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一种可识别蛋白质的分子印迹水凝胶修饰电极的制备方法.pdf

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一种 识别 蛋白质 分子 印迹 凝胶 修饰 电极 制备 方法
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摘要
申请专利号:

CN201910047334

申请日:

20190117

公开号:

CN109632922A

公开日:

20190416

当前法律状态:

公开

有效性:

审中

法?#19978;?#24773;: 公开
IPC分类号: G01N27/48;G01N27/30 主分类号: G01N27/48;G01N27/30
申请人: 天津工业大学
发明人: 赵孔银;齐梦;白甜;杨正春;鲍奇文;夏伦;冯荟如;王慧泉;魏俊富
地址: 300387 天津市西青区宾水西道399号
优先权:
专利代理机构: 代理人:
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法律状态
申请(专利)号:

CN201910047334

授权公告号:

法律状态公告日:

20190416

法律状态类型:

公开

摘要

本发明提供了一种可识别蛋白质的分子印迹水凝胶修饰电极的制备方法。首先用3?氨基丙基三乙氧基硅烷?#36816;?#32593;印刷技术制备的裸碳电极进行表面处理引入氨基。随后将引入氨基的裸碳电极浸泡到模板蛋白质、海藻酸钠和增强剂的混合水溶液中,再将涂覆混合水溶液的裸碳电极浸泡在氯化钙水溶液中交联,得到表层含蛋白质的水凝胶修饰的裸碳电极。最后用缓冲溶液将模板蛋白质洗脱掉,得到可识别蛋白质的分子印迹水凝胶修饰电极,通过伏安曲线监测蛋白质的选择性吸附。本方法制备的分子印迹水凝胶修饰电极具有原料用?#21487;佟?#26448;料成?#38236;汀?#21046;备简单、操作方便、生物相容性好等优点,在蛋白质分析检测领域具有潜在的应用前景。

权利要求书

1.一种可识别蛋白质的分子印迹水凝胶修饰电极的制备方法,其特征?#21069;?#25324;以下步骤: a)将?#26790;?#27700;乙醇清?#26149;?#30340;丝网印刷技术制备的裸碳电极浸泡到质量百分比为0.01%-2%的3-氨基丙基三乙氧基硅烷水溶液中2-24小时,在裸碳电极表面引入氨基; b)配制蛋白质质量百分比浓度为0.01%-5%,海藻酸钠质量百分比浓度为0.1%-5%,增强剂质量百分比浓度为0.1%-10%的混合物水溶?#28023;?#38745;置消泡放置于无菌容器中备用; c)配制氯化钙质量百分比浓度为0.1%-10%的氯化钙水溶?#28023;?d)将步骤b)得到的混合物水溶?#28023;?#22343;匀地涂覆在步骤a)得到的表面引入氨基的裸碳电极上,利用氨基与海藻酸钠上的羧基之间的相互作用使海藻酸钠分子结合在裸碳电极表面;通过调节海藻酸钠的质量百分比浓度调节溶液粘度,从而控制混合物水溶液的涂覆厚度为10-200微米;立即将涂覆步骤b)得到的混合物水溶液的裸碳电极浸泡到步骤c)得到的氯化钙水溶液1-24小时,得?#33014;?#34507;白质的水凝胶修饰电极;由于丝网印刷技术制备的裸碳电极可以做成各种形态和大小,步骤b)得到的混合物水溶液能结合到不同各种形态和大小的电极上,?#28082;?#24230;可控,可以用0.01-100毫升的混合物水溶液制备大小不同的水凝胶修饰电极,对于特别昂贵的蛋白质具有价格优势; e)将步骤d)得到的含蛋白质的水凝胶修饰电极用洗脱?#21512;?#33073;掉蛋白质,得到可识别蛋白质的分子印迹水凝胶修饰电极;以分子印迹水凝胶修饰电极作为工作电极,银电极作为参比电极,铂片作为辅助电极,采用循环伏安法测试蛋白质的吸附及选择性识别性能;由于分子印迹水凝胶修饰电极上的分子印迹水凝胶可做?#33014;?#34180;,因此蛋白质洗脱和吸附较快,检测时间短,灵敏度高; f)由于在制备过程中没有引入有毒有害试剂,没有聚合反应热引起蛋白质构象的变化,洗脱蛋白质的过程也比较温和,因此步骤e)得到的可识别蛋白质的分子印迹水凝胶修饰电极生物相容性好,识别性能高,在蛋白质分析检测领域具有良好的应用前景。 2.如权利要求1所述一种可识别蛋白质的分子印迹水凝胶修饰电极的制备方法,其特征是所述的蛋白质为牛血清蛋白、卵清蛋白、粘连蛋白、转化生长因子、溶菌酶中的?#25105;?#19968;种或两种以上混合物。 3.如权利要求1所述一种可识别蛋白质的分子印迹水凝胶修饰电极的制备方法,其特征是所述的增强剂为氧化石墨烯、羧化多壁碳纳米管、羧甲基壳聚糖、羧化二氧化钛中的?#25105;?#19968;种或两种以上混合物;增强剂的作用一方面可以提高海藻酸钙水凝胶的强度,另一方面也?#32435;?#20102;其导电性能。 4.如权利要求1所述一种可识别蛋白质的分子印迹水凝胶修饰电极的制备方法,其特征是所述的洗脱液为磷酸盐缓冲溶液、Tris-HCl缓冲溶液、醋酸缓冲溶液、硼酸盐缓冲溶液中的?#25105;?#19968;种。

说明书


一种可识别蛋白质的分子印迹水凝胶修饰电极的制备方法
技术领域


本发明涉及一种可识别蛋白质的分子印迹水凝胶修饰电极的制备方法,属于功能
材料、电化学和生物材料领域。


本发明涉及水凝胶、分子印迹、蛋白质检测,电极及电化学等技术领域。具体涉及
一种分子印迹水凝胶的合成方法,及由该蛋白质分子印迹水凝胶丝网印刷裸碳电极的制备
方法和检测应用。


背景技术


随着人工智能的发展以及越来越高的检测要求,各种传感器应运而生,如酶生物
传感器、细胞传感器、DNA生物传感器、组织传感器和微生物传感器等。电化学生物传感器具
有选择性和特异性,是定量或半定量检测物质的理想分析工具,已广泛应用于食品分析、环
境监测、发酵、医药、军事等领域。


分子印迹聚合物(MIP)与电化学生物传感器的结合引起了人们的广泛关注。分子
印迹是一种制备具有特定结合位点聚合物的技术,已广泛应用于固相萃取、仿生传感器、色
谱分离和药物控释等领域。尽管分子印迹技术发展迅速,但大多数印迹模板都是小分子的,
大分子模板,如蛋白质分子印迹相对较少,主要原因在于蛋白质结构的复?#26377;浴?#26500;象的高度
灵活性和蛋白质序列的多样性。许多研究者克服了蛋白质分子印迹的缺点,致力于分子印
迹与传感器的结合。Li等人[ACS Sensors,2018,3,378-385]研究了MIP纳米颗粒对牛血红
蛋白(Hb)的检测,在吸附蛋白质为0.05~0.5mg*mL-1范围内,电化学信号表现出良好的动
态响应。


水凝胶具有高的含水率和良好的生物相容性,并能保持蛋白质构象,可以应用于
蛋白质分子印迹。虽然水凝胶MIPs对模板蛋白有很高的选择性,但蛋白质在水凝胶中扩散
非常缓慢。表面印迹可以解决蛋白质扩散问题[Polymers,2018,10(2):170-183]。赵孔银等
人以牛血清白蛋白(BSA)为模板分子,丙烯酰胺为功能单体,制备了BSA印迹聚丙烯酰胺水
凝胶。然而,水凝胶聚合的热或引发条件会导致蛋白质构象的变化和变性。Peppas等以BSA
为模板,海藻酸钠(NaAlg)为功能单体,CaCl2为交联剂,制备了BSA印迹海藻酸钙膜
[J.Biomater.Sci.,Polym.Ed.2011,22,1523-1534]和微胶囊[Ind.Eng.Chem.Res.2010,
49,9811-9814],但由于海藻酸钙水凝胶膜过厚,微胶囊较大(?#26412;?-3mm),MIP对BSA吸附速
度?#19979;?#21560;附能力较低。


本发明提供了一种可识别蛋白质的分子印迹水凝胶修饰电极的制备方法。首先用
3-氨基丙基三乙氧基硅烷?#36816;?#32593;印刷技术制备的裸碳电极进行表面处理引入氨基。随后将
引入氨基的裸碳电极浸泡到模板蛋白质、海藻酸钠和增强剂的混合水溶液中,再将涂覆混
合水溶液的裸碳电极浸泡在氯化钙水溶液中交联,得到表层含蛋白质的水凝胶修饰的裸碳
电极。最后用缓冲溶液将模板蛋白质洗脱掉,得到可识别蛋白质的分子印迹水凝胶修饰电
极,通过伏安曲线监测蛋白质的选择性吸附。本方法制备的分子印迹水凝胶修饰电极具有
原料用?#21487;佟?#26448;料成?#38236;汀?#21046;备简单、操作方便、生物相容性好等优点,在蛋白质分析检测中
具有潜在的应用前景。


发明内容


针对现有技术的不足,本发明拟解决的技术问题是水凝胶在聚合过程中的热量或
引发条件会导致蛋白质变性,普通水凝胶修饰电极导电性和灵敏性差,以及普通电极对蛋
白质没有识别性能等问题。


本发明解决所述水凝胶在聚合过程中的热量或引发条件会导致蛋白质变性,普通
水凝胶修饰电极导电性和灵敏性差,以及普通电极对蛋白质没有识别性能等问题的技术方
案是提供一种可识别蛋白质的分子印迹水凝胶修饰电极的制备方法。


本发明提供了一种可识别蛋白质的分子印迹水凝胶修饰电极的制备方法,其特征
?#21069;?#25324;以下步骤:


a)将?#26790;?#27700;乙醇清?#26149;?#30340;丝网印刷技术制备的裸碳电极浸泡到质量百分比为
0.01%-2%的3-氨基丙基三乙氧基硅烷水溶液中2-24小时,在裸碳电极表面引入氨基;


b)配制蛋白质质量百分比浓度为0.01%-5%,海藻酸钠质量百分比浓度为0.1%-
5%,增强剂质量百分比浓度为0.1%-10%的混合物水溶?#28023;?#38745;置消泡放置于无菌容器中备
用;


c)配制氯化钙质量百分比浓度为0.1%-10%的氯化钙水溶?#28023;?br>

d)将步骤b)得到的混合物水溶?#28023;?#22343;匀地涂覆在步骤a)得到的表面引入氨基的裸
碳电极上,利用氨基与海藻酸钠上的羧基之间的相互作用使海藻酸钠分子结合在裸碳电极
表面;通过调节海藻酸钠的质量百分比浓度调节溶液粘度,从而控制混合物水溶液的涂覆
厚度为10-200微米;立即将涂覆步骤b)得到的混合物水溶液的裸碳电极浸泡到步骤c)得到
的氯化钙水溶液1-24小时,得?#33014;?#34507;白质的水凝胶修饰电极;由于丝网印刷技术制备的裸
碳电极可以做成各种形态和大小,步骤b)得到的混合物水溶液能结合到不同各种形态和大
小的电极上,?#28082;?#24230;可控,可以用0.01-100毫升的混合物水混合物水溶液制备大小不同的
水凝胶修饰电极,对于特别昂贵的蛋白质具有价格优势;


e)将步骤d)得到的含蛋白质的水凝胶修饰电极用洗脱?#21512;?#33073;掉蛋白质,得到可识
别蛋白质的分子印迹水凝胶修饰电极;以分子印迹水凝胶修饰电极作为工作电极,银电极
作为参比电极,铂片作为辅助电极,采用循环伏安法测试蛋白质的吸附及选择性识别性能;
由于分子印迹水凝胶修饰电极上的分子印迹水凝胶可做?#33014;?#34180;,因此蛋白质洗脱和吸附较
快,检测时间短,灵敏度高;


f)由于在制备过程中没有引入有毒有害试剂,没有聚合反应热引起蛋白质构象的
变化,洗脱蛋白质的过程也比较温和,因此步骤e)得到的可识别蛋白质的分子印迹水凝胶
修饰电极生物相容性好,识别性能高,在蛋白质分析检测中具有良好的应用前景。


本发明所述的蛋白质为牛血清蛋白、卵清蛋白、粘连蛋白、转化生长因子、溶菌酶
中的?#25105;?#19968;种或两种以上混合物;所述的增强剂为氧化石墨烯、羧化多壁碳纳米管、羧甲基
壳聚糖、羧化二氧化钛中的?#25105;?#19968;种或两种以上混合物;所述的洗脱液为磷酸盐缓冲溶液、
Tris-HCl缓冲溶液、醋酸缓冲溶液、硼酸盐缓冲溶液中的?#25105;?#19968;种。


具体实施方式


下面介绍本发明的具体实施例,但本发明不受实施例的限制。


实施例1.


a)将?#26790;?#27700;乙醇清?#26149;?#30340;丝网印刷技术制备的裸碳电极浸泡到质量百分比为
0.01%的3-氨基丙基三乙氧基硅烷水溶液中2小时,在裸碳电极表面引入氨基;


b)配制牛血清白蛋白质量百分比浓度为0.1%,海藻酸钠质量百分比浓度为
0.1%,氧化石墨烯质量百分比浓度为0.1%的混合物水溶?#28023;?#38745;置消泡放置于无菌容器中
备用;


c)配制氯化钙质量百分比浓度为0.1%的氯化钙水溶?#28023;?br>

d)将步骤b)得到的混合物水溶?#28023;?#22343;匀地涂覆在步骤a)得到的表面引入氨基的裸
碳电极上,利用氨基与海藻酸钠上的羧基之间的相互作用使海藻酸钠分子结合在裸碳电极
表面;通过调节海藻酸钠的质量百分比浓度调节溶液粘度,从而控制混合物水溶液的涂覆
厚度为10微米;立即将涂覆步骤b)得到的混合物水溶液的裸碳电极浸泡到步骤c)得到的氯
化钙水溶液1小时,得?#33014;?#29275;血清白蛋白的水凝胶修饰电极;由于丝网印刷技术可以制备直
径为10毫米的圆形裸碳电极,步骤b)得到的混合物水溶液能结合到?#26412;?#20026;10毫米的圆形裸
碳电极上,?#28082;?#24230;可控,可以用0.05毫升的混合物水溶液制备水凝胶修饰电极;


e)将步骤d)得到的含牛血清白蛋白的水凝胶修饰电极用磷酸盐缓冲溶?#21512;?#33073;掉
牛血清白蛋白,得到可识别牛血清白蛋白的分子印迹水凝胶修饰电极;以分子印迹水凝胶
修饰电极作为工作电极,银电极作为参比电极,铂片作为辅助电极,采用循环伏安法测试牛
血清白蛋白的吸附及选择性识别性能;由于分子印迹水凝胶修饰电极上的分子印迹水凝胶
可做?#33014;?#34180;,因此牛血清白蛋白洗脱和吸附较快,检测时间短,灵敏度高;


f)由于在制备过程中没有引入有毒有害试剂,没有聚合反应热引起牛血清白蛋白
构象的变化,洗?#38597;?#34880;清白蛋白的过程也比较温和,因此步骤e)得到的可识别牛血清白蛋
白的分子印迹水凝胶修饰电极生物相容性好,识别性能高,在牛血清白蛋白分析检测中具
有良好的应用前景。


实施例2.


a)将?#26790;?#27700;乙醇清?#26149;?#30340;丝网印刷技术制备的裸碳电极浸泡到质量百分比为2%
的3-氨基丙基三乙氧基硅烷水溶液中24小时,在裸碳电极表面引入氨基;


b)配制卵清蛋白质量百分比浓度为5%,海藻酸钠质量百分比浓度为5%,羧化多
壁碳纳米管质量百分比浓度为10%的混合物水溶?#28023;?#38745;置消泡放置于无菌容器中备用;


c)配制氯化钙质量百分比浓度为10%的氯化钙水溶?#28023;?br>

d)将步骤b)得到的混合物水溶?#28023;?#22343;匀地涂覆在步骤a)得到的表面引入氨基的裸
碳电极上,利用氨基与海藻酸钠上的羧基之间的相互作用使海藻酸钠分子结合在裸碳电极
表面;通过调节海藻酸钠的质量百分比浓度调节溶液粘度,从而控制混合物水溶液的涂覆
厚度为200微米;立即将涂覆步骤b)得到的混合物水溶液的裸碳电极浸泡到步骤c)得到的
氯化钙水溶液24小时,得?#33014;?#21365;清蛋白的水凝胶修饰电极;由于丝网印刷技术可以制备直
径为10毫米的球形裸碳电极,步骤b)得到的混合物水溶液能结合到?#26412;?#20026;10毫米的球形裸
碳电极上,?#28082;?#24230;可控,可以用100毫升的混合物水溶液制备大小水凝胶修饰电极;


e)将步骤d)得到的含卵清蛋白的水凝胶修饰电极用Tris-HCl缓冲溶?#21512;?#33073;掉卵
清蛋白,得到可识别卵清蛋白的分子印迹水凝胶修饰电极;以分子印迹水凝胶修饰电极作
为工作电极,银电极作为参比电极,铂片作为辅助电极,采用循环伏安法测试卵清蛋白的吸
附及选择性识别性能;由于分子印迹水凝胶修饰电极上的分子印迹水凝胶可做?#33014;?#34180;,因
此卵清蛋白洗脱和吸附较快,检测时间短,灵敏度高;


f)由于在制备过程中没有引入有毒有害试剂,没有聚合反应热引起卵清蛋白构象
的变化,洗脱卵清蛋白的过程也比较温和,因此步骤e)得到的可识别卵清蛋白的分子印迹
水凝胶修饰电极生物相容性好,识别性能高,在卵清蛋白分析检测中具有良好的应用前景。


实施例3.


a)将?#26790;?#27700;乙醇清?#26149;?#30340;丝网印刷技术制备的裸碳电极浸泡到质量百分比为1%
的3-氨基丙基三乙氧基硅烷水溶液中12小时,在裸碳电极表面引入氨基;


b)配制溶菌酶质量百分比浓度为2.5%,海藻酸钠质量百分比浓度为2.5%,羧甲
基壳聚糖质量百分比浓度为2%的混合物水溶?#28023;?#38745;置消泡放置于无菌容器中备用;


c)配制氯化钙质量百分比浓度为5%的氯化钙水溶?#28023;?br>

d)将步骤b)得到的混合物水溶?#28023;?#22343;匀地涂覆在步骤a)得到的表面引入氨基的裸
碳电极上,利用氨基与海藻酸钠上的羧基之间的相互作用使海藻酸钠分子结合在裸碳电极
表面;通过调节海藻酸钠的质量百分比浓度调节溶液粘度,从而控制混合物水溶液的涂覆
厚度为100微米;立即将涂覆步骤b)得到的混合物水溶液的裸碳电极浸泡到步骤c)得到的
氯化钙水溶液5小时,得?#33014;?#28342;菌酶的水凝胶修饰电极;由于丝网印刷技术可以制备?#26412;?#20026;
5毫米的球形裸碳电极,步骤b)得到的混合物水溶液能结合到?#26412;?#20026;5毫米的球形裸碳电
极,?#28082;?#24230;可控,可以用50毫升的混合物水溶液制备大小水凝胶修饰电极;


e)将步骤d)得到的含溶菌酶的水凝胶修饰电极用醋酸缓冲溶?#21512;?#33073;掉溶菌酶,得
到可识别溶菌酶的分子印迹水凝胶修饰电极;以分子印迹水凝胶修饰电极作为工作电极,
银电极作为参比电极,铂片作为辅助电极,采用循环伏安法测试溶菌酶的吸附及选择性识
别性能;由于分子印迹水凝胶修饰电极上的分子印迹水凝胶可做?#33014;?#34180;,因此溶菌酶洗脱
和吸附较快,检测时间短,灵敏度高;


f)由于在制备过程中没有引入有毒有害试剂,没有聚合反应热引起溶菌酶构象的
变化,洗脱溶菌酶的过程也比较温和,因此步骤e)得到的可识别溶菌酶的分子印迹水凝胶
修饰电极生物相容性好,识别性能高,在溶菌酶分析检测中具有良好的应用前景。


实施例4.


a)将?#26790;?#27700;乙醇清?#26149;?#30340;丝网印刷技术制备的裸碳电极浸泡到质量百分比为
0.5%的3-氨基丙基三乙氧基硅烷水溶液中8小时,在裸碳电极表面引入氨基;


b)配制粘连蛋白质量百分比浓度为0.01%,海藻酸钠质量百分比浓度为1%,羧化
二氧化钛质量百分比浓度为5%的混合物水溶?#28023;?#38745;置消泡放置于无菌容器中备用;


c)配制氯化钙质量百分比浓度为2.5%的氯化钙水溶?#28023;?br>

d)将步骤b)得到的混合物水溶?#28023;?#22343;匀地涂覆在步骤a)得到的表面引入氨基的裸
碳电极上,利用氨基与海藻酸钠上的羧基之间的相互作用使海藻酸钠分子结合在裸碳电极
表面;通过调节海藻酸钠的质量百分比浓度调节溶液粘度,从而控制混合物水溶液的涂覆
厚度为50微米;立即将涂覆步骤b)得到的混合物水溶液的裸碳电极浸泡到步骤c)得到的氯
化钙水溶液6小时,得?#33014;?#31896;连蛋白的水凝胶修饰电极;由于丝网印刷技术可以制备?#26412;?#20026;
5毫米的圆形裸碳电极,步骤b)得到的混合物水溶液能结合到?#26412;?#20026;5毫米的圆形裸碳电极
上,?#28082;?#24230;可控,可以用0.01毫升的混合物水溶液制备大小的水凝胶修饰电极,对于特别昂
贵的粘连蛋白具有价格优势;


e)将步骤d)得到的含粘连蛋白的水凝胶修饰电极用硼酸盐缓冲溶?#21512;?#33073;掉粘连
蛋白,得到可识别粘连蛋白的分子印迹水凝胶修饰电极;以分子印迹水凝胶修饰电极作为
工作电极,银电极作为参比电极,铂片作为辅助电极,采用循环伏安法测试粘连蛋白的吸附
及选择性识别性能;由于分子印迹水凝胶修饰电极上的分子印迹水凝胶可做?#33014;?#34180;,因此
粘连蛋白洗脱和吸附较快,检测时间短,灵敏度高;


f)由于在制备过程中没有引入有毒有害试剂,没有聚合反应热引起粘连蛋白构象
的变化,洗脱粘连蛋白的过程也比较温和,因此步骤e)得到的可识别粘连蛋白的分子印迹
水凝胶修饰电极生物相容性好,识别性能高,在粘连蛋白分析检测中具有良好的应用前景。


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