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一种肝硬化检测试剂及其在肝硬化检测中的应用.pdf

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一种 肝硬化 检测 试剂 及其 中的 应用
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摘要
申请专利号:

CN201910038780

申请日:

20190116

公开号:

CN109490548A

公开日:

20190319

当前法律状态:

实质审查的生效

有效性:

审中

法?#19978;?#24773;: 实质审查的生效
IPC分类号: G01N33/66 主分类号: G01N33/66
申请人: 江苏?#20154;?#36798;生物科技有限公司
发明人: 陈萃英;谈宗男;朱宏章;张方红;刘学恩;庄辉
地址: 225312 江苏省泰州市中国医药城口泰路东侧、新阳路北侧G26幢六层东侧
优先权:
专利代理机构: 32350 代理人: 王真
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法律状态
申请(专利)号:

CN201910038780

授权公告号:

法律状态公告日:

20190412

法律状态类型:

实质审查的生效

摘要

本发明提供了一种肝硬化检测试剂,包括C1:不高于2.0%SDS,pH为7.5?8.0;C2:混合同体积的20mMAPTS和1MNaCNBH3;C3?#21495;?#24230;2~5U/μL的糖苷酶与3~4%的NP?40按体积比1:20混合配制;C4:100mMNH4AC、1~2mU/μL唾液酸酶和双氧水按照体积5:1:14混合;C5:缓冲液。本发明?#22266;?#20379;了一种组合物在肝硬化检测试剂中的应用,所述组合物由NGA2F、NA2、NA3组成,所述组合物通过NGA2F/(NA2+NA3)的比值来检测肝硬化。本发明采用具有灵敏度高、操作简单、重复性好、稳定性好以及高通量的N?寡糖链检测方法,准确度达到84.7%,与现有技术相比,具有更高的准确度。

权利要求书

1.一种肝硬化检测试剂,其特征在于:包括C1:不高于2.0% SDS,pH为7.5-8.0;C2:混合同体积的20mM的APTS和1M的NaCNBH3;C3?#21495;?#24230;2~5U/μL的糖苷酶与3~4%的NP-40按体积比1:20混合配制;C4:100mM的NH4AC、1~2mU/μL唾液酸酶和双氧水按照体积5:1:14混合;C5:缓冲液。 2.根据权利要求1所述的肝硬化检测试剂,其特征在于:所述C1的体积为2μL,C2的体积为2μL,C3体积为2μL,C4体积为2μL,C5体积为200μL。 3.一种组合物在肝硬化检测试剂中的应用,所述组合物由NGA2F、NA2和NA3组成,所述组合物通过NGA2F /(NA2+NA3)的比值来检测肝硬化。

说明书


一种肝硬化检测试剂及其在肝硬化检测中的应用
技术领域


本发明属于生物医药技术领域,具体涉及一种肝硬化检测试剂及其在肝硬化检测
中的应用。


背景技术


肝硬化(cirrhosis)是临床常见的慢性进行性肝病,是由于一种或者多种病因长
期或者反复作用而形成的弥漫性肝损害。目前认为引起肝硬化前三位最主要的原因是酒
精、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)和丙型肝炎病毒感染(hepatitis C virus,
HCV)。全球范围内,57%的肝硬化是由HBV(30%)和HCV(27%)引起的,在发展中国家,肝硬化主
要是由HBV引起的。


肝硬化临床诊断过程中需要考虑包括临床表现、实验室检查、组织学、影像学以及
组织病理学诸多依据。肝组织活检可提供肝?#23435;?#21270;分期的重要信息,但肝组织活检存在一
定风险,?#19994;?#20010;肝组织活检标本不一定能全面反映肝脏整体的?#23435;?#21270;程度,因而,近年来发
展了多项非创诊断技术用于评估肝?#23435;?#21270;,包括测定肝脏硬度的影像学技术、血清学标志
和各类评分系统等。血清生化直接指标主要包括透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、III型前
胶原肽和IV型胶原等,间接指标主要包括血小板计数(PLT)、r-球蛋白、凝血酶原时间(PT)、
谷丙转氨酶、胆红素和载体蛋白A1等,但是上述指标诊断或者检测肝硬化均缺乏特异性。各
种常用的影像学手?#31283;鏐型超声、CT、磁共振?#19978;?MRI)等可以发现肝包膜增厚、肝表面轮廓
不规则、肝实质的回声不均匀增强以及CT值增高或呈结节状、各叶比例改变、脾脏厚度增加
及门静脉和脾静脉?#26412;?#22686;宽等肝硬化和门脉高压的征象。彩色多普?#31896;?#22768;检查或放射性核
素扫描可以测定肝脏动脉和门脉的血流量及功能性门体分流情况。


尽管不少研究发现肝脏超声半定量打分与肝组织分级具有良好的相关性,但是对
早期肝硬化不够敏感,对于肝?#23435;?#21270;的诊断难以定量化。肝脏弹力测定主要包括瞬时弹性
波扫描(Fibroscanh或Fibrotouch)。此类技术的优点是能够测定更大的范围甚至整个肝脏
的弹性情况,在一定程度上弥补了肝活组织检查存在的取样误差;其缺点是肝脏脂肪沉积、
腹水、腹腔炎等情况会一定程度影响检测结果。此类技术尚不能区分相邻的肝?#23435;?#20998;期,但
对于诊断代偿性肝硬化有一定的临床指?#23478;?#20041;。目前市场上无专用于检测肝硬化的试剂
盒,临床上大多使用检测肝功能的一些指标以及结合影像学进行诊断。


发明内容


糖蛋白聚糖的成分是通过上百种酶、转?#23478;?#23376;、离子通道和蛋白之间复杂的相互
作用而形成的,聚糖参与多种分子过程,如蛋白折叠、细胞粘附、分子转移、信号转导、调节
受体活性等;因?#21496;?#31958;的改变与疾病紧密相关。


经过长期的研究发现,肝硬化患者的血清与正常人的相比而言,N-寡聚糖NGA2F(a
galactosylated, core-a-1,6-fucosylated biantennary glycan),NA2(a
bigalactosylated, core – a -1 , 6 -fucosylated biantennary)和NA3(a
trigalactosylated, tri-antennary)的含量有明显的变化,从而可用于检测肝硬化的标
志物。


针对现有的肝硬化的检测中所存在的问题,如血液检查和影像学检测特异性和准
确度不高,病理检查有创伤性,抽样有误差性,患者?#26469;?#24615;差等;本发明提供一种应用在肝
硬化检测中的肝硬化检测试剂。


本发明采用的技术方案如下:


本发明的一种肝硬化检测试剂,包括C1:不高于2.0% SDS,pH为7.5-8.0;C2:混合同体
积的20mM的 APTS和1M的NaCNBH3;C3?#21495;?#24230;2~5U/μL的糖苷酶与3~4%的NP-40按体积比1:20
混合配制;C4:100mM的NH4AC、1~2mU/μL唾液酸酶和双氧水按照体积5:1:14混合;C5:缓冲
液。


所述C1的体积为2μL,C2的体积为2μL,C3体积为2μL,C4体积为2μL,C5体积为200μ
L。


试剂制备:


C1?#21495;?#21046;成含有不高于2% SDS、pH为7.5~8.0的溶液。


C2:混合同体积的20mM的APTS和1M的NaCNBH
3。


C3?#21495;?#24230;2~5U/μL的糖苷酶与3~4%的NP-40按体积比1:20混合配制。


C4:100mM的NH
4AC、唾液酸酶(neuraminidase,1~2mU/μL)以及双氧水按照体积5:
1:14混合。


C5:缓冲液。


本发明?#22266;?#20379;一种组合物在肝硬化检测试剂中的应用,所述组合物由NGA2F、NA2
和NA3组成,所述组合物通过NGA2F /(NA2+NA3)的比值来检测肝硬化。


N-糖组图谱检测:


①寡糖链的制备以及标记:取在90~95℃下灭活的血清2μL,加入2μL 的C1,混?#30830;?#32622;
5min,加入2μL 的C2进行标记,37℃反应3h后进行干燥。


②寡糖链的标记后处理:在干燥后的样品中加入2μL的C3,不低于65℃?#36335;?#24212;3h
后,加入200μL的C5终止反应。


③后续处理:取上述的样品2μL,加入2μL的C4,45℃?#36335;?#24212;3h,最后再加入200μL的
C5终止反应。


④寡糖链分离分析:取③的液体样品10μL,在ABI3500dx仪器下进行N-寡糖链分
离,从而得到N-糖组图谱。


⑤数据处理分析:将所得到的N-糖组图谱进行峰值量化,通过函数NGA2F/(NA2+
NA3)进行进一步的统计学分析,来检测肝硬化。


本发明的有益效果:


(1)本发明采用具有灵敏度高、操作简单、重复性好、稳定性好以及高通量的N-寡糖链
检测方法,根据建立的受试者血清的N-寡糖链图谱,得到受试者血清中的聚糖NGA2F,NA2,
NA3峰值,通过函数NGA2F /(NA2+NA3)对959例样本(其中肝硬化样本480例,非肝硬化样本
479例)进行检测。结果显示,本检测方法准确度达到84.7%,与现有技术相比,具有更高的准
确度。


(2)采用本检测方法,能够?#24357;?#22810;肝硬化患者接受常规、无创检测,从而帮助医生
以及患者及时检测肝硬化的发生和病情的进展,有望在临床中推广使用。


附图说明


图1为肝硬化血清样本的N-寡糖链图谱;


图2为健康对照组血清样本的N-寡糖链图谱;


图3为检测样本通过NGA2F/(NA2+NA3)所作出的ROC特征曲线;检测样本总数为959例,
其中肝硬化样本480例,健康对照组样本479例;曲线下面积AUC=0.847。


具体实施方式


下面结合具体实施例对本试剂盒进一步详述。需要说明的是,下列实施例仅用于
说明而不用于限制本发明的范围。以下实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常
规条件试验,或按照制造厂商建议的条件,试剂都为细胞培养专用。


实施例一:


(1)实验设备:


ABI3500dx 分析仪(Applied Biosystems),PCR,离心机


(2)试剂制备:


C1?#21495;?#21046;成含有不高于2% SDS、pH为7.5~8.0的溶液。


C2:混合同体积的20mM的APTS和1M的NaCNBH
3。


C3?#21495;?#24230;2~5U/μL的糖苷酶与3~4%的NP-40按体积比1:20混合配制。


C4:100mM的NH
4AC、唾液酸酶(neuraminidase,1~2mU/μL)以及双氧水


按照体积5:1:14混合。


C5:缓冲液。


(3)N-糖组图谱检测


①寡糖链的制备以及标记:取在90~95℃下灭活的血清2μL,加入2μL 的C1,混?#30830;?#32622;
5min,加入2μL 的C2进行标记,37℃反应3h后进行干燥。


②寡糖链的标记后处理:在干燥后的样品中加入2μL的C3,不低于65℃?#36335;?#24212;3h
后,加入200μL的C5终止反应。


③后续处理:取上述的样品2μL,加入2μL的C4,45℃?#36335;?#24212;3h,最后再加入200μL的
C5终止反应。


④寡糖链分离分析:取③的液体样品10μL,在ABI3500dx仪器下进行N-寡糖链分
离,从而得到N-糖组图谱。


检测样本通过NGA2F/(NA2+NA3)所作出的ROC特征曲线;检测样本总数为959例,其
中肝硬化样本480例,健康对照组样本479例;曲线下面积AUC=0.847。


结果显示,本检测方法准确度达到84.7%,与现有技术相比,具有更高的准确度。采
用本发明检测方法,能够?#24357;?#22810;肝硬化患者接受常规、无创检测,从而帮助医生以及患者及
时检测肝硬化的发生和病情的进展,有望在临床中推广使用。


以上结合附图所述的具体实施例,对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了
进一步详细说明,所应理解的是,以上所述仅为本发明的具体实施例而已,但并非对本发明
保护范围的限制,所属领域技术人员应该明白,凡在本发明的精神和原则之内,不需要付出
创造性劳动即可做出的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。


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