的仅杂交缓冲液(阴性对照)杂交。在杂交后,用2xSSC、0.2xSSC溶液和EIS测定缓冲液各洗涤电极10分钟。
PNA探针用EIS规程(图10)
清洁后,将金大?#22242;?#24335;电极与1.5μM巯基修饰的PNA溶液+30μM巯基己醇在50%(v/v)DMSO中的溶液在30℃温育10分钟后在30℃温育16小时。将电极用50%(v/v)DMSO润洗并在50%(v/v)DMSO中的1mM巯基己醇中于30℃温育1小时。然后用50%(v/v)DMSO和EIS测定缓冲液(0.1mM K3[Fe(CN)6]+10磷酸?#20301;?#20914;液各自洗涤电极10分钟。
用具有Ag/AgCl参比电极和铂丝反电极(两者均?#37259;訫etrohm(Runcorn,英国),在杂交之前和之后与Autolab恒电位仪(Metrohm,Runcorn,英国)相连)的三电极系统进行EIS测定。在0.1mM K3[Fe(CN)6]+10磷酸?#20301;?#20914;液中于100,000Hz至0.1Hz(15?#21046;?#29575;)的频率?#27573;?#20197;10mV的幅度于0.24V进行EIS测定。
电极分别与2xSSC中的1μM互补性人工靶标(20聚体寡核苷酸)和1μM非互补性人工靶标(20聚体寡核苷酸)在50℃杂交2小时和与不具有靶标的仅杂交缓冲液(阴性对照)杂交。在杂交后,用2xSSC、0.2xSSC溶液和EIS测定缓冲液各洗涤电极10分钟。
实施例4.大肠?#21496;鷕RNA的检测(图11)
采用PNA探针的RNA检测的EIS规程
清洁后,将金大?#22242;?#24335;电极与1.5μM巯基修饰的PNA溶液+30μM巯基己醇在50%(v/v)DMSO中的溶液在30℃温育10分钟后在30℃温育16小时。将电极用50%(v/v)DMSO润洗并在50%(v/v)DMSO中的1mM巯基己醇中于30℃温育1小时。然后用50%(v/v)DMSO和EIS测定缓冲液(0.1mM K3[Fe(CN)6]+10磷酸?#20301;?#20914;液各自洗涤电极10分钟。
用具有Ag/AgCl参比电极和铂丝反电极(两者均?#37259;訫etrohm(Runcorn,英国),在杂交之前和之后与Autolab恒电位仪(Metrohm,Runcorn,英国)相连)的三电极系统进行EIS测定。在0.1mM K3[Fe(CN)6]+10磷酸?#20301;?#20914;液中于100,000Hz至0.1Hz(15?#21046;?#29575;)的频率?#27573;?#20197;10mV的幅度于0.24V进行EIS测定。
电极与2xSSC中的核酸靶标溶液在50℃杂交2小时。将提取?#28304;?#32928;?#21496;?#30340;核糖体16S RNA用作全长rRNA。在杂交后,用2xSSC、0.2xSSC溶液和EIS测定缓冲液各洗涤电极10分钟。
RNA提取规程
·用?#37259;訪B琼脂板的大肠?#21496;鶧H10β菌落接种2.5mL Luria-Bertani(LB)培养基(10g/L Bacto-胰蛋白胨,5g/L酵母菌提取物,10g/L NaCl)并在振摇式温育器中于37℃温育16小时
·制备含15mg/ml溶菌酶的TE缓冲液
·向1体积的细菌培养物中添加2体积的RNA包含细菌?#32422;?#24182;立即旋摇,然后在室温温育5分钟
·在13,500rpm离心10分钟并除去上清液
·向200μL的含溶菌酶的TE缓冲液中添加10μl至20μl QIAGEN蛋白酶K并通过移液吸取(pipetting)将颗粒重悬
·在室温的滚轴混合器中温育30分钟
·添加700μL缓冲液RLT并剧烈旋摇。如果存在白色沉淀则在13,500rpm离心并在以下步骤中使用上清液
·添加500μL100%乙醇并剧烈震振摇
·将700μl裂解物转移至2ml收集管中的RNeasy Mini离心柱(spin column)并在13,500rpm离心30秒。弃去流通液(flow through)并添加参与样品并再次离心。弃去 流通液
·向离心柱添加350μL RW1并在13,500rpm离心30秒并弃去流通液
·将10μl DNA酶I储备溶液与70μl缓冲液RDD混合,?#37259;?#24182;离心。将上述80μl溶液直接添加至柱并在室温温育15分钟
·向RNeasy离心柱添加350μl缓冲液RW1并再温育5分钟
·在13,500rpm离心30秒,弃去流通液
·将柱转移至2ml试管并向柱添加500μL RPE缓冲液。在13,500rpm离心30秒
·重复该步骤且在13,500rpm离心2分钟
·将rRNA以30μL去离子水洗脱并利用Nanodrop进行定量
实施例5.利用本发明的方法的MRSA gDNA检测(图12)
将金电极用在具有铂反电极和银/氯化银参比电极的三电极体系中。通过在0.1M H2SO4中以0.1V/s的扫描速率扫描0至1.6V的电势10次并扫描0至1.3V的电势10次来以循环伏安法清洁金电极表面。在金大型电极的情形中,在规程中于循环伏安法之前包括额外清洁步骤,其为1)用氧化?#20004;?#36827;?#26800;?#26497;抛光和2)将电极浸没于piranha溶液中10分钟。
一旦经清洁,将金电极与含1.5μM巯基修饰PNA溶液+30μM巯基己醇的50%(v/v)DMSO溶液温育16小时。然后通过将电极在1mM巯基己醇中温育1小时来进行封闭。封闭完成后,将电极在50%DMSO中洗涤2小时并在EIS测定缓冲液(0.1mM K3[Fe(CN)6]+0.1mM K4[Fe(CN)6]+pH7.010mM磷酸?#20301;?#20914;液)中洗涤。
为了获得抗甲氧西林金黄色葡?#20122;?#33740;(MRSA)和甲氧西林易感性金黄色葡?#20122;?#33740;(MSSA),将gDNA细菌在Columbia血琼脂上亚培养并在CO2氛围中于37℃过夜温育。将细胞接种至盐水中并利用Densicheck(bioMerieux)测定光学密度。这给出以McFarland单位计的值,其与悬浮液中的细菌细胞浓度成比例。以这?#22336;?#24335;制备了约108细胞/mL的盐水溶液中的细菌细胞悬浮液或模拟伤口液(MWF),并从该悬浮液制备了?#27573;?#20302;至102细胞/mL的10?#26029;?#37322;液。
通过将1mL悬浮液于5000x g离心10分钟来使细菌细胞沉淀。弃去上清液并将细菌颗粒重悬在200μL的酶促裂解缓冲液(2x TE缓冲液,1.2%Triton X,50μg/mL 溶葡?#20122;?#33740;素)中,其后在37℃温育30分钟。将200μL细菌裂解物添加至20μL蛋白酶K并用bioMerieux NucliSens easyMAG自动化平台提取DNA。胍硫氰酸盐是裂解缓冲液中的活?#28304;?#28342;?#31890;?#20854;充当在将核酸从细胞材料中纯化和提取时的蛋白变性剂。然后在不使磁性二氧化硅颗粒移位的情况下从容器中?#35889;?#32431;化的核酸溶液,DNA在100μL水中洗?#36873;?
在0.1mM K3[Fe(CN)6]+0.1mM K4[Fe(CN)6]+10mM磷酸?#20301;?#20914;液中使用100,000Hz至0.1Hz(15?#21046;?#29575;)的频率?#27573;?#20197;10mV rms的幅度于0.24V的直流电势进行EIS测定。MRSA gDNA样品通过将45μL样品与5μL20xSSC混?#20808;缓?#22312;95℃加热5分钟、在冰上储存2分钟并在25℃加热5分钟来制备。电极与样品在振摇下(650rpm)在55℃温育2小时。在与样品温育后,将电极用2xSSC、0.2xSSC溶液和EIS测定缓冲液各洗涤10分钟。EIS测定在杂交前和杂交后进行。
模拟伤口液(MWF)的制备
林格氏(Krebs)溶液:
·118.4mM NaCl(mwt58.44~6.91g/l)
·4.7mM KCl(mwt74.56~0.350g/l)
·2.52mM CaCl2(mwt147.02~0.370g/l)
·1.18mM MgSO4(mwt246.5~0.290g/l)
·1.18mM KH2PO4(mwt136.09~0.160g/l)
·25mM NaHCO3(mwt84.01~2.10g/l)
·pH7.4
将所有成分溶解在900ml的去离子水中并将溶液pH调节至7.4。用去离子水将体积调节至1升,并在使用前验证pH。将林格?#20808;?#28082;以1:1与胎牛血清(Gibco ref16000-036)混合以产生模拟伤口液。
实施例6.在线EIS实验
电极制备和测定信息
为进行在线检测,从DropSens(Oviedo,西班牙)购买了丝网印刷的金电极(工作电极?#26412;?.6mm)。每个电极通过循环伏安法在0.1M H2SO4?#24615;?#20808;清洁。在0至1.6V 扫描电极电势20次循环,并小心以移液管移除表面上形成的任何气泡。然后在0.1M H2SO4中进?#26800;?#20108;轮清洁,其?#24615;?#27425;执行循环伏安法,此次将电极在0至1.3V的电势扫描20次循环。最后,将电极用去离子水彻底润洗并在氮气流下干燥。清洁后,在湿润的腔室中将丝网印刷电极与1.5μM巯基修饰的PNA溶液+30μM巯基己醇的50%(v/v)DMSO溶液于室温温育16小时。为将表面封闭,将电极在50%(v/v)DMSO中润洗并在50%(v/v)DMSO中的1mM巯基己醇中在湿润的腔室中于室温温育1小时。最后,将电极用50%(v/v)DMSO和EIS测定缓冲液(0.1mM K4[Fe(CN)6]+0.1mM K3[Fe(CN)6]+pH7.010mM磷酸?#20301;?#20914;液)洗涤。利用连接至Autolab恒电位仪的丝网印刷电极(WE–Au,CE–Pt,RE–Ag)进行在线EIS测定。在0.1mM K4[Fe(CN)6]+0.1mM K3[Fe(CN)6]+pH7.010mM磷酸?#20301;?#20914;液中使用100,000Hz至0.1Hz(15?#21046;?#29575;)的频率?#27573;?#20197;10mV rms的幅度于0.03V的直流电势进行EIS测定。
DNA片段化实验
对热预处理后的DNA样品行为进行了分析。这?#37259;?#26159;为了?#31169;?#26679;品片段化是否影响EIS结果。这些实验在Agilent2100Expert Bioanalyzer(Agilent Technologies;Palo Alto,CA,美国)上进行。通过在包括?#20811;?#21644;2xSSC在内的各种溶液中于95℃加热0、1分钟或5分钟来制备分离的细菌gDNA样品。在处理后,将1μL样品加载于DNA500Labchip?#32422;?#30418;(Agilent Technologies;Palo Alto,CA,美国)的各孔中。每个?#37202;?#21547;12个孔且在电泳前根据需要加载。在自动化电泳程序完成后,利用专有软件分析结果。这使得能分辨和定位每个峰并?#19968;?#20801;许通过积分来?#19994;?#23792;面积而对DNA进行定量。
间隔物分子的化学结构
在PNA探针中加入了间隔物分子以便改善电极表面的杂交效率。AEEA(探针01)和AEEEA(探针02)?#21494;?#37255;连接子的化学结构如下:

AEEA连接子:1.3nm,9原子

AEEEA连接子:1.8nm,12原子
结果
gDNA样品的qPCR和定量
以两?#22336;?#24335;制备基因组DNA:
1)从掺入伤口液中的108细胞/mL(1McFarland标准)的MRSA样?#20998;?#25552;取gDNA。然后将所得DNA以1:10连续稀释以得到相当于108细胞/mL至102细胞/mL的浓度?#27573;А?
2)将MRSA以108细胞/mL在伤口液中培养,然后在伤口液中以1:10连续稀释以得到等于108细胞/mL至102细胞/mL的制备物?#27573;А?#23545;每种浓度的MRSA执行DNA提取方法。
然后利用两?#22336;?#27861;?#36816;?#21046;备的样品进行qPCR,且发现循环阈值更低且?#20801;?#20986;更大的?#37259;?#21033;用方法1制备的样品的线性度。这意味着对提取自108细胞/mL的培养物的gDNA的稀释产生了比通过稀释MRSA培养物然后进行DNA提取更为可靠的稀释系列。结果如图13所?#23613;?
为了更好地理解在EIS数据中观察到的任何变化,利用NanoDrop分光光度计对基因组DNA提取物进行定量(见表3)。可以看出,MRSA基因组DNA的产率?#20801;?#20986;随着?#37259;?#20165;人伤口液的回收DNA的水平而显著变化。DNA提取过程的异源性性质可能对在EIS数据中观察到的变化有贡献。?#38597;?#21147;确保数据的良好再现性。如图14所示(图14?#20801;玖苏?#31034;出?#30001;?#21475;液的108细胞/mL MRSA提取后的gDNA产率的变化的qPCR数据),?#37259;?#21333;批伤口液的再现性良好。批次间的变化较大,这可能归因于人伤口液的多变本质和其它实验因素,例如MRSA的聚结和用溶葡?#20122;?#33740;素对MRSA细胞壁进行酶促消化的过程中固有的变化性。
表3.利用NanoDrop的MRSA总DNA定量

就地检验用原型恒电位仪
考虑到就地检验(point of care testing),设计并组装了原型恒电位仪。所述恒电位仪利用总?#37319;?#20110;200美元的零件组装,并且能测定在100,000Hz至0.1Hz的频率?#27573;?#20869;的相位和量级变化。所述系统最初利用完全互补的短人工靶标进行评估,且发现在添加靶标后能观察到电荷转移阻抗的增加。图15?#20801;?#20102;(A)原型恒电位仪的图像,和(B)在引入23bp完全互?#26500;?#26680;苷酸(1μM)之前和引入后10分钟的Nyquist图。
DNA片段化
图16A、B和C?#20801;?#20102;分别在95℃热处理0、1分钟和5分钟后的MRSA gDNA生物分析仪数据。可以看出,热变性时间与更小的DNA片段的产生相一致。还通过凝胶电泳分析了类似样品(图17),并且虽然从热处理的片段观察到了DNA片段化,但由于样品的拖尾(smearing)而无法进行尺寸分级。
实施例7.其它EIS实验
材料与方法
DNA寡核苷酸购自Metabion(Martinsried,德国)。PNA寡核苷酸经Cambridge Research Biochemicals(Cleveland,英国)从Panagene(Daejeon,韩国)订购。PCR?#32422;?#30418;和DNeasy血液及组织?#32422;?#30418;购自Qiagen(Crawley,英国)。铁氰化钾、亚铁氰化钾、柠檬酸钠盐水(SSC)、磷酸一?#21860;?#30967;酸二钠和二甲亚砜(DMSO)购自Sigma Aldrich (Poole,英国)。Λ核酸外切酶(Epicentre Biotechnologies,Madison,WI,美国)。在整个研究中使用去离子水(>18MΩ)。
表4.研?#31185;?#38388;使用的寡核苷酸的序列和结构

从金黄色葡?#20122;?#33740;提取DNA
将gDNA细菌在Columbia血琼脂上亚培养并在5%CO2氛围中于37℃过夜温育。将细胞接种至盐水中并利用Densicheck(bioMerieux)测定光学密度。这给出以McFarland单位计的值,其与悬浮液中的细菌细胞浓度成比例。以这?#22336;?#24335;制备了约108细胞/mL的细菌细胞悬浮液,并从该悬浮液制备了?#27573;?#20302;至102细胞/mL的10?#26029;?#37322;液。进行实时PCR以对?#37259;?#31232;释系列的DNA产率进行表征。
通过将1mL悬浮液于5000x g离心10分钟来使细菌细胞沉淀。弃去上清液并将细菌颗粒重悬在200μL的酶促裂解缓冲液(2x TE缓冲液,1.2%Triton X,50μg/mL溶葡?#20122;?#33740;素)中,其后在37℃温育30分钟。将200μL细菌裂解物添加至20μL蛋白酶K并用bioMerieux NucliSens easyMAG自动化平台提取DNA。胍硫氰酸盐是裂解缓冲液中的活?#28304;?#28342;?#31890;?#20854;充当在将核酸从细胞材料中纯化和提取时的蛋白变性剂。然后在不使磁性二氧化硅颗粒移位的情况下从容器中?#35889;?#32431;化的核酸溶液,DNA在100μL水中洗?#36873;?
电化学阻抗谱(EIS)
金圆片电极(?#26412;?mm)购自IJ Cambria Scientific(Carms,英国)。通过用0.05μm氧化铝粉(IJ Cambria Scientific(Carms,UK)机械抛光1分钟、用水润洗并浸渍在超声水浴中1分钟(以除去任何残留氧化铝)来彻?#33258;?#28165;洁每个固体金工作电极,并最终在piranha溶液(6mL浓H2SO4+2mL30%(v/v)H2O2溶液)中清洁10分钟。然后将电极彻底地用水洗涤并在氮气流下干燥。清洁后,将金圆片电极与含1.5μM巯基修饰PNA溶液+30μM巯基己醇的50%(v/v)DMSO溶液在30℃温育16小时。将电极在50%(v/v)DMSO中润洗并在1mM巯基己醇的50%(v/v)DMSO溶液中于30℃温育1小时。然后将电极用50%DMSO和EIS测定缓冲液(0.1mM K3[Fe(CN)6]+0.1mM K4[Fe(CN)6]+10mM磷酸?#20301;?#20914;液)中分别洗涤2小时和1小时。
分批?#31995;?#26816;测的EIS测定利用三电极体系进行,该三电极体系具有Ag/AgCl参比电极和铂丝反电极(两者均?#37259;訫etrohm(Runcorn,英国),与运行FRA软件的Autolab恒电位仪(Metrohm,Runcorn,英国)相连)。在0.1mM K3[Fe(CN)6]+0.1mM K4[Fe(CN)6]+10mM磷酸?#20301;?#20914;液中使用100,000Hz至0.1Hz(15?#21046;?#29575;)的频率?#27573;?#20197;10mV rms的幅度于0.24V的直流电势进行EIS测定。DNA样品通过将45μL样品与5μL20xSSC混?#20808;缓?#22312;95℃加热5分钟、在冰上储存2分钟并在30℃加热5分钟来制备。电极与样品在振摇下(650rpm)在55℃温育2小时。在与样品温育后,将电极用2xSSC、0.2xSSC溶液和EIS测定缓冲液各洗涤10分钟。EIS测定在杂交前和杂交后进行。
在线检测通过记录利用丝网印刷电极的连续EIS测定来进行。从Schott Nexterion16孔自粘式超结构(Stafford,英国)切下一个单孔并适配至电极,该电极中存在50μL的EIS测定缓冲液。用?#37259;許chott Nexterion16孔自粘式超结构?#32422;?#30418;(Stafford,英国)的粘性盖密封。将45μL样品与5μL的10x EIS测定缓冲液混合,并通过在95℃加热5分钟、在冰上储存2分钟并在30℃加热5分钟来预处理。一旦制得样品,从电极表面除去EIS测定缓冲液并以50μL样品+测定缓冲液溶液替代。将粘性盖重新密封并继续EIS测定。
结果和讨论
在此前的研究中,鉴定出了mecA基因的探针序列并针对550碱基对mecA PCR产物的阻抗计检测进行了优化。据发现该探针(P48)对微阵列系?#25345;?#30340;DNA形式的5’ 构型的mecA序列的结合以及对EIS测定的PNA形式的mecA序列的结合最为有效。
分批?#31995;?#26816;测形式中的?#37259;訫RSA的基因组DNA直接检测
在杂交前和杂交后进行EIS测定并以Nyquist图形式记录(见图18)以便获取电荷转移阻抗(RCT)的值。在与提取自107细胞/mL的悬浮液的MRSA gDNA温育后,发现RCT的显著增加是显而易见的(见图18)。为了获得RCT的值,利用Randles电路(图的顶部)和FRA Autolab软件中的拟合函数对数据进行拟合。与拟合RCT相关的不确定性对于报道的实验在6%至12%?#27573;?#20869;。对于特定浓度的gDNA,将杂交后获得的RCT值除以杂交前获得的值。这种表达数据的方法提供了信号增加的量度,后者校正了RCT起始值的变化。?#20801;?#36825;些数据的图的y轴称为?#38774;?#21495;增加?#21462;薄?#31867;似的表现杂交诱导的阻抗增加的方法已在期刊公开物种被采用。当使用到时,标?#35745;?#24046;(S.D)被定义为方差的平方根。
杂交效率——在探针序列中引入不同间隔物的影响
在微阵列和其它基于表面的DNA检测?#38469;?#20013;,可以通过提高表面探针对溶液中物种的可及性来改善DNA杂交的动力学。杂交动力学易于受到与电极表面邻近的探针序列的阻碍,因此测试了三种探针(01、02和03)在与浓度为107细胞/mL的MRSA gDNA杂交后的响应,所述三种探针具有与原始探针(P48)相同的序?#26800;?#21547;有额外的间隔物设?#21860;?#25506;针间隔物的?#38468;?#22914;表4所?#23613;EEA缩写用于表示含有两个?#21494;?#37255;单元的连接子,而AEEEA缩写表示含三个?#21494;?#37255;单元的连接子。间隔物分子的化学结构是上文已描述过的那些。
图19?#20801;荊?#22312;受测的4种探针中,探针P48_02在样品温育后?#20801;?#20986;最大的信号增加?#21462;11间隔物(在其主链具有11个C原子的间隔物)证实在?#37274;?#31350;中在试图改善固体-液体界面的DNA结合动力学时最为有效。C11间隔物对DNA结合动力学的增强可归因于更为紧密堆积且更为有序的混合膜的形成,且据信可能的解释是由于?#37259;訡11间隔物的范德华力的增加。此外,长的PEG分子与C11间隔物的结合使用使得探针分子具有良好的柔性并确保探针序列能突出于涂覆电极表面的烷硫醇膜。对于其余研究,采用探针P48_02作为电极表面的识别元件。
杂交效率——DNA片段化在检测性能中的作用
在这些实验中将?#37259;?#20110;107细胞/mL培养的细菌的样品与电极温育2小时,然后洗涤和进行测定。伴随进行凝胶电泳实验,其中对样品变性期间的DNA片段化程度进行了评估。这通过将MRSA gDNA样品(107细胞/mL)在?#20811;?#25110;2xSSC中于75℃或95℃加热0、1和5分钟的时长来进行。发?#20540;?#26679;品在2xSSC中于95℃加热5分钟时,发生了可观察到的片段化(见图20A和20B)。MRSA基因组大约为2.8Mb。提取自MRSA的未经处理的gDNA含有1000bp至15000bp?#27573;?#20869;的大片段,且在热变性5分钟后观察到的片段据发?#21046;?#22343;约为120bp。
从图20可以看出,在基因组DNA在95℃在2xSSC中变性5分钟的同时,DNA片段化增加且阻抗信号增加。已对具有长杂交时间的玻璃微阵列评估了DNA片段化的作用,但迄今还没有研?#25239;鼶NA片段化对于阻抗计检测的基因组DNA结合的作用。已知DNA在如95℃等高温的温育导致长链DNA的片段化并?#26723;蚉CR效率。据?#20801;荊?#28909;DNA片段化产生小于800bp的链。在该测试中热变性后获得的DNA可以为单链,因此使其在电泳后的尺寸分级使显?#37238;?#30701;。据信95℃温育使高分子量MRSA gDNA片段化,且这导致阻抗信号的增加。在已经理解了间隔物选择和DNA片段化的作用后,并采用可提供DNA靶标的?#23454;背?#23544;的毛细管凝胶电泳测定,设计并评估了用于MRSA gDNA的检测。
用于MRSA gDNA的分批端点检测的开发
开发了MRSA gDNA分批端点检测。采用5分钟的DNA变性时间,以便实现?#37259;源?#32928;?#21496;?#30340;gDNA的片段化和非特异性序列,还测试了甲氧西林易感性金黄色葡?#20122;?#33740;(MSSA)从而能够评估检测的特异性。受测的MRSA的浓度?#27573;?#22312;103细胞/mL至108细胞/mL。
图21A?#20801;荊?#21487;以在从掺入盐水的MRSA细胞提取的DNA后检测MRSA gDNA杂交。使用?#37259;?MRSA细胞/mL加3个标?#35745;?#24046;的信号增加比的定义,L.O.D为106细胞/mL。该结果的重要性在于?#29575;?#19978;可以在不对提取的DNA进行PCR的情况下检测mecA基因的杂交。?#37259;?#22312;106细胞/mL掺入并提取的样品的mecA基因的最大浓度为约500fM。
为了证实MRSA gDNA用检测的特异性,在处于与MRSA测试中相当浓度的大 肠?#21496;鷊DNA和MSSA gDNA存在下对探针修饰的电极进行温育。图21(B)?#20801;?#20986;从这种温育引起的信号增加,且可以看出在存在大肠?#21496;?#21644;MSSA gDNA时没有观察到这些信号增加。3pM至6pM的浓度相当于提取自107细胞/mL的细菌悬浮液的DNA产率。
?#37259;圆?#20837;人伤口液的样品的在线MRSA gDNA检测和特异性测试
就就地检验而言,实时地在干扰性基质的存在下检测gDNA结合的能力意味着极大的优?#21860;?#32771;虑及此,将检测从金大型圆片电极转移?#20102;?#32593;印刷电极,在丝网印刷电极上可以在室温以小体积引入样品。丝网印刷电极的另一优势在于其价格(每件小于3美元),这使其在就地检验中成为具有吸引力的组件。在这些实验中,以连续方式进行了EIS测定,并大约每2分钟产生完全Nyquist图。将100μL的EIS测定缓冲液在电极上温育,并在一系列基线测定后,将其替代为100μL的预先加热变性的MRSA gDNA(在95℃变性5分钟)或经相似处理的提取自伤口液制备物的人DNA。将电荷转移阻抗对时间作图,并可以测定在添加样品后的不同时间点的信号增加比(图22),并由此获得与DNA杂交过程相关的结?#31995;任?#32447;(图23)。
从图22可以看出,掺入人伤口液并从其回收的MRSA gDNA比提取自人伤口液的系列稀释液的DNA样品大得多的阻抗信号增加。因此,以这?#20013;?#24335;,可以测定由提取的人DNA造成的高于背景信号的MRSA gDNA杂交。图23?#20801;?#20986;,当将相等量的MRSA和大肠?#21496;鷊DNA添加至传感器时,在此情形中可以区分特异性和非特异性的结合。这些结果的重要性在于,?#29575;?#19978;MRSA检测可以?#20801;?#22312;检测时间短得多的在线测试中。例如,图22中的数据?#20801;?#26679;品添加后10分?#26377;?#21495;增加,而图23?#20801;?#20165;在添加样品后大约5分钟,添加MRSA和大肠?#21496;?07细胞/mL后的结合曲线的分歧就显而易见。
在更广的背景下,这些结果?#20801;荊?#21487;以在不通过使用纳米结构或聚合物层进?#26800;?#26497;修饰的情况下进行MRSA gDNA检测。另外,已经采用如金纳米颗粒和蛋白G等信号增强策略作为通过EIS检测PCR产物杂交的可能方法。本文详细描述的电极制备过程的相对简化和不存在基于蛋白或纳米颗粒的信号放大步骤是超越血多其它电化学检测方案的优点。
关于间隔物选择和靶标片段化时间的数据?#20801;荊?#25506;针长度、片段长度和EIS信号 之间存在关联。片段化数据表明,长度约为120bp的靶链长度有助于EIS信号增加。关于基于EIS的核酸检测的许多文献报道了用短(约20bp)人工寡核苷酸获得的结果。
已经实现了目前的检测方案的相对简化(和?#29575;?#19978;具有与实验?#28082;?#30005;位仪的良好等同性的原型便携式恒电位仪与丝网印刷电极相容?#39029;杀镜?#20110;200美元),这意味着所述检测已准备好在就地护理境况中实施。
总结
已经展示出一种用于MRSA的无标记检测的灵敏且特异性的生物传感器。PNA探针序列的使用使得能够进行MRSA基因组DNA的灵敏检测,且该检测不需要PCR扩增步骤。据?#20801;荊珼NA片段化和探针序列距电极表面的距离在检测性能方面是重要因素。发?#21046;?#27573;的长度约为120bp,这比EIS研究中通常报道的DNA序列更长。MRSA gDNA的检测据?#20801;?#21487;以在大型金电极的分批检测中进行和在丝网印刷电极上以在线形式进行。此外,可以在从如人伤口液等干扰性基质中提取DNA时进行检测。

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