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一种免疫抗体及其制备方法.pdf

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一种 免疫 抗体 及其 制备 方法
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摘要
申请专利号:

CN201910036677

申请日:

20190115

公开号:

CN109627332A

公开日:

20190416

当前法律状态:

公开

有效性:

审中

法?#19978;?#24773;: 公开
IPC分类号: C07K16/12;C07K16/06 主分类号: C07K16/12;C07K16/06
申请人: 深圳康体生命细胞技术有限公司
发明人: 吴勇刚
地址: 518000 广东省深圳市龙岗区南湾街道南新路13号C栋206室
优先权:
专利代理机构: 代理人:
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法律状态
申请(专利)号:

CN201910036677

授权公告号:

法律状态公告日:

20190416

法律状态类型:

公开

摘要

本发明涉及免疫抗体技术领域,且公开了一种免疫抗体及其制备方法,通过从兔子体内抽取样本血液进行多次免疫所产生的抗体,具体?#34903;瑁翰街?#19968;:动物的选择,?#34903;?#20108;:抗原的选择,?#34903;?#19977;:佐剂和抗原乳剂的制备,?#34903;?#22235;:免疫,?#34903;?#20116;:抗血清的制备。该免疫抗体及其制备方法,通过对兔子进行三个阶段的免疫,能够制备出高纯度的免疫抗体,特异性强、效价高和亲和力强,通过规范的从兔子的体内取样品血,使得取出的免疫抗体不受到细菌污染,提高了免疫抗体的纯度。

权利要求书

1.一种免疫抗体及其制备方法,其特征在于?#21644;?#36807;从兔子体内抽取样本血液进行多次免疫所产生的抗体。 2.一种免疫抗体的制备方法,具体?#34903;?#22914;下: ?#34903;?#19968;:动物的选择,选择2-3个月以上的兔子,免疫作好标号,然后再进行分笼饲养; ?#34903;?#20108;:抗原的选择,将抗原(?#23435;?#32032;酶)稀释为4mg/ml,?#32431;?#19982;佐剂混合制成乳剂用于兔子免疫; ?#34903;?#19977;:佐剂和抗原乳剂的制备,佐剂完全福氏佐剂:轻矿物油(石腊油)8.5ml,羊毛脂1.5ul,灭活结核?#21496;?0mg,抗原乳剂制备; (1)油剂:矿物油和羊毛脂按比例混合,高压8磅20?#31181;用?#33740;后作为油剂,使用前微火融化; (2)水剂?#22909;?#27963;结核?#21496;?mg/ul+抗原4mg/ml; (3)油剂和水剂1:1混合; ?#34903;?#22235;:免疫,再兔子的耳动脉皮下多点注射,?#24247;?.1m1,第一次免疫:实验组在兔子体内加佐剂的抗原, A组5只(头部有黄色)?#22909;?#21482;兔子耳动脉皮下多点注射,共计注射0.4ml磷酸缓冲液; B组5只(尾部有黄色)?#22909;?#21482;兔子耳动脉皮下多点注射,共计注射0.4ml2mg/ml?#23435;?#32032;南液; C组8只(中部有黄色)?#22909;?#21482;兔子耳动脉皮下多点注射,共计注射0.4ml加佐剂的抗原乳剂; 第二次免疫:第3周实验组兔子不加佐剂抗原, A组5只(头部有黄色)?#22909;?#21482;兔子耳动脉皮下多点注射,共计注射0.4ml磷酸缓冲液; B组5只(尾部有黄色)?#22909;?#21482;兔子耳动脉皮下多点注射,共计注射0.4ml2mg/ml?#23435;?#32032;?#23478;海?C组8只(中部有黄色)?#22909;?#21482;兔子耳动脉皮下多点注射,共计注射0.4ml2mg/ml?#23435;?#32032;酶液; 第三次免疫:第二次免疫后1周,实验组兔子不加佐剂抗原, A组5只(头部有黄色)?#22909;?#21482;兔子耳动脉皮下多点注射,共计注射0.4ml磷酸缓冲液; B组5只(尾部有黄色)?#22909;?#21482;兔子耳动脉皮下多点注射,共计注射0.4ml2mg/ml?#23435;?#32032;酶液; C组8只(中部有黄色)?#22909;?#21482;兔子耳动脉皮下多点注射,共计注射0.4ml2mg/ml?#23435;?#32032;?#23478;海??#34903;?#20116;:抗血清的制备,第三次免疫,一周后,从兔子的耳动脉皮下或心脏取样品血,收集的血液置于室温下1h左右,凝固后,置4℃下,过夜(切勿冰冻)析出血清,离心,4000rpa,10min,在无菌条件,吸出血清,然后用带有相同表位的抗原(带有表位2)进行?#20174;Γ?#20197;除去非特异性抗体,获得针对(表位2)的特异性免疫抗。 3.根据权利要求2所述的一种免疫抗体的制备方法,其特征在于:所述油剂和水剂的混合方式为?#24515;?#25110;者注射器混?#31232;?4.根据权利要求2所述的一种免疫抗体的制备方法,其特征在于:所述?#34903;?#20116;中吸出的血清进行分装(0.05~0.2ul),贮于-40℃以下冰箱,或冻干后贮存于4℃冰箱保存。 5.根据权利要求2所述的一种免疫抗体及其制备方法,其特征在于:所述灭活结核?#21496;?#21644;抗原均为终浓度。 6.根据权利要求2所述的一种免疫抗体及其制备方法,其特征在于:所述取样品血的?#34903;?#20026;:将兔子的耳朵露于箱笼外,也可由另一人?#38454;?#20813;身,剪去耳缘的毛,用少许二甲苯涂抹耳廓,30s后,耳血管扩张、充血,用手轻拉耳尖,以单面剃须刀或尖的手术刀片,快速切开耳朵动脉,血液即流出,每次可收集30~40ml,然后用棉球压迫止血,凝血后洗去二甲苯,二星期后,可在另一耳朵放血,此法可反复多次放血,放血过程中要?#32454;癜次?#33740;要求进行。

说明书


一种免疫抗体及其制备方法
技术领域


本发明涉及免疫抗体技术领域,具体为一种免疫抗体及其制备方法。


背景技术


血型抗体一般分为二类:天然抗体和免疫抗体,一般天然抗体是IgM,免疫抗体是
IgG。①IgM类抗体在盐水介质中能够凝集具有相应抗原的红细胞,这类抗体主要是ABO以及
P、MN、Lewis抗体,常为天然抗体。能激活补体,发生血管内溶血。此类抗体不能透过胎盘,且
其最佳?#20174;?#28201;度为4℃所以?#32440;?#20919;抗体。②IgG类抗体多数情况下在盐水介质中与具有相应
抗原的红细胞不发生凝集,只有在胶体介?#30465;?#37238;或抗球蛋?#20303;?#20957;聚?#26041;?#36136;中才发生凝集,这
类抗体主要是Rh、Kidd、Duffy等血型抗体。通常情况通过免疫(输血、妊娠、器官移植)产生
抗体,又称免疫抗体。多发生血管外溶血。此类抗体最佳?#20174;?#28201;度37℃所以?#32440;?#28201;抗体。


目前的免疫抗体在制备的过程中,对动物的免疫阶段层次不够理想,而且在对动
物取样品血时不够规范,容?#36164;?#24471;得到的免疫抗体不纯和被污染,特异性低、效价低和亲和
力低。为此,本发明提出了一种免疫抗体及其制备方法。


发明内容


(一)解决的技术问题


针对现有技术的不足,本发明提供了一种免疫抗体及其制备方法,具备通过对兔
子进行三个阶段的免疫,能够制备出高纯度的免疫抗体,通过规范的从兔子的体内取样品
血,使得取出的免疫抗体不受到细菌污染,提高了免疫抗体的纯度等优点,解决了免疫抗体
在制备的过程中,对动物的免疫阶段层次不够理想,而且在对动物取样品血时不够规范,容
?#36164;?#24471;得到的免疫抗体不纯和被污染,特异性低、效价低和亲和力低的问题。


(二)技术方案


为实现上述的?#24247;模?#26412;发明提供如下技术方?#31119;?#19968;种免疫抗体,通过从兔子体内抽
取样本血液进行多次免疫所产生的抗体。


一种免疫抗体的制备方法,具体?#34903;?#22914;下:


?#34903;?#19968;:动物的选择,选择2-3个月以上的兔子,免疫作好标号,然后再进行分笼饲
养;


?#34903;?#20108;:抗原的选择,将抗原(?#23435;?#32032;酶)稀释为4mg/ml,?#32431;?#19982;佐剂混合制成乳剂
用于兔子免疫;


?#34903;?#19977;:佐剂和抗原乳剂的制备,佐剂完全福氏佐剂:轻矿物油(石腊油)8.5ml,羊
毛脂1.5ul,灭活结核?#21496;?0mg,抗原乳剂制备;


(1)油剂:矿物油和羊毛脂按比例混合,高压8磅20?#31181;用?#33740;后作为油剂,使用前微
火融化;


(2)水剂?#22909;?#27963;结核?#21496;?mg/ul+抗原4mg/ml;


(3)油剂和水剂1:1混合;


?#34903;?#22235;:免疫,再兔子的耳动脉皮下多点注射,?#24247;?.1m1,第一次免疫:实验组在
兔子体内加佐剂的抗原,


A组5只(头部有黄色)?#22909;?#21482;兔子耳动脉皮下多点注射,共计注射0.4ml磷酸缓冲
液;


B组5只(尾部有黄色)?#22909;?#21482;兔子耳动脉皮下多点注射,共计注射0.4ml2mg/ml?#23435;?br>素南液;


C组8只(中部有黄色)?#22909;?#21482;兔子耳动脉皮下多点注射,共计注射0.4ml加佐剂的抗
原乳剂;


第二次免疫:第3周实验组兔子不加佐剂抗原,


A组5只(头部有黄色)?#22909;?#21482;兔子耳动脉皮下多点注射,共计注射0.4ml磷酸缓冲
液;


B组5只(尾部有黄色)?#22909;?#21482;兔子耳动脉皮下多点注射,共计注射0.4ml2mg/ml?#23435;?br>素?#23478;海?br>

C组8只(中部有黄色)?#22909;?#21482;兔子耳动脉皮下多点注射,共计注射0.4ml2mg/ml?#23435;?br>素酶液;


第三次免疫:第二次免疫后1周,实验组兔子不加佐剂抗原,


A组5只(头部有黄色)?#22909;?#21482;兔子耳动脉皮下多点注射,共计注射0.4ml磷酸缓冲
液;


B组5只(尾部有黄色)?#22909;?#21482;兔子耳动脉皮下多点注射,共计注射0.4ml2mg/ml?#23435;?br>素酶液;


C组8只(中部有黄色)?#22909;?#21482;兔子耳动脉皮下多点注射,共计注射0.4ml2mg/ml?#23435;?br>素?#23478;海?br>

?#34903;?#20116;:抗血清的制备,第三次免疫,一周后,从兔子的耳动脉皮下或心脏取样品
血,收集的血液置于室温下1h左右,凝固后,置4℃下,过夜(切勿冰冻)析出血清,离心,
4000rpa,10min,在无菌条件,吸出血清,然后用带有相同表位的抗原(带有表位2)进行反
应,以除去非特异性抗体,获得针对(表位2)的特异性免疫抗。


优选的,所述油剂和水剂的混合方式为?#24515;?#25110;者注射器混?#31232;?br>

优选的,所述?#34903;?#20116;中吸出的血清进行分装(0.05~0.2ul),贮于-40℃以下冰箱,
或冻干后贮存于4℃冰箱保存。


优选的,所述灭活结核?#21496;?#21644;抗原均为终浓度。


优选的,所述取样品血的?#34903;?#20026;:将兔子的耳朵露于箱笼外,也可由另一人?#38454;?#20813;
身,剪去耳缘的毛,用少许二甲苯涂抹耳廓,30s后,耳血管扩张、充血,用手轻拉耳尖,以单
面剃须刀或尖的手术刀片,快速切开耳朵动脉,血液即流出,每次可收集30~40ml,然后用
棉球压迫止血,凝血后洗去二甲苯,二星期后,可在另一耳朵放血,此法可反复多次放血,放
血过程中要?#32454;癜次?#33740;要求进行。


(三)有益效果


与现有技术相比,本发明提供了一种免疫抗体及其制备方法,具备以下有益效果:


1、该免疫抗体及其制备方法,通过对兔子进行三个阶段的免疫,能够制备出高纯
度的免疫抗体,特异性强、效价高和亲和力强,通过规范的从兔子的体内取样品血,使得取
出的免疫抗体不受到细菌污染,提高了免疫抗体的纯度。


具体实施方式


本发明公开了一种免疫抗体及其制备方法,本领域技术人员可以借鉴本文内容,
?#23454;备?#36827;工艺参数实现。需要特别指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来
说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的制备方法已经通过较佳实施例进
行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和?#27573;?#20869;对本文所述的制备方法进
行改动或?#23454;?#21464;更与组合,来实现和应用本发明技术。基于本发明中的实施例,本领域普通
技术人员在没有做出创造性劳动前提?#28388;?#33719;得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范
围。下面结合实施例,进一步阐述本发明。


一种免疫抗体,通过从兔子体内抽取样本血液进行多次免疫所产生的抗体。


一种免疫抗体的制备方法,具体?#34903;?#22914;下:


?#34903;?#19968;:动物的选择,选择2-3个月以上的兔子,免疫作好标号,然后再进行分笼饲
养;


?#34903;?#20108;:抗原的选择,将抗原(?#23435;?#32032;酶)稀释为4mg/ml,?#32431;?#19982;佐剂混合制成乳剂
用于兔子免疫;


?#34903;?#19977;:佐剂和抗原乳剂的制备,佐剂完全福氏佐剂:轻矿物油(石腊油)8.5ml,羊
毛脂1.5ul,灭活结核?#21496;?0mg,抗原乳剂制备;


(1)油剂:矿物油和羊毛脂按比例混合,高压8磅20?#31181;用?#33740;后作为油剂,使用前微
火融化;


(2)水剂?#22909;?#27963;结核?#21496;?mg/ul+抗原4mg/ml;


(3)油剂和水剂1:1混合;


?#34903;?#22235;:免疫,再兔子的耳动脉皮下多点注射,?#24247;?.1m1,第一次免疫:实验组在
兔子体内加佐剂的抗原,


A组5只(头部有黄色)?#22909;?#21482;兔子耳动脉皮下多点注射,共计注射0.4ml磷酸缓冲
液;


B组5只(尾部有黄色)?#22909;?#21482;兔子耳动脉皮下多点注射,共计注射0.4ml2mg/ml?#23435;?br>素南液;


C组8只(中部有黄色)?#22909;?#21482;兔子耳动脉皮下多点注射,共计注射0.4ml加佐剂的抗
原乳剂;


第二次免疫:第3周实验组兔子不加佐剂抗原,


A组5只(头部有黄色)?#22909;?#21482;兔子耳动脉皮下多点注射,共计注射0.4ml磷酸缓冲
液;


B组5只(尾部有黄色)?#22909;?#21482;兔子耳动脉皮下多点注射,共计注射0.4ml2mg/ml?#23435;?br>素?#23478;海?br>

C组8只(中部有黄色)?#22909;?#21482;兔子耳动脉皮下多点注射,共计注射0.4ml2mg/ml?#23435;?br>素酶液;


第三次免疫:第二次免疫后1周,实验组兔子不加佐剂抗原,


A组5只(头部有黄色)?#22909;?#21482;兔子耳动脉皮下多点注射,共计注射0.4ml磷酸缓冲
液;


B组5只(尾部有黄色)?#22909;?#21482;兔子耳动脉皮下多点注射,共计注射0.4ml2mg/ml?#23435;?br>素酶液;


C组8只(中部有黄色)?#22909;?#21482;兔子耳动脉皮下多点注射,共计注射0.4ml2mg/ml?#23435;?br>素?#23478;海?br>

?#34903;?#20116;:抗血清的制备,第三次免疫,一周后,从兔子的耳动脉皮下或心脏取样品
血,收集的血液置于室温下1h左右,凝固后,置4℃下,过夜(切勿冰冻)析出血清,离心,
4000rpa,10min,在无菌条件,吸出血清,然后用带有相同表位的抗原(带有表位2)进行反
应,以除去非特异性抗体,获得针对(表位2)的特异性免疫抗。


油剂和水剂的混合方式为?#24515;?#25110;者注射器混?#31232;?br>

?#34903;?#20116;中吸出的血清进行分装(0.05~0.2ul),贮于-40℃以下冰箱,或冻干后贮
存于4℃冰箱保存。


灭活结核?#21496;?#21644;抗原均为终浓度。


取样品血的?#34903;?#20026;:将兔子的耳朵露于箱笼外,也可由另一人?#38454;?#20813;身,剪去耳缘
的毛,用少许二甲苯涂抹耳廓,30s后,耳血管扩张、充血,用手轻拉耳尖,以单面剃须刀或尖
的手术刀片,快速切开耳朵动脉,血液即流出,每次可收集30~40ml,然后用棉球压迫止血,
凝血后洗去二甲苯,二星期后,可在另一耳朵放血,此法可反复多次放血,放血过程中要严
格?#27425;?#33740;要求进行。


综上所述,该免疫抗体的制备方法,通过对兔子进行三个阶段的免疫,能够制备出
高纯度的免疫抗体,特异性强、效价高和亲和力强,通过规范的从兔子的体内取样品血,使
得取出的免疫抗体不受到细菌污染,提高了免疫抗体的纯度。


需要说明的是,术语“包括”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含,从而
使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括?#20999;?#35201;素,而?#19968;?#21253;括没有明确
列出的其他要素,或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更
多限制的情况下,由语句“包括一个……”限定的要素,并不排除在包括所述要素的过程、方
法、物品或者设备中还存在另外?#21335;?#21516;要素。


尽管已经示出和描述了本发明的实施例,对于本领域的普通技术人员而言,可以
理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换
和变型,本发明的?#27573;?#30001;所附权利要求及其等同物限定。


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