平码五不中公式规律
  • / 6
  • 下载费用:30 金币  

一种检测牛肌肉HSL基因表达量的方法.pdf

关 键 ?#21097;?/dt>
一种 检测 肌肉 HSL 基因 表达 方法
  专利查询网所有资源均是用户自行上传分享,仅供网友学?#25942;?#27969;,未经上传用户书面授权,请勿作他用。
摘要
申请专利?#29275;?/td>

CN201910046862

申请日:

20190118

公开?#29275;?/td>

CN109628562A

公开日:

20190416

当前法律?#21050;?/td>

公开

有效性:

审中

法?#19978;?#24773;: 公开
IPC分类?#29275;?/td> C12Q1/6851;C12Q1/6888 主分类?#29275;?/td> C12Q1/6851;C12Q1/6888
申请人: 内蒙古农业大学
发明人: 敖日格乐;斯木吉德;王纯洁
地址: 010018 内蒙古自治区呼和浩特市赛罕区昭乌达路306号
优先权:
专利代理机构: 代理人:
PDF完整版下载: PDF下载
法律?#21050;?/div>
申请(专利)?#29275;?/td>

CN201910046862

授权公告?#29275;?/td>

法律?#21050;?#20844;告日:

20190416

法律?#21050;?#31867;型:

公开

摘要

本发明公开了一种检测牛肌肉HSL基因表达量的方法,本发明通过设计HSL基因特异性引物对,内?#25105;?#29289;GAPDH的qPCR扩增,以及对qPCR结果的相对定量?#27835;觶?#20934;确、快速地?#27835;?#20102;HSL基因在牛肌肉中的表达情况。本发明所建立的检测HSL基因表达水平的qPCR检测方法,可用于精确检测不同品种牛肌肉HSL基因的表达水平。该发明所述方法可用于检测不同品种牛肌肉HSL基因的表达水平,对深入研究牛HSL基因功能提供参考,方法简便,易操作。

权利要求书

1.一种检测牛肌肉HSL基因表达量的方法,其特征在于:所述方法包括如下步骤: 1)从待检测的牛肉组织中提取总RNA,再通过反转录?#20174;?#21046;备cDNA样品; 2)将制备的cDNA样?#26041;?#34892;荧光定量实时PCR检测,内参基因GAPDH的qPCR扩增?#20174;?#20307;系为:Rremix Ex TaqTM II 10.0μL,ddH2O 8μL,G-F 0.5μL,G-R 0.5μL,牛的肌肉组织cDNA 1.0μL; 牛HSL基因的qPCR扩增?#20174;?#20307;系为:Rremix Ex TaqTM II 10.0μL,ddH2O 8μL,H-F 0.5μL,H-R 0.5μL,牛肌肉组织cDNA 1.0μL; 3)在定量PCR仪上进行检测,荧光信号在每个循?#26041;?#26463;时检测,每个样品3个重复,计算牛HSL基因的表达量。 2.根据权利要求1所述的一种检测牛肌肉HSL基因表达量的方法,其特征在于:所述引物对G-F和G-R的序列为: G-F:5’-CGTGTCTGTTGTGGATCTGACCTG-3’, G-R:5’-CAACCTGGTCCTCAGTGTAGCCT-3’。 3.根据权利要求1所述的一种检测牛肌肉HSL基因表达量的方法,其特征在于:所述引物对P-F和P-R的序列为: H-F:5’-GATGAGAGGGTAATTGCCG-3’, H-R:5’-GGATGGCAGGTGTGAACT-3’。 4.根据权利要求1所述的一种检测牛肌肉HSL基因表达量的方法,其特征在于:所述内参基因GAPDH和牛HSL基因的qPCR扩增?#20174;?#31243;序相同,均为:95℃预变性30sec,95℃变性30sec,58℃退火1min,72℃延伸20sec,40个循环。 5.根据权利要求1所述的一种检测牛肌肉HSL基因表达量的方法,其特征在于:所述引物G-F、G-R、H-F和H-R的浓度均为20μmol/L。

说明书


一种检测牛肌肉HSL基因表达量的方法
技术领域


本发明涉及基因工程领域,特别指一种检测牛肌肉HSL基因表达量的方法。


背景技术


激素敏感性酯酶(Hormone-sensitive Lipase,HSL)是动物脂肪代谢过程中的关
键酶,在HSL的作用下,甘油三酯,甘油二酯、甘油一酯和胆固醇酯等脂质及其他水溶性底物
可以被水解成甘油和脂肪酸,从而满足动物体的需要。HSL的活性因在机体的不同位置而具
有不同的调节机制,肌肉中HSL的活性主要通过儿茶酚胺(去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴
胺)及肌肉收缩调节,在儿茶酚胺的作用下β肾上腺素受体以及cAMP刺激HSL的活性;肌肉收
缩可引起肾上腺素大量增加,同时ERK的磷酸化也增加,从而引起HSL活性的增加,但在?#26031;?br>程中HSL的表达并未受到影响。另外,HSL的活性及其作用机制受到复杂的级联?#20174;?#26426;制调
控,机体不同生理?#21050;?#19979;的不同激素平衡?#21050;?#20250;使得HSL的活性及其作用机制发生相应的
变化。胰高血糖素、去甲肾上腺素和肾上腺素等可以快速促进脂肪分解代谢,它们作用于脂
肪细胞质膜表面特异性受体,从而激活腺昔酸环化酶,活化无活性的HSL,进而发挥促进脂
肪分解作用。生长激素、糖皮质激素、甲状腺素等相比于胰高血糖素与肾上腺素属于慢促脂
解作用型激素。而胰岛素、前列腺素及烟酸可?#28304;?#36827;脂肪合成代谢。另外,动物体营养?#32431;?br>也在一定程度上影响HSL活性,长时间禁食会使机体HSL活性和浓度迅速升高,另外,不同季
节和生理阶段的动物,体内的HSL活性也不同。目前关于该基因在牛肌肉上的报道较少。因
此需要开发一种能够准确检测牛肌肉HSL基因表达量的方法,以便于其在肉?#20998;?#30740;究中的
应用。


发明内容


本发明的目的在于克服现有技术的不足,提供一种检测牛肌肉HSL基因表达量的
方法。


本发明是通过以下技术方案实现的:


一种检测牛肌肉HSL基因表达量的方法,具体包括以下步骤:


1)从待检测的牛肉组织中提取总RNA,再通过反转录?#20174;?#21046;备cDNA样品;


2)将制备的cDNA样?#26041;?#34892;荧光定量实时PCR检测,内参基因GAPDH的qPCR扩增?#20174;?br>体系为:
Rremix Ex TaqTM II(Perfect ReaL Time)10.0μL,ddH
2O 8μL,G-F 0.5μ
L,G-R 0.5μL,牛的肌肉组织cDNA 1.0μL;


牛HSL基因的qPCR扩增?#20174;?#20307;系为:
Rremix Ex TaqTM II 10.0μL,ddH
2O8
μL,H-F 0.5μL,H-R 0.5μL,牛肌肉组织cDNA 1.0μL;


3)在定量PCR仪上进行检测,荧光信号在每个循?#26041;?#26463;时检测,每个样品3个重复,
计算牛HSL基因的表达量。


在上述技术方案中,所述的引物对H-F和H-R的序列为:


H-F:5’-GATGAGAGGGTAATTGCCG-3’,见序列表SEQ NO.1。


H-R:5’-GGATGGCAGGTGTGAACT-3’,见序列表SEQ NO.2。


在上述技术方案中,所述的引物对G-F和G-R的序列为:


G-F:5’-CGTGTCTGTTGTGGATCTGACCTG-3’,见序列表SEQ NO.3。


G-R:5’-CAACCTGGTCCTCAGTGTAGCCT-3’,见序列表SEQ NO.4。


在上述技术方案中,所述内参基因GAPDH和HSL基因的qPCR扩增?#20174;?#31243;序相同,均
为:95℃预变性30sec,95℃变性30sec,58℃退火1min,72℃延伸20sec,40个循环。


在上述技术方案中,所述G-F、G-R、H-F和H-R的浓度均为20μmol/L。


本发明具有以下有益效果:


本发明通过设计HSL基因特异性引物对,内?#25105;?#29289;GAPDH的qPCR扩增,以及对qPCR
结果的相对定量?#27835;觶?#20934;确、快速地?#27835;?#20102;HSL基因在牛肌肉中的表达情况。本发明所建立
的检测HSL基因表达水平的qPCR检测方法,可用于精确检测不同品种牛肌肉HSL基因的表达
水平。该发明所述方法可用于检测不同品种牛肌肉HSL基因的表达水平,对深入研究牛HSL
基因功能提供参考,方法简便,易操作。


具体实施方式


为了使本技术领域的人?#22791;?#22909;地理解本发明方案,下面结合具体实施例进一步说
明本发明的技术方案。


一种检测牛肌肉HSL基因表达量的方法,具体步骤如下:


1)设计HSL基因序列的特异性引物对H-F和H-R和内参基因引物对G-F和G-R:


参考Genbank收录的HSL基因序列(Genbank Accession No.NM-001080220),内参
基因GAPDH(Genbank Accession No.0NM-001034034),利用Primer Premier 3.0软件设计
引物,并通过NCBI中Blast功能,检测引物的特异性。


H-F:5’-GATGAGAGGGTAATTGCCG-3’,见序列表SEQ NO.1。


H-R:5’-GGATGGCAGGTGTGAACT-3’,见序列表SEQ NO.2。


所述的引物对G-F和G-R的序列为:


G-F:5’-CGTGTCTGTTGTGGATCTGACCTG-3’,见序列表SEQ NO.3。


G-R:5’-CAACCTGGTCCTCAGTGTAGCCT-3’,见序列表SEQ NO.4。


2)提取待测牛的肌肉组织总RNA并合成组织cDNA;


样品采集:3岁蒙古牛和西门塔尔牛各6头,屠宰后采集各试验牛左侧胴体第12至
第13肋骨处的背最长肌,液氮冷冻后放于-80℃冰箱保存备用。


牛肌肉组织总RNA的提取采用Thermo Fisher Scientific公司的总RNA提取盒
(TRIzol
TMReagent)提取,提取方法参照试剂盒说明书。总RNA的完整性通过琼脂糖凝胶电泳
检测确定;总RNA浓度通过NanoDrop2000微量紫外分光光度计测定。总RNA使用Takara逆转
录试剂盒(PrimeScriptTM RT Master Mix)进行逆转录成组织cDNA。


3)?#28304;?#27979;牛的肌肉组织cDNA为模板,以1)所述的引物对G-F和G-R为引物,qPCR扩
增内参基因GAPDH;?#28304;?#27979;牛的肌肉组织cDNA为模板,以1)所述的引物对H-F和H-R为引物,
qPCR扩增牛HSL基因;


其中,内参基因GAPDH的qPCR扩增?#20174;?#20307;系为:
Rremix Ex TaqTM II
(Perfect ReaL Time)10.0μL,ddH
2O 8μL,G-F 0.5μL,G-R 0.5μL,牛的肌肉组织cDNA 1.0μ
L;


牛HSL基因qPCR扩增?#20174;?#20307;系为:
Rremix Ex TaqTM II 10.0μL,ddH
2O8μ
L,H-F 0.5μL,H-R 0.5μL,牛肌肉组织cDNA 1.0μL;


其中,G-F、G-R、H-F和H-R的浓度均为20μmol/L;


内参基因GAPDH和牛HSL基因的qPCR扩增?#20174;?#31243;序相同,均为:95℃预变性30sec,
95℃变性30sec,58℃退火1min,72℃延伸20sec,40个循环。


其中,为了确保内参基因的准确度,上述两个扩增?#20174;?#20307;系中G-F、G-R、H-F和H-R
的浓度均为10μmol/L;上述两个扩增?#20174;?#20307;系中,
Rremix Ex TaqTM II(Perfect
ReaL Time)也完全相同,均购自宝生物工程(大连)有限公司。


内参基因GAPDH和牛HSL基因的qPCR扩增?#20174;?#31243;序相同,均为:95℃预变性30sec,
95℃变性30sec,58℃退火1min,72℃延伸20sec,40个循环。


其中,按照Takara公司生产的
Rremix Ex TaqTM II(Perfect ReaL Time)
荧光定量试剂盒的说明配?#21697;从?#28082;,将0.2mL的无菌无酶PCR管置于冰上,根据每一个?#20174;?br>体系所需的各种组分的数量和1次?#20174;?#25152;需的PCR?#20174;?#30340;个数,算出各种?#20174;?#32452;分的总量,
将各组分加按照算出的总量分别加入到上述0.2mL的无菌无酶PCR管中,配置完成后,充分
混匀,除去管内气泡,用离心机瞬离一次,上机。整个操作过程尽量避光。


4)检测3)中qPCR的结果,计算表达量。


采用2-ΔΔCt值计算目的基因的mRNA相对表达量。


ΔCt=Ct(牛HSL基因循环数)-Ct(内参基因GAPDH循环数)


Ct值:?#20174;?#20307;?#30340;?#33639;光信号到达设定阈值时所经历的循环数。通过测定值可计算
出基因起始的模板量。以管?#19968;?#22240;作为内参基因,通过内参基因对目的基因进行标准化,可
测定出目的基因转录表达的相对量。采用SPSS version 20.0软件进行两个品种肌肉样品
间的差异显著性检验,采用单因素方差?#27835;觶琍≤0.05表示差异显著,所有结果均以平均值
和标准差来表?#23613;?#32467;果如表1所?#23613;?br>

表1 牛肌肉HSL基因mRNA相对表达量







通过上述实施例证实了所建立的HSL基因表达水平的Q-PCR检测方法,可用于精确
检测不同品种牛肌肉HSL基因的表达水平。该发明所述方法可用于检测HSL基因的表达水
平,对深入研究牛HSL基因功能提供参考,方法简便,易操作。


以上对本发明做了示例性的描述,应该说明的是,在不脱离本发明的核心的情况
下,任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均
落入本发明的保护?#27573;А?br>




关于本文
本文标题:一种检测牛肌肉HSL基因表达量的方法.pdf
链接地址:http://www.pqiex.tw/p-6152905.html
关于我们 - 网站声明 - 网站地图 - 资源地图 - 友情链接 - 网站客服 - 联系我们

[email protected] 2017-2018 zhuanlichaxun.net网站版权所有
经营许可证编号:粤ICP备17046363号-1 
 


收起
展开
平码五不中公式规律 河北11选5最大遗漏值 湖北11选5走势图基本走势 体彩七星彩开奖结果 合买大厅首页竞技彩 永利棋牌游戏平台官方下载 27号湖南幸运赛车开奖结果 澳洲幸运8软件下载 黑龙江十一选五最大遗 2019年每月上证指数 天津11选5漏号