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一种活性东革阿里多糖及制备方法.pdf

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一种 活性 阿里 多糖 制备 方法
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摘要
申请专利号:

CN201910044488

申请日:

20190117

公开号:

CN109456418A

公开日:

20190312

当前法律状态:

实质审查的生效

有效性:

审中

法?#19978;?#24773;: 实质审查的生效
IPC分类号: C08B37/00 主分类号: C08B37/00
申请人: 齐齐哈尔大学
发明人: 宫春宇;余世锋;郑程远;吴红艳;王岩;单佳明;邢悦;张以超;鲍天宇
地址: 161006 黑龙江省齐齐哈尔市建华区文化大街42号
优先权:
专利代理机构: 23207 代理人: 刘丽
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法律状态
申请(专利)号:

CN201910044488

授权公告号:

法律状态公告日:

20190405

法律状态类型:

实质审查的生效

摘要

本发明公开一种活性东革阿里多糖及制备方法,属于天然植物活性多糖的提取分离技术领域。其?#34903;?#22914;下:将东革阿里带皮枝干经过预处理、脱脂、多糖浸提、多糖纯化等?#34903;?#24471;到分子量大于100KDa东革阿里多糖,该多糖可以有效促进发酵乳中益生菌增殖。本发明制备的东革阿里多糖提取率较高可以达到4.52%,并且该多糖与传统方法制备的醇沉多糖,以及与醇沉多糖经脱色或脱蛋白纯化后获得的脱色多糖或脱蛋白多糖相比,具有更好的促进发酵乳中益生菌增殖作用;与分子量大于10KDa的多糖相比,也具有更好的促进发酵乳中益生菌增殖作用。具有广泛的开发潜力和广阔的市场前景。

权利要求书

1.一种活性东革阿里多糖的制备方法,其特征在于:其?#34903;?#22914;下: 第一步: 东革阿里的预处理 东革阿里带皮枝干,粉碎至60目,阴凉处干燥保存; 第二步: 东革阿里的脱脂 东革阿里粉按质量体积比1:10-1:20加入95%乙醇浸泡24小?#20445;?#28024;泡后过滤,滤渣同法再重复浸泡1次,浸泡后东革阿里粉于阴凉处自然干燥,并于干燥环境保存备用; 第三步:多糖浸提 3.1浸提 脱脂的东革阿里按1:10-1:30质量体积比加入蒸馏水,在80-100℃下于提取罐中浸提1-3小?#20445;?3.2离心 提取液于5000 r/min离心20min,分离上清和沉淀; 3.3复提 按3.1、3.2?#34903;?#26041;法再浸提1次,合并两次提取的上清液; 3.4除杂 上清液经减压纸过滤除去微小颗粒,制备多糖浸提清液; 3.5 沉淀多糖 清?#21495;?#32553;至原体积的1/8,然后加入无水乙醇至溶液中乙醇最?#24352;?#24230;为80%,4℃沉淀24h后,5000 r/min离心15min,收集沉淀,并用95%乙醇洗涤沉淀1次,干燥,即为东革阿里醇沉多糖; 第四步: 多糖纯化 4.1超滤 东革阿里醇沉多糖加入蒸馏水,配置成10-35mg/mL溶液,用截留分子量为100 KDa超滤膜超滤;采用优化后超滤工艺:超滤压力0.8-1.5 Mpa,当多糖溶液体积超滤浓缩至原溶液体积的1/2倍?#20445;?#21521;浓缩液中补1/2倍原溶液体积的蒸馏水,继续超滤至浓缩液体积恢复为补水前体积,同法重复补水,直至总补水体积为原溶液体积的15-40倍,不再补水; 4.2 干燥 超滤浓缩液经进一步浓缩后,冷冻干燥或喷雾干燥,获得分子量大于100 KDa东革阿里多糖。 2.一种活性东革阿里多糖的制备方法,其特征在于:其?#34903;?#22914;下: 第一步: 东革阿里的预处理 东革阿里带皮枝干,粉碎至60目,阴凉处干燥保存; 第二步: 东革阿里的脱脂 东革阿里粉按质量体积比1:10加入95%乙醇浸泡24小?#20445;?#28024;泡后过滤,滤渣同法再重复浸泡1次,浸泡后东革阿里粉于阴凉处自然干燥,并于干燥环境保存备用; 第三步: 多糖浸提 3.1浸提 脱脂的东革阿里按1:20质量体积比加入蒸馏水,在100℃下于提取罐中浸提2小?#20445;?3.2离心 提取液于5000 r/min离心20min,分离上清和沉淀; 3.3复提 按3.1、3.2?#34903;?#26041;法再浸提1次,合并两次提取的上清液; 3.4除杂 上清液经减压纸过滤除去微小颗粒,制备多糖浸提清液; 3.5 沉淀多糖 清?#21495;?#32553;至原体积的1/8,然后加入无水乙醇至溶液中乙醇最?#24352;?#24230;为80%,4℃沉淀24h后,5000 r/min离心15min,收集沉淀,并用95%乙醇洗涤沉淀1次,干燥,即为东革阿里醇沉多糖; 第四步: 多糖纯化 4.1超滤 东革阿里醇沉多糖加入蒸馏水,配置成25mg/mL溶液,用截留分子量为100 KDa超滤膜超滤;采用优化后超滤工艺:超滤压力1.2 Mpa,当多糖溶液体积超滤浓缩至原溶液体积的1/2倍?#20445;?#21521;浓缩液中补1/2倍原溶液体积的蒸馏水,继续超滤至浓缩液体积恢复为补水前体积,同法重复补水,直至总补水体积为原溶液体积的20倍,不再补水; 4.2 干燥 超滤浓缩液经进一步浓缩后,冷冻干燥或喷雾干燥,获得分子量大于100 KDa东革阿里多糖。

说明书


一种活性东革阿里多糖及制备方法
技术领域


本发明涉及一种活性东革阿里多糖及制备方法,属于天然植物活性多糖的提取分
离技术领域。


背景技术


东革阿里(
Eurycoma longifolia) 为苦木科( Simaroubaceae) 东革阿里属(

Eurycoma) 植物,为野生灌木,广泛分布于东南亚国家,越南、印度尼西亚和马?#27425;?#20122;,目前
在我国尚处于引种栽培阶段。东革阿里有“马?#27425;?#20122;人参”之称,全株均可入药,其中根部是
其药用主体,在治疗疟疾、发热及男性性功能障碍等疾病中具?#37026;?#33879;疗效。此外,其萃取物
还具有提升体力、减轻疲劳、?#26412;?#25239;溃疡以及抗高血压、糖尿病等功效。对东革阿里活性成
分的研究,主要集?#24615;?#33820;类和生物碱类等化合物,多糖作为一种被广泛认知的活性成?#37073;?#30446;
前涉及的研究非常少,并?#19968;?#24615;成分多分离自东革阿里根部,其他部位涉及较少。


多糖类化合物是目前主要的活性化合物之一,研究表明多糖具有护肝、降糖、调节
免疫、抗菌、抗肿瘤、利尿和解热等功效。本发明以东革阿里为原料,提取、分离到一种具有
促进益生菌增殖作用的东革阿里多糖,明确了该多糖的活性表?#37073;?#21516;时建立了该多糖的制
备方法,为产业化打下良好基础,因此东革阿里多糖具有良好的开发前景。


发明内容


本发明提供了一种活性东革阿里多糖及其制备方法,该多糖分子量大于100 KDa,
且具有极佳的促进发酵乳中益生菌增殖的作用。


本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:本发明以东革阿里为原料,提取、分
离到一种活性东革阿里多糖,?#22266;?#20379;了其制备方法。


一种活性东革阿里多糖的制备方法,其?#34903;?#22914;下:


1. 东革阿里的预处理


东革阿里带皮枝干,粉碎至60目,阴凉处干燥保存;


2. 东革阿里的脱脂


东革阿里粉按质量体积比1:10-1:20加入95%乙醇浸泡24小?#20445;?#28024;泡后过滤,滤渣同法
再重复浸泡1次,浸泡后东革阿里粉于阴凉处自然干燥,并于干燥环境保存备用;


3. 多糖浸提


3.1浸提 脱脂的东革阿里按1:10-1:30质量体积比加入蒸馏水,在80-100℃下于提取
罐中浸提1-3小?#20445;?br>

3.2离心 提取液于5000 r/min离心20min,分离上清和沉淀(东革阿里颗粒);


3.3复提 按3.1、3.2?#34903;?#26041;法再浸提1次,合并两次提取的上清液;


3.4除杂 上清液经减压纸过滤除去微小颗粒,制备多糖浸提清液;


3.5 沉淀多糖 清?#21495;?#32553;至原体积的1/8,然后加入无水乙醇至溶液中乙醇最?#24352;?#24230;为
80%,4℃沉淀24h后,5000 r/min离心15min,收集沉淀,并用95%乙醇洗涤沉淀1次,干燥,即
为东革阿里醇沉多糖;


4. 多糖纯化


4.1超滤 东革阿里醇沉多糖加入蒸馏水,配置成10-35mg/mL溶液,用截留分子量为100
KDa超滤膜超滤;采用优化后超滤工艺:超滤压力0.8-1.5 Mpa,当多糖溶液体积超滤浓缩至
原溶液体积的1/2倍?#20445;?#21521;浓缩液中补1/2倍原溶液体积的蒸馏水,继续超滤至浓缩液体积
恢复为补水前体积,同法重复补水,直至总补水体积为原溶液体积的15-40倍,不再补水;


4.2 干燥 超滤浓缩液经进一步浓缩后,冷冻干燥或喷雾干燥,获得分子量大于100
KDa东革阿里多糖。


优选地,一种活性东革阿里多糖的制备方法,其?#34903;?#22914;下:


1. 东革阿里的预处理


东革阿里带皮枝干,粉碎至60目,阴凉处干燥保存。


2. 东革阿里的脱脂


东革阿里粉按质量体积比1:10加入95%乙醇浸泡24小?#20445;?#28024;泡后过滤,滤渣同法再重复
浸泡1次,浸泡后东革阿里粉于阴凉处自然干燥,并于干燥环境保存备用。


3. 多糖浸提


3.1浸提 脱脂的东革阿里按1:20质量体积比加入蒸馏水,在100℃下于提取罐中浸提2
小?#20445;?br>

3.2离心 提取液于5000 r/min离心20min,分离上清和沉淀(东革阿里颗粒);


3.3复提 沉淀同法(按3.1、3.2?#34903;?#26041;法)再浸提1次,合并两次提取的上清液;


3.4除杂 上清液经减压纸过滤除去微小颗粒,制备多糖浸提清液;


3.5 沉淀多糖 清?#21495;?#32553;至原体积的1/8,然后加入无水乙醇至溶液中乙醇最?#24352;?#24230;为
80%,4℃沉淀24h后,5000 r/min离心15min,收集沉淀,并用95%乙醇洗涤沉淀1次,干燥,即
为东革阿里醇沉多糖。


4. 多糖纯化


4.1超滤 东革阿里醇沉多糖加入蒸馏水,配置成25mg/mL溶液,用截留分子量为100
KDa超滤膜超滤。采用优化后超滤工艺:超滤压力1.2 Mpa,当多糖溶液体积超滤浓缩至原溶
液体积的1/2倍?#20445;?#21521;浓缩液中补1/2倍原溶液体积的蒸馏水,继续超滤至浓缩液体积恢复
为补水前体积,同法重复补水,直至总补水体积为原溶液体积的20倍,不再补水。


4.2 干燥 超滤浓缩液经进一步浓缩后,冷冻干燥或喷雾干燥,获得分子量大于
100 KDa东革阿里多糖。


该多糖的分离纯化,主要采用超滤方法进?#23567;?#36229;滤法是利用物理截留方法,使小于
超滤膜截留分子量的小分子物质依靠压力和浓度差等从提取液中随透过液分离,大于超滤
膜截留分子量的大分子物质被完全保留。影响超滤法的主要因素有超滤膜截留分子量、超
滤压力、超滤补水方式和补水量等,这些因素最终决定多糖的主要性质,如分子量、多糖含
量和活性?#21462;?#26412;技术的参数是经我们实验研究比较提取率和生物活性,获得的既可以保证
较高提取率,又具有较佳生物活性的东革阿里多糖制备方法的参数。其提取率可以达到
4.52%,在发酵乳制作中添加1%该多糖,可使乳酸菌总数达7.58×10
9CFU/mL,远高于不添加
糖的阴性对照(8.13×10
7 CFU/mL)和添加蔗糖的对照(1.70×10
8 CFU/mL)。


本发明的有益效果是:本发明提供了一种分子量大于100 KDa东革阿里多糖,该多
糖可以有效促进发酵乳中益生菌增殖。本发明制备的东革阿里多糖提取率较高可以达到
4.52%,并且该多糖与传统方法制备的醇沉多糖,以及与醇沉多糖经脱色或脱蛋白纯化后获
得的脱色多糖或脱蛋白多糖相比,具有更好的促进发酵乳中益生菌增殖作用;与分子量大
于10 KDa的多糖相比,也具有更好的促进发酵乳中益生菌增殖作用。因此,该多糖是良好的
有益菌增殖促进?#31890;?#21487;作为生物活性物质添加到发酵乳制品中或单独开发调节肠道菌群功
能的保健食品,具有广泛的开发潜力和广阔的市场前景。


?#37237;?#35828;明


图 1为不同种类多糖促发酵乳中益生菌增殖作用的效果。


具体实施方式


?#32440;?#21512;?#37237;?#21644;具体实施方式对本发明作进一步说明,具体实施方式是为了更好地
解释和理解本发明,不是限制本发明,基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有
做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的?#27573;А?br>

实施例1


一种活性东革阿里多糖的制备方法,其?#34903;?#22914;下:


1. 东革阿里的预处理


东革阿里带皮枝干,粉碎至60目,阴凉处干燥保存。


2. 东革阿里的脱脂


东革阿里粉按质量体积比1:10加入95%乙醇浸泡24小?#20445;?#28024;泡后过滤,滤渣同法再重复
浸泡1次,浸泡后东革阿里粉于阴凉处自然干燥,并于干燥环境保存备用。


3. 多糖浸提


3.1浸提 脱脂的东革阿里按1:20质量体积比加入蒸馏水,在100℃下于提取罐中浸提2
小?#20445;?br>

3.2离心 提取液于5000 r/min离心20min,分离上清和沉淀(东革阿里颗粒);


3.3复提 沉淀同法再浸提1次,合并两次提取的上清液;


3.4除杂 上清液经减压纸过滤除去微小颗粒,制备多糖浸提清液;


3.5 沉淀多糖 清?#21495;?#32553;至原体积的1/8,然后加入无水乙醇至溶液中乙醇最?#24352;?#24230;为
80%,4℃沉淀24h后,5000 r/min离心15min,收集沉淀,并用95%乙醇洗涤沉淀1次,干燥,即
为东革阿里醇沉多糖。


4. 多糖纯化


4.1超滤 东革阿里醇沉多糖加入蒸馏水,配置成25mg/mL溶液,用截留分子量为100
KDa超滤膜超滤。采用优化后超滤工艺:超滤压力1.2 Mpa,当多糖溶液体积超滤浓缩至原溶
液体积的1/2倍?#20445;?#21521;浓缩液中补1/2倍原溶液体积的蒸馏水,继续超滤至浓缩液体积恢复
为补水前体积,同法重复补水,直至总补水体积为原溶液体积的20倍,不再补水。


4.2 干燥 超滤浓缩液经进一步浓缩后,冷冻干燥或喷雾干燥,获得分子量大于
100 KDa东革阿里多糖。该多糖提取率4.52%,该多糖中的总糖含量为48.6%(采用苯酚硫酸
法测定总糖)。


实施例2


一种活性东革阿里多糖的制备方法,其?#34903;?#22914;下:


1. 东革阿里的预处理


东革阿里带皮枝干,粉碎至60目,阴凉处干燥保存。


2. 东革阿里的脱脂


东革阿里粉按质量体积比1:20加入95%乙醇浸泡24小?#20445;?#28024;泡后过滤,滤渣同法再重复
浸泡1次,浸泡后东革阿里粉于阴凉处自然干燥,并于干燥环境保存备用。


3. 多糖浸提


3.1浸提 脱脂的东革阿里按1:30质量体积比加入蒸馏水,在95℃下于提取罐中浸提3
小?#20445;?br>

3.2离心 提取液于5000 r/min离心20min,分离上清和沉淀(东革阿里颗粒);


3.3复提 沉淀同法再浸提1次,合并两次提取的上清液;


3.4除杂 上清液经减压纸过滤除去微小颗粒,制备多糖浸提清液;


3.5 沉淀多糖 清?#21495;?#32553;至原体积的1/8,然后加入无水乙醇至溶液中乙醇最?#24352;?#24230;为
80%,4℃沉淀24h后,5000 r/min离心15min,收集沉淀,并用95%乙醇洗涤沉淀1次,干燥,即
为东革阿里醇沉多糖。


4. 多糖纯化


4.1超滤 东革阿里醇沉多糖加入蒸馏水,配置成10mg/mL溶液,用截留分子量为100
KDa超滤膜超滤。采用优化后超滤工艺:超滤压力1.5 Mpa,当多糖溶液体积超滤浓缩至原溶
液体积的1/2倍?#20445;?#21521;浓缩液中补1/2倍原溶液体积的蒸馏水,继续超滤至浓缩液体积恢复
为补水前体积,同法重复补水,直至总补水体积为原溶液体积的40倍,不再补水。


4.2 干燥 超滤浓缩液经进一步浓缩后,冷冻干燥或喷雾干燥,获得分子量大于
100 KDa东革阿里多糖。该多糖提取率4.26%,该多糖中的总糖含量为50.3%(采用苯酚硫酸
法测定总糖)。


实施例3


一种活性东革阿里多糖的制备方法,其?#34903;?#22914;下:


1. 东革阿里的预处理


东革阿里带皮枝干,粉碎至60目,阴凉处干燥保存。


2. 东革阿里的脱脂


东革阿里粉按质量体积比1:15加入95%乙醇浸泡24小?#20445;?#28024;泡后过滤,滤渣同法再重复
浸泡1次,浸泡后东革阿里粉于阴凉处自然干燥,并于干燥环境保存备用。


3. 多糖浸提


3.1浸提 脱脂的东革阿里按1:10质量体积比加入蒸馏水,在80℃下于提取罐中浸提1
小?#20445;?br>

3.2离心 提取液于5000 r/min离心20min,分离上清和沉淀(东革阿里颗粒);


3.3复提 沉淀同法再浸提1次,合并两次提取的上清液;


3.4除杂 上清液经减压纸过滤除去微小颗粒,制备多糖浸提清液;


3.5 沉淀多糖 清?#21495;?#32553;至原体积的1/8,然后加入无水乙醇至溶液中乙醇最?#24352;?#24230;为
80%,4℃沉淀24h后,5000 r/min离心15min,收集沉淀,并用95%乙醇洗涤沉淀1次,干燥,即
为东革阿里醇沉多糖。


4. 多糖纯化


4.1超滤 东革阿里醇沉多糖加入蒸馏水,配置成35mg/mL溶液,用截留分子量为100
KDa超滤膜超滤。采用优化后超滤工艺:超滤压力0.8 Mpa,当多糖溶液体积超滤浓缩至原溶
液体积的1/2倍?#20445;?#21521;浓缩液中补1/2倍原溶液体积的蒸馏水,继续超滤至浓缩液体积恢复
为补水前体积,同法重复补水,直至总补水体积为原溶液体积的15倍,不再补水。


4.2 干燥 超滤浓缩液经进一步浓缩后,冷冻干燥或喷雾干燥,获得分子量大于
100 KDa东革阿里多糖。该多糖提取率3.89%,该多糖中的总糖含量为46.9%(采用苯酚硫酸
法测定总糖)。


实施例4


促进肠道益生菌增殖作用


1 实验方法


1.1 发酵乳制备


严格按照无菌操作规范进行


1.原料乳(市售无菌奶,非脂乳固体≧8.5%,)水浴预热至40℃左右。


2.以无菌操作开启包装。塑料或纸盒(袋)装,用75 %酒精棉球消毒盒盖或袋口,用
灭菌剪刀切开,将原料乳缓慢加入无菌烧杯中。


3.加入纯净蔗糖或实验样品(添加量1%),用无菌玻璃棒搅拌溶解均?#21462;?br>

4.加入益生菌菌种(?#28909;?#38142;球菌、保加利亚乳杆菌、乳双歧杆菌、?#20154;?#20083;杆菌的混
合菌种,活菌总数为1×10
6CFU/mL),添加量为16.7%。


5.灌装,分装于无菌烧杯中,并封口包扎。


6.放入恒温培养箱中培养8h,培养温度为45℃。


1.2 乳酸菌计数


根据待检样品活菌总数的估?#30130;?#36873;2个~3个连续的适宜稀释度,每个稀释度用1mL移液
器吸取0.1mL样品匀液分别置于3个MRS琼脂平板,使用涂?#21450;?#36827;行表面涂布。36℃±1℃,厌
氧培养48 h±2 h后计数平板上的所有菌落数。从样品稀释到平板涂?#23478;?#27714;在15min 内完
成。


1.3 结果的表述


选取菌落数在30 CFU~300 CFU 之间的平板计数菌落总数。如果只有一个稀释度菌落
总数在适宜计数?#27573;?#20869;,则可以求菌落总数的平均值,再将平均值乘以相应稀释倍数。如两
个稀释度均在这一?#27573;В?#21017;按公式计算:






式中:N——样品中菌落数;


Σ
C——平板(含适宜?#27573;?#33740;落数的平板)菌落数之和;


n
1——第一稀释度(低稀释倍数)平板个数;


n
2——第二稀释度(高稀释倍数)平板个数;


d——稀释因子(第一稀释度)。


2 实验结果


由图1可见,添加本发明多糖制备的发酵乳,乳酸菌总数达7.58×10
9 CFU/mL(取对数
后为9.88),添加分子量大于10kDa多糖,乳酸菌总数达3.09×10
9 CFU/mL(取对数后为
9.49),两者在促进发酵乳中益生菌增殖作用效果上都明?#26434;?#20110;传统方法制备的醇沉多糖
(5.13×10
8 CFU/mL,取对数8.71),也明?#26434;?#20110;醇沉多糖经脱色和脱蛋白纯化后获得的脱
色多糖(5.75×10
8 CFU/mL,取对数8.76)和脱蛋白多糖(7.24×10
8 CFU/mL,取对数8.86)。
本发明多糖和分子量大于10kDa 多糖相比,也具有更好的促发酵乳中益生菌增殖作用,有
显著差异。表明经我们实验研究确立的本技术的参数,可以保证获得既有较高提取率,又具
有极佳生物活性的东革阿里多糖。


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