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一种人卵母细胞的体外成熟培养液制备方法和培养方法.pdf

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一种 人卵母 细胞 体外 成熟 培养液 制备 方法 培养
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摘要
申请专利号:

CN201910049865

申请日:

20190118

公开号:

CN109628386A

公开日:

20190416

当前法律状态:

公开

有效性:

审中

法?#19978;?#24773;: 公开
IPC分类号: C12N5/075 主分类号: C12N5/075
申请人: 周桦
发明人: 周桦
地址: 558400 贵州省贵阳市云岩区贵医20号
优先权:
专利代理机构: 代理人:
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法律状态
申请(专利)号:

CN201910049865

授权公告号:

法律状态公告日:

20190416

法律状态类型:

公开

摘要

本发明公开一种人卵母细胞的体外成熟培养液制备方法和培养方法,包含以下操作步骤:血清制作:将血液放入至离心机内进行离心操作,并取出血清部分备用,抗生素液制作:分别将100ug/ml青霉素、100ug/ml链霉素、50ug/ml卡那霉素和25ug/ml制菌霉素以1:2:1:3的比例充?#21482;?#21512;,?#28304;?#21046;得抗生素液备用。该人卵母细胞的体外成熟培养液制备方法和培养方法,使用多种盐溶液和抗生素作为辅助生长剂,使用较为普遍的牛犊血清作为基础,同时采用添加NaHCO3和HEPES溶液的方式调节培养液的PH值,给卵母细胞提供生存条件的同?#24065;种?#20102;杂菌的生长,避免了由于杂菌感染而导致的研究困难,同时提高了卵母细胞的体外成熟率,?#26723;?#20102;制造成本,?#26723;?#30740;究难度的同时方便了使用者的使用。

权利要求书

1.一种人卵母细胞的体外成熟培养液制备方法,其特征在于:包含以下操作步骤: S1、血清制作:将血液放入至离心机内进行离心操作,并取出血清部分备用; S2、抗生素液制作:分别将100ug/ml青霉素、100ug/ml链霉素、50ug/ml卡那霉素和25ug/ml制菌霉素以1:2:1:3的比例充?#21482;?#21512;,?#28304;?#21046;得抗生素液备用; S3、离子液制作:分别将75IU/L rFSH、150IU/L rHCG、20% SPS、2mg/L EGF和25mmol/L丙酮酸钠以1:3:2:2的比例充?#21482;?#21512;,?#28304;?#21046;得离子液备用; S4、溶液混合:将步骤S1得到的血清、步骤S2得到的抗生素液和步骤S3得到的离子液以5:1:2的比例混合,并充分搅拌,?#28304;?#24471;到营养液; S5、PH?#26723;?#35797;:检测步骤S4中得到的营养液的PH值,通过添加3.7%的NaHCO3和HEPES溶液进行PH值的调试,并使得混合液PH值在范围7.2-7.4内(即若PH值小于7.2,则添加NaHCO3,若PH值大于7.4,则添加HEPES溶液,直至PH值在7.2-7.4时为止),?#28304;?#23436;成培养液的制作。 2.根据权利要求1所述的一种人卵母细胞的体外成熟培养液制备方法,其特征在于:所述步骤S1中的血液为牛犊动脉血液。 3.根据权利要求1所述的一种人卵母细胞的体外成熟培养液制备方法,其特征在于:所述步骤S4中充分搅拌的用时为30-40?#31181;印?4.根据权利要求1所述的一种人卵母细胞的体外成熟培养液制备方法,其特征在于:所述步骤S5中添加的NaHCO3和HEPES溶液的总质量不得超过原营养液质量的3%。 5.一种人卵母细胞的培养方法,其特征在于:包含以下操作步骤: S1、培养皿的准备:根据培养的规模选择容量适合的培养皿,并?#36816;?#36873;的培养皿进行清洗和消毒操作; S2、培养液添加:在无菌环境下,将培养液添加于培养皿中; S3、细胞添加:将细胞溶液滴入至培养液上,?#20918;?#35777;每滴细胞溶液在滴落后不相互接触随后盖上培养皿?#27597;?#23376;; S4、细胞培养:将步骤S3中得到的培养皿放入至温度23-28℃的无菌环境下培养,并每周观察一次,并在观察时,将培养皿?#27597;?#23376;打开5-10?#31181;櫻源私?#34892;培养操作。 6.根据权利要求5所述的一种人卵母细胞的培养方法,其特征在于:所述步骤S2中添加培养液的量的范围为所用培养皿容量的50%-70%。 7.根据权利要求5所述的一种人卵母细胞的培养方法,其特征在于:所述步骤S3中对环境的要求为?#20309;?#33740;,温度23-28℃,相对湿度40%-50%,空气内含氧量大于20%。

说明书


一种人卵母细胞的体外成熟培养液制备方法和培养方法
技术领域


本发明涉及细胞培养技术领域,具体为一种人卵母细胞的体外成熟培养液制备方
法和培养方法。


背景技术


卵母细胞在卵子发生过程中进行减数分裂的卵原细胞,分为初级卵母细胞、次级
卵母细胞和成熟的卵母细胞,它们分别是卵原细胞?#21482;?#21644;DNA复制分裂后产生、第一次减数
分裂和第二次减数分裂的产物,在卵母细胞研?#25239;?#31243;中,需要对卵母细胞进行体外培养操
作。


在现有技术中,所使用的培养液适用于过多种类的杂菌生存,因此容易出现由于
杂菌感染而导致的研究困难,同时?#26723;?#20102;卵母细胞的体外成熟率,所使用的培养液的所需
材料中多为现成的生物体液提取加工而成,因此制造成本?#32454;擼?#22686;加研究难度的同?#22791;?#20351;
用者的使用带来不便。


发明内容


(一)解决的技术问题


针对现有技术的不足,本发明提供了一种人卵母细胞的体外成熟培养液制备方法和培
养方法,解决了在现有技术中,所使用的培养液适用于过多种类的杂菌生存,因此容易出现
由于杂菌感染而导致的研究困难,同时?#26723;?#20102;卵母细胞的体外成熟率,所使用的培养液的
所需材料中多为现成的生物体液提取加工而成,因此制造成本?#32454;?#30340;问题。


(二)技术方案


为实现以上目的,本发明通过以下技术方案予以实现:


一种人卵母细胞的体外成熟培养液制备方法,包含以下操作步骤:


S1、血清制作:将血液放入至离心机内进行离心操作,并取出血清部分备用;


S2、抗生素液制作:分别将100ug/ml青霉素、100ug/ml链霉素、50ug/ml卡那霉素和
25ug/ml制菌霉素以1:2:1:3的比例充?#21482;?#21512;,?#28304;?#21046;得抗生素液备用;


S3、离子液制作:分别将75IU/L rFSH、150IU/L rHCG、20% SPS、2mg/L EGF和25mmol/L
丙酮酸钠以1:3:2:2的比例充?#21482;?#21512;,?#28304;?#21046;得离子液备用;


S4、溶液混合:将步骤S1得到的血清、步骤S2得到的抗生素液和步骤S3得到的离子液以
5:1:2的比例混合,并充分搅拌,?#28304;?#24471;到营养液;


S5、PH?#26723;?#35797;:检测步骤S4中得到的营养液的PH值,通过添加3.7%的NaHCO3和HEPES溶
液进行PH值的调试,并使得混合液PH值在范围7.2-7.4内(即若PH值小于7.2,则添加
NaHCO3,若PH值大于7.4,则添加HEPES溶液,直至PH值在7.2-7.4时为止),?#28304;?#23436;成培养液
的制作。


优选的,所述步骤S1中的血液为牛犊动脉血液。


优选的,所述步骤S4中充分搅拌的用时为30-40?#31181;印?br>

优选的,所述步骤S5中添加的NaHCO3和HEPES溶液的总质量不得超过原营养液质
量的3%。


一种人卵母细胞的培养方法,包含以下操作步骤:


S1、培养皿的准备:根据培养的规模选择容量适合的培养皿,并?#36816;?#36873;的培养皿进行清
洗和消毒操作;


S2、培养液添加:在无菌环境下,将培养液添加于培养皿中;


S3、细胞添加:将细胞溶液滴入至培养液上,?#20918;?#35777;每滴细胞溶液在滴落后不相互接触
随后盖上培养皿?#27597;?#23376;;


S4、细胞培养:将步骤S3中得到的培养皿放入至温度23-28℃的无菌环境下培养,并每
周观察一次,并在观察时,将培养皿?#27597;?#23376;打开5-10?#31181;櫻源私?#34892;培养操作。


优选的,所述步骤S2中添加培养液的量的范围为所用培养皿容量的50%-70%。


优选的,所述步骤S3中对环境的要求为?#20309;?#33740;,温度23-28℃,相对湿度40%-50%,空
气内含氧量大于20%。


(三)有益效果


本发明提供了一种人卵母细胞的体外成熟培养液制备方法和培养方法。具备以下有益
效果:


该人卵母细胞的体外成熟培养液制备方法和培养方法,使用多种盐溶液和抗生素作为
辅助生长剂,使用较为普遍的牛犊血清作为基础,同时采用添加NaHCO3和HEPES溶液的方式
调节培养液的PH值,给卵母细胞提供生存条件的同?#24065;种?#20102;杂菌的生长,避免了由于杂菌
感染而导致的研究困难,同时提高了卵母细胞的体外成熟率,?#26723;?#20102;制造成本,?#26723;?#30740;究难
度的同时方便了使用者的使用。


具体实施方式


所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明
中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提?#28388;?#33719;得的所有其他实施
例,都属于本发明保护的范围。


一种人卵母细胞的体外成熟培养液制备方法,包含以下操作步骤:


S1、血清制作:将血液放入至离心机内进行离心操作,并取出血清部分备用(血液为牛
犊动脉血液);


S2、抗生素液制作:分别将100ug/ml青霉素、100ug/ml链霉素、50ug/ml卡那霉素和
25ug/ml制菌霉素以1:2:1:3的比例充?#21482;?#21512;,?#28304;?#21046;得抗生素液备用;


S3、离子液制作:分别将75IU/L rFSH、150IU/L rHCG、20% SPS、2mg/L EGF和25mmol/L
丙酮酸钠以1:3:2:2的比例充?#21482;?#21512;,?#28304;?#21046;得离子液备用;


S4、溶液混合:将步骤S1得到的血清、步骤S2得到的抗生素液和步骤S3得到的离子液以
5:1:2的比例混合,并充分搅拌,?#28304;?#24471;到营养液(充分搅拌的用时为30-40?#31181;櫻?br>

S5、PH?#26723;?#35797;:检测步骤S4中得到的营养液的PH值,通过添加3.7%的NaHCO3和HEPES溶
液进行PH值的调试,并使得混合液PH值在范围7.2-7.4内(即若PH值小于7.2,则添加
NaHCO3,若PH值大于7.4,则添加HEPES溶液,直至PH值在7.2-7.4时为止),?#28304;?#23436;成培养液
的制作(添加的NaHCO3和HEPES溶液的总质量不得超过原营养液质量的3%)。


一种人卵母细胞的培养方法,包含以下操作步骤:


S1、培养皿的准备:根据培养的规模选择容量适合的培养皿,并?#36816;?#36873;的培养皿进行清
洗和消毒操作;


S2、培养液添加:在无菌环境下,将培养液添加于培养皿中(添加培养液的量的范围为
所用培养皿容量的50%-70%);


S3、细胞添加:将细胞溶液滴入至培养液上,?#20918;?#35777;每滴细胞溶液在滴落后不相互接触
随后盖上培养皿?#27597;?#23376;(对环境的要求为?#20309;?#33740;,温度23-28℃,相对湿度40%-50%,空气内含
氧量大于20%);


S4、细胞培养:将步骤S3中得到的培养皿放入至温度23-28℃的无菌环境下培养,并每
周观察一次,并在观察时,将培养皿?#27597;?#23376;打开5-10?#31181;櫻源私?#34892;培养操作。


综上所述,该人卵母细胞的体外成熟培养液制备方法和培养方法,使用多种盐溶
液和抗生素作为辅助生长剂,使用较为普遍的牛犊血清作为基础,同时采用添加NaHCO3和
HEPES溶液的方式调节培养液的PH值,给卵母细胞提供生存条件的同?#24065;种?#20102;杂菌的生长,
避免了由于杂菌感染而导致的研究困难,同时提高了卵母细胞的体外成熟率,?#26723;?#20102;制造
成本,?#26723;?#30740;究难度的同时方便了使用者的使用。


尽管已经示出和描述了本发明的实施例,?#26434;?#26412;领域的普通技术人员而言,可以
理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换
和变型,本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。


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本文标题:一种人卵母细胞的体外成熟培养液制备方法和培养方法.pdf
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