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一种高产乙醇的双细胞连续发酵方法.pdf

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一种 高产 乙醇 细胞 连续发酵 方法
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摘要
申请专利号:

CN201910103169

申请日:

20190201

公开号:

CN109593792A

公开日:

20190409

当前法律状态:

公开

有效性:

审中

法?#19978;?#24773;: 公开
IPC分类号: C12P7/06;C12P39/00;C12R1/07;C12R1/89 主分类号: C12P7/06;C12P39/00;C12R1/07;C12R1/89
申请人: 盐城工学院
发明人: 倪浩;吴小虎;陈云;姜桂颖;朱维民
地址: 224051 江苏省盐城市希望大道中路1号
优先权:
专利代理机构: 32200 代理人: 楼高潮
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法律状态
申请(专利)号:

CN201910103169

授权公告号:

法律状态公告日:

20190409

法律状态类型:

公开

摘要

本发明公开了一种高产乙醇的双细胞连续发酵方法,首先采用种子培养基培养解淀粉芽孢?#21496;?#21644;小球藻发酵种子,最后采用双细胞共培养发酵培养基发酵生产并收集乙醇。该工艺种子培养过程中,解淀粉芽孢?#21496;?#21644;小球藻生长?#26438;?#19988;最终细胞浓度较高。该工艺发酵过程中发酵培养基成分简单,无需添加碳源、维生素、氨基酸等微量元素,工艺控制简单,菌株发酵性能稳定,乙醇产量达到11.2g/L,实现了光能向化学能的高效生物转化。

权利要求书

1.一种高产乙醇的双细胞连续发酵方法,其特征在于,包括以下步骤: 步骤1)采用种子培养基培养解淀粉芽孢?#21496;?#21644;小球藻发酵种子,其中解淀粉芽孢?#21496;?#22521;养温度为28℃,摇床转速160r/min,培养时间24h;小球藻培养温度为25℃,光照静置培养,培养时间5~7d; 步骤2)按1:1的体积比混合步骤1)得到的解淀粉芽孢?#21496;?#21644;小球藻种子培养液作为发酵种子液; 步骤3)将发酵种子液按10%的接种量接种至发酵培养基?#24076;?#36827;行双细胞共培养发酵生产并收集乙醇,发酵过程温度为28℃,采用气升式发酵罐,50%氨水控制pH 7.0,通气量5L/s,发酵至第七天结束,发酵制得的乙醇经提取后可剩余发酵液。 2.根据权利要求1所述的一种高产乙醇的双细胞连续发酵方法,其特征在于,所述解淀粉芽孢?#21496;?#30340;种子培养基成分为:胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,氯化钠10g/L;所述小球藻的种子培养基成分为?#28009;?#33796;糖10g/L,硝酸钾1.011g/L,磷酸二氢钠0.907g/L,磷酸氢二钠0.946g/L,硫酸镁0.246g/L,氯化钙0.015g/L,硫酸亚铁0.007g/L,硫酸锌0.0003g/L,硫酸锰0.0002g/L,氯化铵0.5g/L;所述发酵培养基的成分为:酵母提取物10g/L,海水。 3.根据权利要求1所述的一种高产乙醇的双细胞连续发酵方法,其特征在于,步骤3)所述发酵过程中通气采用压缩空气。 4.根据权利要求1所述的一种高产乙醇的双细胞连续发酵方法,其特征在于,步骤3)所述收集的乙醇为气体,采用在所述气升式发酵罐的塔顶出口处压缩并冷凝的方式收集。 5.根据权利要求1所述的一种高产乙醇的双细胞连续发酵方法,其特征在于,步骤3)剩余发酵液回收用于生物菌肥和水产饲料。

说明书


一种高产乙醇的双细胞连续发酵方法
技术领域


本发明属于细胞发酵工程领域,具体涉及一种高产乙醇的双细胞连续发酵方法。


背景技术


生物质乙醇是一种低排放、绿色、环保型清洁能源,用乙醇替代或部分替代汽油作
为未来的汽?#31561;剂希?#21487;以极大地缓解能源危机。同时从全球碳循?#26041;?#24230;出发,乙醇燃烧后释
放的二氧化碳重新被绿色植物固定,可减缓温室效应,因而受到各国政府及科学家越来越
广泛的关注。


生物质乙醇的生产需利用可再生生物?#39318;?#28304;,目前国际上主要使用?#23616;?#32420;维素水
解加微生物发酵的方法,该方法所用纤维素酶大多靠进口,成本较高,发酵菌株酵母菌不能
耐高浓度乙醇且对?#23616;?#32420;维素水解产物中?#31181;?#29289;的耐受性差。另外也有使用同步糖化发酵
的方法,但还未?#19994;?#36866;用于大规模生产的菌株,人工构建的酵母基因工程菌纤维素酶解效
?#23454;汀?#31283;定性差,其它筛选的野生菌株乙醇发酵水平达不到工业化需要。因此,提高乙醇发
酵水平和生物?#39318;?#21270;率非常重要。


对微生物发酵生产乙醇而言,合适的发酵工艺对保证产乙醇水平、菌株生物?#39318;?br>化效率的稳定性至关重要。所以有必要通过发酵工艺的优化尤其是培养基的简化提高乙醇
产量、太阳能和生物?#39318;?#21512;利用?#21097;档?#29983;产成本。


发明内容


本发明的目的在于提供一种高产乙醇的双细胞连续发酵方法,该方法利用解淀粉
芽孢?#21496;?#20419;进小球藻生长、产纤维素酶和淀粉酶且两者均耐盐的特性,进一?#37237;?#36807;人工驯
化提高两种细胞的共培养相容性。所需的培养基成分极简,成?#38236;停子?#25511;制,菌株发酵性
能稳定,生物?#39318;?#21270;效?#30465;?#21033;用率以及乙醇产量得?#36739;?#33879;提高。


本发明是通过以下技术方案实现的:


一种高产乙醇的双细胞连续发酵方法,包括以下步骤:


步骤1)采用种子培养基培养解淀粉芽孢?#21496;?#21644;小球藻发酵种子,其中解淀粉芽孢
?#21496;?#22521;养温度为28℃,摇床转速160r/min,培养时间24h;小球藻培养温度为25℃,光照静置
培养,培养时间5~7d;


步骤2)按1:1的体积比混合步骤1)得到的解淀粉芽孢?#21496;?#21644;小球藻种子培养液作
为发酵种子液;


步骤3)将发酵种子液按10%的接种量接种至发酵培养基?#24076;?#36827;行双细胞共培养发
酵生产并收集乙醇,发酵过程温度为28℃,采用气升式发酵罐,50%氨水控制pH 7.0,通气
量5L/s,发酵至第七天结束,发酵制得的乙醇经提取后可剩余发酵液。


优选地,所述解淀粉芽孢?#21496;?#30340;种子培养基成分为:胰蛋白胨10g/L,酵母提取物
5g/L,氯化钠10g/L;所述小球藻的种子培养基成分为?#28009;?#33796;糖10g/L,硝酸钾1.011g/L,磷酸
二氢钠0.907g/L,磷酸氢二钠0.946g/L,硫酸镁0.246g/L,氯化钙0.015g/L,硫酸亚铁
0.007g/L,硫酸锌0.0003g/L,硫酸锰0.0002g/L,氯化铵0.5g/L;所述发酵培养基的成分为:
酵母提取物10g/L,海水。


优选地,步骤3)所述发酵过程中通气采用压缩空气。


优选地,步骤3)所述收集的乙醇为气体,采用在所述气升式发酵罐的塔顶出口处
压缩并冷凝的方式收集。


优选地,步骤3)剩余发酵液回收用于生物菌肥和水产饲料。


本发明的有益效果如下:


本发明的种子培养方法,发酵种子生长?#26438;?#19988;最终菌浓较大,小球藻为活体状态,
接种发酵培养基后菌体生长延滞期明?#36816;?#30701;,显著提高了乙醇的发酵效?#30465;?#26412;发明的乙醇
发酵方法,发酵培养基成分极简,无需添加葡萄糖、维生素、氨基酸、稀有金属离子等微量元
素,工艺控制简单,显著?#26723;?#20102;发酵成本并提高了乙醇产量和生物质利用?#30465;?#27492;外,共培养
体系可以为彼此提供营养物质且解淀粉芽孢?#21496;?#20855;有促进小球藻生长的特性。


?#37237;?#35828;明


图1为高产乙醇的双细胞连续发酵方法的流程图。


具体实施方式


下面结?#32454;酵加?#23454;施例对本发明做进一步阐述。


本发明所使用的解淀粉芽孢?#21496;?#33740;株(Bacillus amyloliquefaciens)和小球藻
(Chlorella vulgaris)是本实验室购买的通用菌株和细胞。其中解淀粉芽孢?#21496;?#33740;株
(Bacillus amyloliquefaciens)的保藏编号为CGMCC No.1.7463。


实施例1


一种高产乙醇的双细胞连续发酵方法,如图1所示,包括以下步骤:


1、解淀粉芽孢?#21496;?#31181;子培养基成分为:胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,氯化钠
10g/L。解淀粉芽孢?#21496;?#31181;子培养过程采用三角瓶,培养温度为28℃,摇床转速160r/min,培
养时间24h。


2、小球藻种子培养基成分为?#28009;?#33796;糖10g/L,硝酸钾1.011g/L,磷酸二氢钠0.907g/
L,磷酸氢二钠0.946g/L,硫酸镁0.246g/L,氯化钙0.015g/L,硫酸亚铁0.007g/L,硫酸锌
0.0003g/L,硫酸锰0.0002g/L,氯化铵0.5g/L。小球藻种子培养温度为25℃,光照静置培养,
培养时间5~7d。


3、按1:1的体积比混合解淀粉芽孢?#21496;?#21644;小球藻种子培养液作为发酵种子液。


4、发酵培养基成分为:酵母提取物10g/L,海水。将发酵种子液按10%的接种量接
种至发酵培养基?#24076;?#21457;酵过程温度为28℃,采用SGQ-100L气升式发酵罐(常州三高),50%氨
水控制pH 7.0,通气采用压缩空气,通气量5L/s,发酵至第七天结束。


挥发的乙醇气体在气升式发酵罐的塔顶出口处压缩并冷凝收集,发酵结束后乙醇
产量为11.2g/L,实现了光能向化学能的高效生物转化。乙醇提取后的发酵液中含有大量细
胞,其中上清液可用作水产饲?#24076;?#27785;淀可用作生物菌?#30465;?br>

本发明所用的发酵罐罐体为有机玻璃,透光性能、化学稳定?#38498;茫?#27604;重小,重量轻,
机械强度高,?#36879;?#34432;,耐湿,耐晒,便于采集日光。


对照例1


1、解淀粉芽孢?#21496;?#31181;子培养基成分为:胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,氯化钠
10g/L。解淀粉芽孢?#21496;?#31181;子培养过程采用普通250mL三角瓶,培养温度为30℃,摇床转速
160r/min,培养时间24h。


2、小球藻培养基成分为:Na
2CO
3 0.02g/L,NaNO
3 2.0g/L,KH
2PO
4 0.02g/L,MgSO
4
0.1g/L,尿素0.8g/L。小球藻种子培养温度为23℃,光照静置培养,控制pH 6.0,培养时间
7d;


3、解淀粉芽孢?#21496;?#21457;酵培养基成分?#28009;?#33796;糖120g/L,玉米浆40g/L,生物素8×10
-

5g/L,组氨酸5×10
-4g/L,硫酸锰0.02g/L,硫酸铵20g/L,硫酸镁0.5g/L,磷酸二氢钾1.5g/L,
硫酸亚铁0.02g/L。解淀粉芽孢?#21496;?#21457;酵过程温度为30℃,采用SGQ-100L气升式发酵罐(常
州三高),发酵罐搅拌转速600r/min,50%氨水控制pH 7.0,通气采用压缩空气,通气量3L/
s,发酵至葡萄糖?#26408;?#32467;束,乙醇产量为2g/L。


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