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一种鸭2型甲肝病毒检测试剂盒及其检测方法.pdf

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一种 甲肝 病毒 检测 试剂盒 及其 方法
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摘要
申请专利号:

CN201910028897

申请日:

20190112

公开号:

CN109576398A

公开日:

20190405

当前法律状态:

公开

有效性:

审中

法?#19978;?#24773;: 公开
IPC分类号: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11 主分类号: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
申请人: 福建省农业科学?#30418;?#29287;兽医研究所
发明人: 万春和;黄瑜;陈翠腾;施少华;傅光华;程龙飞;刘荣昌;陈红梅;傅秋玲
地址: 350013 福建省福州市晋安区新店?#19994;?/td>
优先权:
专利代理机构: 35100 代理人: 蔡学俊
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法律状态
申请(专利)号:

CN201910028897

授权公告号:

法律状态公告日:

20190405

法律状态类型:

公开

摘要

本发明提供一种鸭2型甲肝病毒检测试剂盒及其检测方法,所述试剂盒包含了鸭2型甲肝病毒的引物对,序列如SEQIDNO.1?2所示。本发明采用的特异性引物选择DHAV?2与DHAV?1、DHAV?3氨基酸同源性最低的2A2蛋白区域设计,采用的引物可以准确快速的判别病料中是否含有鸭2型甲肝病毒。当前国内外尚未见利用特异性检测检测鸭2型甲肝病毒的检测试剂盒及其检测方法相关研究报道,本发明的建立可填补国内外相关领域空白。

权利要求书

1.一种用于检测鸭2型甲肝病毒的引物对,其特征在于:所述引物如下所示: DHAV-2F:5’-TACATCTATGGGTGGTATTCTT-3’; DHAV-2R:5’-TTCAATTTCAAGATGGAGCTCA-3’。 2.一种鸭2型甲肝病毒检测试剂盒,其特征在于:其包含权利要求1所述的引物对。

说明书


一种鸭2型甲肝病毒检测试剂盒及其检测方法
技术领域


本发明提供一种鸭2型甲肝病毒检测试剂盒及其检测方法,属于动物传染病学领
域。


背景技术


当前,引起雏鸭病毒性肝炎的病原为鸭甲肝病毒(duck hepatitis A virus,
DHAV),属小RNA病毒科(Picornaviridae)禽肝病毒属(Avihepatovirus)成员,分为三种基
因型:DHAV-1,DHAV-2和DHAV-3。DHAV病毒完整基因组长约7.7kb,单股正链RNA。基因组RNA
由5’非编码区(untranslated region, UTR)、一个开放阅读框(ORF)、3’UTR 和 poly(A)尾
巴组成,它作为遗传物质稳定传代的同时还可以直接作为mRNA?#20613;?#21512;成一条完整的病毒多
?#29287;矗╬olyprotein)(即开放阅读框ORF)。5’-UTR长626nt,含有丰富的二级结构。DHAV 的
3′-UTR 长为 314~317nt,为已知小 RNA 病毒科成员中3′-UTR 最长的病毒。DHAV的ORF可
进一步切割形成L-VP0-VP3-VP1-2A1-2A2-2B-2C-3A-3B-3C-3D。


关于DHAV各地?#29287;?#34892;病学数据存在较大差异,1945年,第一株鸭病毒性肝炎病毒
(即DHAV-1)发现于美国纽约长岛鸭场。1950年,Levine和Fabricant从鸡胚中首次分离到鸭
病毒性肝炎病原,随后世界上很多国家相继报道了DHAV-1?#29287;饜小?#22312;我国,1963年上海畜牧
研究所的黄均建首次报道了鸭病毒性肝炎发现于上海;1980年,王平等在?#26412;?#22320;区分离到
了第一株DHAV-1。随后,浙江、福建等地都先后报道了DHAV-1的发生和流?#23567;?#33487;敬良等于
1999年5月从?#26412;?#24191;西疑似鸭肝炎的病死鸭体内分离到 2 株病毒(分别编号为B株和C
株),经鸭胚血清中和试验表明两者为同一血清型,但与经典DHAV-1无血清学交叉免疫反
应,人工感染雏鸭可复制出与临床病例相似的病变,于是认为有新的血清型出现,并把分离
到的病毒命名为新型DHAV,基因组序列测定表明该毒株与 Kim报道的韩国新型鸭病毒性肝
炎(即DHAV-3)同源性最高。袁?#25910;?#31561;对1999-2010年从广东、山东、云南、河南和黑龙江等地
发病死亡雉鸭分离得到 DHAV 分离株进行血清型鉴定与抗原相关VPl 基因序列分析,结果
表明目前DHAV-1和DHAV-3两种基因型同时流?#23567;?#30740;究发现,DHAV-2仅在我国台湾地区报道
(Tseng CH, Tsai HJ. Molecular characterization of a new serotype of duck
hepatitis virus. Virus Res, 2007, 126(1-2): 19-31.)。目前GenBank数据库仅2株
DHAV-2基因组序列,90D株,GenBank登录号EF067924;04G株,GenBank登录号EF067923。流行
病学研究表明,DHAV-2在我国大陆地区和世界其他国家和地区尚未见该病报道。当前国内
外尚未见利用特异性检测检测鸭2型甲肝病毒的检测试剂盒及其检测方法相关研究报道,
本发明的建立可填补国内外相关领域空白。


发明内容


本发明提供一种鸭2型甲肝病毒检测试剂盒及其检测方法,可以准确快速的判别
病料中是否含有鸭2型甲肝病毒。


为实现上述技术方?#31119;?#37319;用以下技术方?#31119;?br>

一种用于检测鸭2型甲肝病毒的引物对,所述引物如下所示:


DHAV-2F:5’-TACATCTATGGGTGGTATTCTT-3’;


DHAV-2R:5’-TTCAATTTCAAGATGGAGCTCA-3’;


目的片?#26410;?#23567;为391 bp。


鸭2型甲肝病毒检测试剂盒,其包含权利要求1所述的引物对。


所述试剂盒的使用方法包括如下:


(1)鸭2型甲肝病毒阳性对照和阴性对照;


(2)鸭2型甲肝病毒引物对:


DHAV-2F:5’-TACATCTATGGGTGGTATTCTT-3’;


DHAV-2R:5’-TTCAATTTCAAGATGGAGCTCA-3’;


(3)?#37259;?#24405;:提取的核酸(RNA)5μL,0.1μg/uL随机引物1μL,2× TSⅡ Reaction Mix 10
μL,TransScript Ⅱ RT/RI Enzyme Mix 1μL,gDNA Remover 1μL,Rnase-Free 水2μL,至总
体积20μL。50℃?#37259;?#24405;30 min,85℃加热5s使酶失活,-80℃保存备用。


(4)PCR?#20174;Γ?×DreamTaq Green PCR Master Mix 25μL,10 μmol/L上/下?#25105;?#29289;
各1 μL,模板1 μL,去离子水22 μL,至总体积50μL。?#20174;?#26465;件为95 ℃预变性5 min;95 ℃
30 s、55℃ 30 s、72 ℃ 30s,30个循环;循?#26041;?#26463;后72 ℃?#30001;?0 min。


(5)结果判定:对扩增产物进?#26800;?#27891;检测,当阳性对照出现约391 bp的特异性条
带、阴性对照无扩增条带,空白对照无扩增条带,本次实验结果成立且有效。当待检样品出
现约391 bp条带,判为鸭2型甲肝病毒(DHAV-2)感染阳性;当待检样品无特异性扩增条带判
为阴性。


本发明的优点在于:


本发明采用的特异性引物选择DHAV-2与DHAV-1、DHAV-3氨基酸同源性最低的2A2蛋白
区域进行设计获得,能够准确、快速、方便的辨别病料中是否含有鸭2型甲肝病毒,检测限可
达4.08×10
3拷贝/μL;特异?#38498;茫?#23545;常见鸭群传染病均无交叉?#20174;Α?#26412;发明利用所述特异性
引物,建立了一种鸭2型甲肝病毒检测试剂盒及其检测方法,通过试验证明了该特异性引物
具有敏感性高、特异?#38498;?#30340;特点,填补了国内外的空白。


附图说明


图1 鸭2型甲肝病毒检测试剂盒特异性试验,其中M:DL2000 分子量标准;1:DHAV-
2;2:DHAV-1;3:DHAV-3;4:禽流感病毒;5:禽1型副粘病毒;6:番鸭呼肠孤病毒;7:鸭新型呼
肠孤病毒;8:禽?#20849;?#33487;病毒;9:阴性对照。


图2 为鸭2型甲肝病毒检测试剂盒敏感性试验,其中M:DL2000 分子量标准;1:
4.08×10
6拷贝/μL;2:4.08×10
5拷贝/μL;3:4.08×10
4拷贝/μL;4:4.08×10
3拷贝/μL;5:
4.08×10
2拷贝/μL;6:4.08×10
1拷贝/μL。


图3 为鸭2型甲肝病毒检测试剂盒结果判定示意图,其中M:DL2000 分子量标准;
1:阳性对照;2:阴性对照;3:空白对照;4:检测结果阳性;5:检测结果阴性。


具体实施方式


下面实施例对本发明做进一步的描述。


实施例1


1、相关试验病原


试验用病原鸭2型甲肝病毒(DHAV-2)、DHAV-1、DHAV-3、禽流感病毒、禽1型副粘病毒、番
鸭呼肠孤病毒、鸭新型呼肠孤病毒、禽?#20849;?#33487;病毒均由福建省农业科学?#30418;?#29287;兽医研究所
鉴定和保存。


、引物设计


参考鸭2型甲肝病毒(鸭2型甲肝病毒90D株,GenBank登录号为EF067924)基因序列特
征,设计实时荧光定量检测鸭2型甲肝病毒的PCR方法的特异性引物(DHAV-2F、DHAV-2R),引
物设计区选择DHAV-2与DHAV-1、DHAV-3氨基酸同源性最低的2A2蛋白区域设计,三种相关蛋
白的氨基酸同源性低于70.0%。设计的特异性引物序列为:


DHAV-2F:5’-TACATCTATGGGTGGTATTCTT-3’;


DHAV-2R:5’-TTCAATTTCAAGATGGAGCTCA-3’;


目的片?#26410;?#23567;为391 bp。


并在NCBI数据库进行引物Blast分析,验证设?#22484;?#29289;的特异性。


上述引物均在宝日医生物技术(?#26412;?#26377;限公司合成。


、鸭2型甲肝病毒RT-PCR检测方法建立


3.1 鸭2型甲肝病毒阳性标准品的构建


本研究直接利用全基因合成技术合成DHAV-2(90D株)全基因组序列,全基因合成在生
工生物工程(上海)股份有限公司进行,并将获得的质粒作为本研究的阳性标准质粒(T-
DHAV-2),经线性化酶切后进行连续倍?#35748;?#37322;后-80 ℃冻存备用(质粒浓度为4.08×10
6~
4.08×10
1拷贝/μL)。


鸭2型甲肝病毒扩增体?#26723;?#20248;化


3.2.1退火温度条件优化


按照DreamTaq Green PCR Master Mix(2?#31890;?#35828;明书进行PCR扩增,退火温度(△T)在50
℃﹣60℃之间进行条件优化,优化后的鸭2型甲肝病毒检测试剂盒PCR条件是:?#20174;?#26465;件为95
℃预变性5 min;95 ℃ 30 s、55℃ 30 s、72 ℃ 30s,30个循环;循?#26041;?#26463;后72 ℃?#30001;?0
min。


3.2.2 特异性试验


提取核酸用于?#37259;?#24405;提取: 提取的核酸(RNA)5μL,0.1μg/uL随机引物1μL,2×TSⅡ
Reaction Mix 10μL,TransScript Ⅱ RT/RI Enzyme Mix 1μL,gDNA Remover 1μL,Rnase-
Free 水2μL,至总体积20μL。50℃?#37259;?#24405;30 min,85℃加热5s使酶失活,-80℃保存备用。


PCR?#20174;?#26465;件为:2×DreamTaq Green PCR Master Mix 25μL,10 μmol/L上/下游
引物各1 μL,模板1 μL,去离子水22 μL,至总体积50μL。?#20174;?#26465;件为95 ℃预变性5 min;95
℃ 30 s、55℃ 30 s、72 ℃ 30s,30个循环;循?#26041;?#26463;后72 ℃?#30001;?0 min。


结果判定示意图如图3:当阳性对照出现约391 bp的特异性条带(第1?#38236;潰?#38452;性
对照无扩增条带(第2?#38236;潰?#31354;白对照无扩增条带(第3?#38236;潰?#26412;次实验结果成立且有效。当
待检样品出现约391 bp条带,判为鸭2型甲肝病毒(DHAV-2)感染阳性(第4?#38236;潰?#24403;待检样
品无特异性扩增条带判为阴性(第5?#38236;潰?br>

利用优化后鸭2型甲肝病毒检测试剂盒的条件,对其他常见鸭源病原(如DHAV-1、
DHAV-3、禽流感病毒、禽1型副粘病毒、番鸭呼肠孤病毒、鸭新型呼肠孤病毒、禽?#20849;?#33487;病毒)
进行检测,评价建立的鸭2型甲肝病毒检测试剂盒的特异性。以DHAV-2为阳性对照,以灭菌
去离子水为阴性对照。结果可见(图1),仅DHAV-2出现特异性扩增条带(第1?#38236;潰?#20854;他常见
鸭源病原和阴性对照均无出现特异性条带,表明本发明特异性?#20426;?br>

3.3.3 敏感性试验


以不同质粒浓度为4.08×10
6~4.08×10
1拷贝/μL的DHAV-2为模板,按照优化后的鸭2
型甲肝病毒检测试剂盒条件进行扩增,确定本方法的最低检测限。结果可见(图2),本发明
的鸭2型甲肝病毒检测试剂盒的最低检测限为4.08×10
3拷贝/μL(第4?#38236;潰?br>

4、临床应用


对75份临床送检鸭源病料进行鸭2型甲肝病毒感?#38236;?#26816;测,用病毒核酸提取试剂盒
EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取相应的RNA,按照优化后的体系和条件分别进行?#37259;?#24405;
和PCR扩增检测。结果发现,除本研究合成的阳性质粒对照外,临床收集的75份鸭病料均未
检测到特异性的目的条带,表明本次收集的75份病料未出现DHAV-2感染。


以上所述仅为本发明的较佳实施例,凡依本发明申请专利?#27573;?#25152;做的均等变化与
修饰,皆应属本发明的涵盖?#27573;А?br>

SEQUENCE LISTING


\u0026lt;110\u0026gt; 福建省农业科学?#30418;?#29287;兽医研究所


\u0026lt;120\u0026gt; 一种鸭2型甲肝病毒检测试剂盒及其检测方法


\u0026lt;130\u0026gt; 2


\u0026lt;160\u0026gt; 2


\u0026lt;170\u0026gt; PatentIn version 3.3


\u0026lt;210\u0026gt; 1


\u0026lt;211\u0026gt; 22


\u0026lt;212\u0026gt; DNA


\u0026lt;213\u0026gt; 人工序列


\u0026lt;400\u0026gt; 1


tacatctatg ggtggtattc tt 22


\u0026lt;210\u0026gt; 2


\u0026lt;211\u0026gt; 22


\u0026lt;212\u0026gt; DNA


\u0026lt;213\u0026gt; 人工序列


\u0026lt;400\u0026gt; 2


ttcaatttca agatggagct ca 22


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