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一种脐带血NK细胞的培养方法.pdf

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一种 脐带血 NK 细胞 培养 方法
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摘要
申请专利号:

CN201910043593

申请日:

20190117

公开号:

CN109486759A

公开日:

20190319

当前法律?#21050;?/td>

实质审查的生效

有效性:

审中

法?#19978;?#24773;: 实质审查的生效
IPC分类号: C12N5/0783 主分类号: C12N5/0783
申请人: 汇麟生物科技(北京)有限公司
发明人: 施琳
地址: 100176 北京市北京经济技术开发区经海三路109号院8号楼4层408室
优先权:
专利代理机构: 11371 代理人: 赵丽娜
PDF完整版下载: PDF下载
法律?#21050;?/div>
申请(专利)号:

CN201910043593

授权公告号:

法律?#21050;?#20844;告日:

20190412

法律?#21050;?#31867;型:

实质审查的生效

摘要

本发明涉及细胞培养领域,特别涉及一种脐带血NK细胞的培养方法,包括以下步骤:由脐带血分离得到的PBMC细胞接种于包被有CD16单抗的培养容器中培养,培养体系是在VIVO?15基础培养基的基础上添加FBS、IL?2、IL?12、IL?15;培养4?4.5天后,扩培,扩培接种于包被有CD16单抗的培养容器中培养,扩培所用的培养体系是在GT?T581基础培养基的基础上添加FBS、IL?2、IL?7、IL?12、IL?15、IL?21。本发明提供的脐带血NK细胞的培养方法,通过在不同的基础培养基上添加不同的组分进行初始培养和扩培,操作简便,成?#38236;停?#33021;得到大量满足临床使用标准的NK细胞,使该方法更利于推广和应用。

权利要求书

1.一种脐带血NK细胞的培养方法,其特征在于,包括以下步骤: 由脐带血分离得到的PBMC细胞接种于包被有CD16单抗的培养容器中进行培养,培养体系是在VIVO-15基础培养基的基础上添加以下组分:以培养体系的体积计,FBS 50±2μL/mL,IL-2 500±10IU/mL,IL-12 2.5±0.2ng/mL,IL-15 20±2ng/mL; 培养4-4.5天后,进行扩培,扩培接种于包被有CD16单抗的培养容器中进行培养,扩培所用的培养体系是在GT-T581基础培养基的基础上添加以下组分:以培养体系的体积计,FBS 50±2μL/mL,IL-2 500±10IU/mL,IL-7 1ng±0.1ng/mL,IL-12 2.5±0.2ng/mL,IL-15 50±2ng/mL,IL-21 2ng±0.2; 所述扩培次数至少一次。 2.根据权利要求1所述的脐带血NK细胞的培养方法,其特征在于,所述包被有CD16单抗的培养容器均采用以下方法制备: 以所述培养面积为25cm2计,加入含有3±1μg的CD16单抗和1±0.2mL的D-PBS,在细胞培养条件下包被3.5h~4.5h。 3.根据权利要求1所述的脐带血NK细胞的培养方法,其特征在于,PBMC细胞培养的密度为0.5×106/mL-2.0×106/mL。 4.根据权利要求1所述的脐带血NK细胞的培养方法,其特征在于,所述脐带血采用Ficoll密度梯度分离提取PBMC细胞。 5.根据权利要求1-4任一项所述的脐带血NK细胞的培养方法,其特征在于,每次扩培的倍数为2-5倍。 6.根据权利要求1-4任一项所述的脐带血NK细胞的培养方法,其特征在于,每次扩培的倍数为2-3倍。 7.根据权利要求1-4任一项所述的脐带血NK细胞的培养方法,其特征在于,所述扩培次数为2-4次。 8.根据权利要求1-4任一项所述的脐带血NK细胞的培养方法,其特征在于,所述扩培次数为3-4次。 9.根据权利要求1-4任一项所述的脐带血NK细胞的培养方法,其特征在于,所述培养体系均以培养面积为25cm2计,培养体系的体积为5-9mL。 10.根据权利要求1-4任一项所述的胎盘血CIK细胞的培养方法,其特征在于,所述扩培每次培养时间为3-3.5天。

说明书


一种脐带血NK细胞的培养方法
技术领域


本发明涉及细胞培养领域,具体而言,涉及一种脐带血NK细胞的培养方法。


背景技术


NK细胞又称为自然杀伤细胞,属于大颗粒淋巴细胞,来源于骨髓,分布于外周血、
肝脏及脾脏,少量分布于淋巴结及其他组织中,占外周血淋巴细胞的5%~15%,是重要的
免疫细胞。NK细胞是身体初期防御的重要机构,具有强力的细胞毒活性。同时发?#29992;?#30123;调节
作用,快速提升免疫力和康复质量科学家在1975年首次鉴定到了NK细胞,这类细胞能够在
缺少T、B细胞的情况下直?#30001;?#20260;肿瘤细胞。与具有细胞毒性的CD8+T细胞不同,NK细胞杀伤
肿瘤细胞时不需要预先致敏可以直?#30001;?#20260;MHC阴性的肿瘤细胞,这使得NK细胞在过继细胞
免疫治疗中被广泛应用。但NK细胞在外周血淋巴细胞中所占的比例?#31995;停?#25152;以有必要建立
一种NK细胞体外扩增技术,用于研究NK细胞的功能并为肿瘤的细胞免疫治疗奠定基础。


近年来,有人采用基因工程的方法在K562细胞上同?#21271;?#36798;IL-15、CD137L等分子,
并?#28304;?#32454;胞来刺激NK细胞的增殖。或者使用磁珠筛选CD56-细胞等方法培养NK细胞。上述方
法在操作条件和成本上都?#32454;擼?#20026;NK细胞的临床使用造成了一定的困?#36873;?br>

有鉴于此,特提出本发明。


发明内容


本发明的目的在于提供一种脐带血NK细胞的培养方法,操作简便,成?#38236;停?#33021;得到
大量满足临床使用标准的NK细胞,使该方法更利于推广和应用。


为了实现本发明的上述目的,特采用以下技术方案:


一种脐带血NK细胞的培养方法,包括以下步骤:


由脐带血分离得到的PBMC细胞接种于包被有CD16单抗的培养容器中进行培养,培
养体系是在VIVO-15基础培养基的基础上添加以下组分:以培养体系的体积计,FBS 50±2μ
L/mL,IL-2 500±10IU/mL,IL-12 2.5±0.2ng/mL,IL-15 20±2ng/mL;


培养4-4.5天后,进行扩培,扩培接种于包被有CD16单抗的培养容器中进行培养,
扩培所用的培养体系是在GT-T581基础培养基的基础上添加以下组分:以培养体系的体积
计,FBS 50±2μL/mL,IL-2 500±10IU/mL,IL-7 1ng±0.1ng/mL,IL-12 2.5±0.2ng/mL,
IL-15 50±2ng/mL,IL-21 2ng±0.2;


所述扩培次数至少一次。


本发明提供的脐带血NK细胞的培养方法,通过在不同的基础培养基上添加不同的
组分进行初始培养和扩培,操作简便,成?#38236;停?#33021;得到大量满足临床使用标准的NK细胞,使
该方法更利于推广和应用。


进一步地,所述包被有CD16单抗的培养容器均采用以下方法制备:


以所述培养面积为25cm
2计,加入含有3±1μg的CD16单抗和1±0.2mL的D-PBS,在
细胞培养条件下包被3.5h~4.5h。


进一步地,PBMC细胞培养的密度为0.5×10
6/mL-2.0×10
6/mL。


如在不同的实施例中,PBMC细胞培养的密度可以为0.5×10
6/mL、1×10
6/mL、1.5×
10
6/mL、2.0×10
6/mL等?#21462;?br>

进一步地,所述脐带血采用Ficoll密度梯度分离提取PBMC细胞。


进一步地,每次扩培的倍数为2-5倍。


如在不同的实施例中,每次扩培的倍数可以为2倍、3倍、4倍、5倍以及这些数值之
间的?#25105;?#19968;个数值的倍数等?#21462;?br>

进一步地,每次扩培的倍数为2-3倍。


进一步地,所述扩培次数为2-4次。


如在不同的实施例中,扩培次数可以为2次、3次、4次等?#21462;?br>

进一步地,所述扩培次数为3-4次。


本发明发现,以3倍的扩培倍数扩培3次,能够有效的得到符合临床要求的NK细胞。


进一步地,所述培养体系均以培养面积为25cm
2计,培养体系的体积为5-9mL。


如在不同的实施方式中,培养面积为25cm
2,培养体系的体积可以为5mL、6mL、7mL、
8mL、9mL等?#21462;?br>

如在不同的实施方式中,培养面积为75cm
2,培养体系的体积可以为15mL、20mL、
22mL、25mL、27mL等?#21462;?br>

如在不同的实施方式中,培养面积为175cm
2,培养体系的体积可以为35mL、40mL、
45mL、50mL、55mL、58mL、60mL、63mL等?#21462;?br>

进一步地,所述扩培每次培养时间为3-3.5天。


即每次扩培时,培养的时间为3-3.5天。


本发明中,培养条件均为37℃、5%CO
2,饱和湿度。


与现有技术相比,本发明的有益效果为:


(1)本发明提供的脐带血NK细胞的培养方法,通过相应的培养基以及营养因子添
加,能有效的激发NK细胞的有效扩增,得到的NK细胞满足临床使用标准。


(2)本发明提供的脐带血NK细胞的培养方法,总体细胞增殖倍数多,均在75倍以
上,得到较多量的满足临床使用标准的NK细胞,


(3)本发明提供的脐带血NK细胞的培养方法,操作简便,成?#38236;停?#26356;利于推广和应
用。


附图说明


为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,以下将对实施例或现
有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。


图1为本发明实施例1培养得到的NK细胞表面标志物进行检测的结果图;


图2为本发明实施例1培养得到的NK细胞另一个表面标志物进行检测的结果图。


具体实施方式


下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将会
理解,下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体
条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为
可以通过市售购买获得的常规产品。


实施例1


一种脐带血NK细胞的培养方法,步骤如下:


1.1脐带血NK细胞培养基


1)基础培养基:VIVO-15,GT-T581;


2)添加物:FBS,IL-2,IL-12,IL-15,CD16单抗;


1.2脐带血NK细胞方法


1)包被:取T25培养瓶,加1mLD-PBS,加3μgCD16单抗,放入37℃培养箱包被4h。


2)PBMC分离:用Ficoll密度梯度分离提取PBMC细胞。


3)用VIVO-15培养基调整细胞密度为约1×10
6/mL接种到包被过的T25培养瓶中,
5mL/瓶。


4)第0天加FBS 250μL,加IL-2:2500IU,IL-12:12.5ng,IL-15:100ng。


5)第4天,包被1个T75培养瓶,加3mLD-PBS,加9μg CD16单抗,放入37℃培养箱包被
4h。取出T75瓶,倒去包被?#28023;?#23558;T25瓶中细胞转移到T75培养瓶中,补充15mL GT-T 581培养
基,使培养基总量为20mL,?#37259;?#32456;培养体积补加IL-2:10000U,IL-7:20ng,IL-12:50ng,IL-
15:1μg,IL-21:40ng,FBS:1mL。


6)第7天包被3个T75培养瓶,?#31185;?#21152;3mLD-PBS,加9μgCD16单抗,放入37℃培养箱包
被4h。取出T75瓶,倒去包被?#28023;?#23558;之前T75瓶中细胞分别均匀的转移到3个T75培养瓶中,每
瓶加14mL GT-T581培养基,按20ml培养基,体系分别加IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21和
FBS。


7)第10天包被3个T175培养瓶,?#31185;?#21152;10mLD-PBS,加30μgCD16单抗,放入37℃培养
箱包被4h。取出T175瓶,倒去包被?#28023;?#23558;之前T75瓶中细胞分别均匀的转移到3个T175培养瓶
中,?#31185;?#21152;40mL GT-T581培养基,按60mL最终体积加入IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21和
FBS。


8)第14天收获细胞,统计细胞数量。


得到的细胞进行流式检测,结果如图1和图2所示。


统计的结果如表1所示。


表1细胞总体扩增信息










0天脐带血PBMC总数(×10
6)


5




第14天收获细胞总数(×10
6)


380




细胞总数扩增倍数


76






本方法具有以下优势:


1.通过本方法培养的脐带血NK细胞,细胞可以增殖76倍,加大初始培养量,可以满
足临床使用细胞数量。


2.通过本方法培养的脐带血NK细胞,流式检测结果(图1和图2),CD3
-CD56
+NK细胞
比例为39.1%,CD4
+CD25
+Treg细胞比例为2.6%,NK细胞比例正常,免疫?#31181;?#32454;胞比例很低,
可以满足临床使用标准。


实施例2


一种脐带血NK细胞的培养方法,步骤如下:


1.1脐带血NK细胞培养基


1)基础培养基:VIVO-15,GT-T581;


2)添加物:FBS,IL-2,IL-12,IL-15,CD16单抗;


1.2脐带血NK细胞方法


1)包被:取T25培养瓶,加1mLD-PBS,加3μgCD16单抗,放入37℃培养箱包被4h。


2)PBMC分离:用Ficoll密度梯度分离提取PBMC细胞。


3)用VIVO-15培养基调整细胞密度为约0.5×10
6/mL接种到包被过的T25培养瓶
中,5mL/瓶。


4)第0天加FBS 250μL,加IL-2:2500IU,IL-12:12.5ng,IL-15:100ng。


5)第4天,包被1个T75培养瓶,加3mLD-PBS,加9μg CD16单抗,放入37℃培养箱包被
4h。取出T75瓶,倒去包被?#28023;?#23558;T25瓶中细胞转移到T75培养瓶中,补充15mL GT-T 581培养
基,使培养基总量为20mL,?#37259;?#32456;培养体积补加IL-2:10000U,IL-7:20ng,IL-12:50ng,IL-
15:1μg,IL-21:40ng,FBS:1mL。


6)第7天包被3个T75培养瓶,?#31185;?#21152;3mLD-PBS,加9μgCD16单抗,放入37℃培养箱包
被4h。取出T75瓶,倒去包被?#28023;?#23558;之前T75瓶中细胞分别均匀的转移到3个T75培养瓶中,每
瓶加14mL GT-T581培养基,按20ml培养基,体系分别加IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21和
FBS。


7)第10天包被3个T175培养瓶,?#31185;?#21152;10mLD-PBS,加30μgCD16单抗,放入37℃培养
箱包被4h。取出T175瓶,倒去包被?#28023;?#23558;之前T75瓶中细胞分别均匀的转移到3个T175培养瓶
中,?#31185;?#21152;40mL GT-T581培养基,按60mL最终体积加入IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21和
FBS。


8)第14天收获细胞,统计细胞数量。


经统计和检测,细胞总数以及NK细胞扩增倍数同实施例1基本一致。


本方法培养的脐带血NK细胞,流式检测结果,NK细胞比例正常,免疫?#31181;?#32454;胞比例
很低,可以满足临床使用标准。


实施例3


一种脐带血NK细胞的培养方法,步骤如下:


1.1脐带血NK细胞培养基


1)基础培养基:VIVO-15,GT-T581;


2)添加物:FBS,IL-2,IL-12,IL-15,CD16单抗;


1.2脐带血NK细胞方法


1)包被:取T25培养瓶,加1mLD-PBS,加3μgCD16单抗,放入37℃培养箱包被4h。


2)PBMC分离:用Ficoll密度梯度分离提取PBMC细胞。


3)用VIVO-15培养基调整细胞密度为约2×10
6/mL接种到包被过的T25培养瓶中,
5mL/瓶。


4)第0天加FBS 250μL,加IL-2:2500IU,IL-12:12.5ng,IL-15:100ng。


5)第4天,包被1个T75培养瓶,加3mLD-PBS,加9μg CD16单抗,放入37℃培养箱包被
4h。取出T75瓶,倒去包被?#28023;?#23558;T25瓶中细胞转移到T75培养瓶中,补充15mL GT-T 581培养
基,使培养基总量为20mL,?#37259;?#32456;培养体积补加IL-2:10000U,IL-7:20ng,IL-12:50ng,IL-
15:1μg,IL-21:40ng,FBS:1mL。


6)第7天包被3个T75培养瓶,?#31185;?#21152;3mLD-PBS,加9μgCD16单抗,放入37℃培养箱包
被4h。取出T75瓶,倒去包被?#28023;?#23558;之前T75瓶中细胞分别均匀的转移到3个T75培养瓶中,每
瓶加14mL GT-T581培养基,按20ml培养基,体系分别加IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21和
FBS。


7)第10天包被3个T175培养瓶,?#31185;?#21152;10mLD-PBS,加30μgCD16单抗,放入37℃培养
箱包被4h。取出T175瓶,倒去包被?#28023;?#23558;之前T75瓶中细胞分别均匀的转移到3个T175培养瓶
中,?#31185;?#21152;40mL GT-T581培养基,按60mL最终体积加入IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21和
FBS。


8)第14天收获细胞。


经统计和检测,细胞总数以及NK细胞扩增倍数同实施例1基本一致。


本方法培养的脐带血NK细胞,流式检测结果,NK细胞比例正常,免疫?#31181;?#32454;胞比例
很低,可以满足临床使用标准。


对比例1


与实施例1不同的是,VIVO-15培养基的初始培养以及GT-T 581培养基的扩培中,
额外的组?#31181;?#28155;加IL-2,添加?#23458;?#23454;施例1。


统计以及检测不同的细胞数,结果如下。


表2细胞总体扩增信息










0天脐带血PBMC总数(×10
6)


5




第14天收获细胞总数(×10
6)


115




细胞总数扩增倍数


23






对比例2


与实施例1不同的是,VIVO-15培养基的初始培养以及GT-T 581培养基的扩培中,
额外的组?#31181;?#28155;加IL-2和IL-12,添加?#23458;?#23454;施例1。


统计以及检测不同的细胞数,结果如下。


表3细胞总体扩增信息










0天脐带血PBMC总数(×10
6)


5




第14天收获细胞总数(×10
6)


155




细胞总数扩增倍数


31






对比例3


与实施例1不同的是,GT-T 581培养基的扩培中,额外的组?#31181;?#28155;加IL-2、IL-12和
IL-15。


统计以及检测不同的细胞数,结果如下。


表4细胞总体扩增信息










0天脐带血PBMC总数(×10
6)


5




第14天收获细胞总数(×10
6)


145




细胞总数扩增倍数


29






对比例4


与实施例1不同的是,GT-T 581培养基的扩培中,额外的组?#31181;?#28155;加IL-2、IL-15和
IL-21。


统计以及检测不同的细胞数,结果如下。


表5细胞总体扩增信息










0天脐带血PBMC总数(×10
6)


5




第14天收获细胞总数(×10
6)


215




细胞总数扩增倍数


43






对比例5


与实施例1不同的是,整个培养过程中,基础培养基均为VIVO-15培养基。


统计以及检测不同的细胞数,结果如下。


表6细胞总体扩增信息










0天脐带血PBMC总数(×10
6)


5




第14天收获细胞总数(×10
6)


280




细胞总数扩增倍数


56






对比例6


与实施例1不同的是,整个培养过程中,基础培养基均为GT-T581培养基。


统计以及检测不同的细胞数,结果如下。


表7细胞总体扩增信息










0天脐带血PBMC总数(×10
6)


5




第14天收获细胞总数(×10
6)


245




细胞总数扩增倍数


49






从上述内容可以看出,本发明提供的脐带血NK细胞的培养方法,能有效的扩增NK
细胞,方法简便,更好的满足临床的需求。


尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明,然而应意识到,在不背离本发明的
精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此,这意味着在所附权利要求中
包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。


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本文标题:一种脐带血NK细胞的培养方法.pdf
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