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一种苏云金芽孢杆菌培养方法及其液体培养基.pdf

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一种 苏云金 芽孢 杆菌 培养 方法 及其 液体 培养基
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摘要
申请专利号:

CN201910025388

申请日:

20190111

公开号:

CN109439603A

公开日:

20190308

当前法律状态:

实质审查的生效

有效性:

审中

法?#19978;?#24773;: 实质审查的生效
IPC分类号: C12N1/20;C12R1/07 主分类号: C12N1/20;C12R1/07
申请人: 汪少斌
发明人: 汪少斌
地址: 266022 山东省青岛市市北区上清路37号电视塔文化创意中心329
优先权:
专利代理机构: 代理人:
PDF完整版下载: PDF下载
法律状态
申请(专利)号:

CN201910025388

授权公告号:

法律状态公告日:

20190402

法律状态类型:

实质审查的生效

摘要

本发明公开一种苏云金芽孢杆菌的液体培养基及培养发酵方法,所述液体培养基中由于添加牛磺酸而取得了显著的毒力提升;而牛磺酸和水杨酸的组合更是取得明显的协同作用,将苏云金芽孢杆菌发酵液毒力提升至对3龄小菜蛾?#28388;?#29575;达到令人惊讶的96.7%。本发明的苏云金芽孢杆菌的液体培养基成?#38236;汀?#22521;养方法简单,稳定性较好,便于长途运输和长期保存,具有良好的推广应用前景。

权利要求书

1.一种培养基,其特征在于:所述培养基含有牛磺酸。 2.一种苏云金芽孢杆菌的液体培养基,其特征在于,所述苏云金芽孢杆菌的液体培养基由以下重量百分比的原料组成:葡萄糖4-9%,尿素0.1-1%,磷酸氢二钾0.1-2%,无水乙酸钠0.1-2.5%,硫酸镁0.01-0.1%,氯化铁0.01-0.1%,牛磺酸0.1-2%,水杨酸0.1-2%,其余为无菌水。 3.根据权利要求2所述的苏云金芽孢杆菌的液体培养基,其特征在于,所述苏云金芽孢杆菌的液体培养基由以下重量百分比的原料组成:葡萄糖5-7%,尿素0.1-0.5%,磷酸氢二钾0.5-1%,无水乙酸钠1-2%,硫酸镁0.01-0.02%,氯化铁0.01-0.03%,牛磺酸0.2-1%,水杨酸0.2-1%,其余为无菌水。 4.根据权利要求3所述的苏云金芽孢杆菌的液体培养基,其特征在于,所述苏云金芽孢杆菌的液体培养基由以下重量百分比的原料组成:葡萄糖5%,尿素0.1%,磷酸氢二钾0.5%,无水乙酸钠1%,硫酸镁0.01%,氯化铁0.01%,牛磺酸0.5%,水杨酸0.5%,其余为无菌水。 5.权利要求1-4所述培养基的配制方法,其特征在于:按照所述原料组成,精密称取各原料组分,并置于容量瓶中,然后使用无菌水定容至1L,混?#21462;?6.权利要求1~4任一项所述的苏云金芽胞杆菌液态培养基在培养苏云金芽胞杆菌菌种中的用途。 7.一种苏云金芽孢杆菌的培养发酵方法,其特征在于:将权利要求1-4中任一项所述培养基,每250ml三角瓶40ml装量,用氢氧化钠调培养基pH值为7.0,灭菌后,每瓶接种苏云金芽孢杆菌H14菌株3.5%;温度31℃,震荡培养72h,收集的发酵液。

说明书


一种苏云金芽孢杆菌培养方法及其液体培养基
技术领域


本发明涉及一种微生物培养方法及其液体培养基,具体涉及一种苏云金杆菌液体
发酵培养基。


背景技术


虫害是限制农作物稳定高产的一个重要的因素,每年被害虫侵吞的粮食占总产量
的1/4左右。长期以来,人们依靠化学农药解决虫害问题;但农药的使用非但没能很好解决
虫害问题,却同时造成一系列严重的危害后果,如人畜中毒、环境污?#38236;取?#22240;此,化学?#32972;?#21058;
的应用受到环保组织和社会的巨大压力。伴随着人们环保意识的觉醒及不?#26174;?#24378;,生物农
药逐渐开始受到重视,受到越来越多的关注。生物防治具有无污染、?#32972;?#25928;率高、不易产生
抗性等优点,被认为是较为理想的防?#38382;?#27573;。生物防?#25105;?#36234;来越受到有关部门及科研机构
的重视,其中令人瞩目的是利用昆虫病原细菌防治蚊虫方面的研究应用。在这其中,苏云金
芽孢杆菌是世界公认的应用最为广泛及成功的微生物?#32972;?#21058;之一。


苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是一种革兰氏染色阳性反应
(G+)细菌,主要特性在于形成芽孢的同时在菌体内形成具有蛋白?#24066;?#36136;的一个或多个伴胞
晶体。而所述伴孢晶体对鳞翅目、双翅目、?#39135;?#30446;、膜翅目、同翅目昆虫及动植物寄生线虫等
有较强的毒杀作用,而对非目标生物安全因此,Bt?#32972;?#21058;具有专一、高效和对人畜安全等优
点。目前苏云金杆菌商?#20998;萍烈?#36798;100多种,是世界上应用最为广泛、用量最大、效果最好的
微生物?#32972;?#21058;,因而倍受人们关注。Bt以色列亚种(B.thuringiensis subsp.israelensis,
简称Bti)对多种蚊虫有高效活性,已成功开发为生物?#32972;?#21058;用于蚊虫和蚋等多种双翅目昆
虫的防?#21361;?#22312;疟?#30149;?#30331;革热、黄热病?#20219;?#23186;疾病的控制上发挥了重要的作用。然而目前生产
应用的Bti菌?#28304;?#22312;?#32972;娣段?#31364;、有效成分易?#21040;狻⒁资?#29615;境因素影响?#28909;?#28857;,还陆续有Bt
在实验室条件下形成一定抗药性的相关报道。


发明内容


本发明的目的是提供一种高效的苏云金芽孢杆菌液体培养基及其配制方法。微生
物?#32972;?#21058;商业化前,培养基的选择极其重要,高效的发酵培养基能充分发?#30001;背?#27963;性菌株
的毒力和致病?#30465;?#26412;发明即提供了一种综合利用碳源、氮源和金属离子配制成的苏云金芽
孢杆菌培养方法及其液体培养基,尤其是牛磺酸和水杨酸的加入,更是给苏云芽孢杆菌的
?#32972;?#25928;果带来了极大的提升,取得了预料不到的技术效果。本发明的培养基将苏云金芽孢
杆菌发酵液对3龄小菜蛾的毒力,从60%左?#19994;鬧滤?#29575;提高到95%以上,?#32972;?#25928;果提升明
显。


申请人在研究中发现,在苏云金芽孢杆菌液体培养基中添加牛磺酸能够极大提高
发酵液对虫害(如小菜蛾)的杀伤力,而水杨酸的加入更是能够进一步协同加强这种杀伤
力,制备得到的发酵液对3龄小菜蛾的?#28388;?#29575;达到95%以上。


本发明的液体培养基由以下组分组成:葡萄糖、尿素、磷酸氢二钾、无水乙酸?#21860;?#30827;
酸镁、氯化铁、牛磺酸、水杨酸和无菌水。


所述液体培养基的原料配比为(w/v):葡萄糖4-9%,尿素0.1-1%,磷酸氢二钾
0.1-2%,无水乙酸钠0.1-2.5%,硫酸镁0.01-0.1%,氯化铁0.01-0.1%,牛磺酸0.1-2%,
水杨酸0.1-2%,其余为无菌水。


优选地,所述配比为(w/v):葡萄糖5-7%,尿素0.1-0.5%,磷酸氢二钾0.5-1%,无
水乙酸钠1-2%,硫酸镁0.01-0.02%,氯化铁0.01-0.03%,牛磺酸0.2-1%,水杨酸0.2-
1%,其余为无菌水。


更优选地,所述配比为(w/v):葡萄糖5%,尿素0.1%,磷酸氢二钾0.5%,无水乙酸
钠1%,硫酸镁0.01%,氯化铁0.01%,牛磺酸0.5%,水杨酸0.5%,其余为无菌水。


本发明的有益效果:1、本发明的液体培养基成?#38236;停?#32452;成简单,克服了传统的苏云
金芽孢杆菌培养基成本高、不宜大规模生产、生产操作过于复杂的缺点,便于长途运输和长
期保存。2、使用本发明的苏云金芽孢杆菌得到的苏云金芽孢杆菌发酵液对3龄小菜蛾有较
高的毒力,?#32972;?#25928;果显著。本发明还?#20113;?#34411;、麦瘿蚊等多种昆虫均有优越的的?#32972;?#29305;性;具
有良好的推广应用前景。


具体实施方式


实施例1:培养基的配制


制?#26438;?#32452;培养基,分别为对照培养基、培养基1(添加牛磺酸)、培养基2(添加水杨
酸)和培养基3(添加牛磺酸和水杨酸),其具体配比及配制方法如下(w/v):


对照培养基:葡萄糖5%,尿素0.1%,磷酸氢二钾0.5%,无水乙酸钠1%,硫酸镁
0.01%,氯化铁0.01%,其余为无菌水;其配制方法为:精密称取葡萄糖50g、尿素1g、磷酸氢
二钾5g、无水乙酸钠10g、硫酸镁0.1g、氯化铁0.1g,分别加入容量瓶中,使用无菌水定容至
1L,混?#21462;?br>

培养基1:葡萄糖5%,尿素0.1%,磷酸氢二钾0.5%,无水乙酸钠1%,硫酸镁
0.01%,氯化铁0.01%,牛磺酸1%,其余为无菌水;其配制方法为:精密称取葡萄糖50g、尿
素1g、磷酸氢二钾5g、无水乙酸钠10g、硫酸镁0.1g、氯化铁0.1g、牛磺酸10g,分别加入容量
瓶中,使用无菌水定容至1L,混?#21462;?br>

培养基2:葡萄糖5%,尿素0.1%,磷酸氢二钾0.5%,无水乙酸钠1%,硫酸镁
0.01%,氯化铁0.01%,水杨酸1%,其余为无菌水;其配制方法为:精密称取葡萄糖50g、尿
素1g、磷酸氢二钾5g、无水乙酸钠10g、硫酸镁0.1g、氯化铁0.1g、水杨酸10g,分别加入容量
瓶中,使用无菌水定容至1L,混?#21462;?br>

培养基3:葡萄糖5%,尿素0.1%,磷酸氢二钾0.5%,无水乙酸钠1%,硫酸镁
0.01%,氯化铁0.01%,牛磺酸0.5%,水杨酸0.5%,其余为无菌水;其配制方法为:精密称
取葡萄糖50g、尿素1g、磷酸氢二钾5g、无水乙酸钠10g、硫酸镁0.1g、氯化铁0.1g、牛磺酸5g、
水杨酸5g,分别加入容量瓶中,使用无菌水定容至1L,混?#21462;?br>

实施例2:苏云芽孢杆菌的发酵培养及毒力检测


按以上培养基配方,每组培养基设置3个250ml三角瓶,每250ml三角瓶40ml装量,
用氢氧化钠调培养基pH值为7.0,高压灭菌后,每摇瓶接种苏云金芽孢杆菌H14菌株3.5%,
温度为31℃,培养72h,?#29992;?#29942;培养基提取5ml发酵液用无菌水稀释到100ml制成供试发酵
液;使用所述供试发酵液浸泡小白菜叶片,5min后取出,晾干后加入养虫瓶中,以无菌水浸
泡的叶子为空白对照,每瓶接入20条大小一致、已饥饿24h的小菜蛾3龄幼虫,23℃恒?#28388;?br>养,48h后统计?#28388;?#29575;,试验结果见表1。


表1:







如表1所示:本发明的苏云金芽孢杆菌培养发酵方法得到的苏云金芽孢杆菌发酵
液对3龄小菜蛾均有较高的毒力;其中,牛磺酸的加入能够显著提高培养的发酵液的毒力;
水杨酸的加入,虽然也能够对发酵液的毒力产生一定提高,但作用有限;而牛磺酸和水杨酸
的同时加入,却取得了明显的毒力提升,令苏云金芽孢杆菌发酵液对3龄小菜蛾的48h平均
?#28388;?#29575;达到96.7%(甚至达到100%),?#32972;?#25928;果卓越,取得了预料不到的技术效果。另外,本
发明还?#20113;?#34411;等多种昆虫昆虫进行了?#32972;?#25928;果测试,同样具有显著的?#32972;?#25928;果。


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