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一种用于检测粪便乳糖含量的试?#37327;?#21450;基于此的粪便乳糖检测方法.pdf

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一种 用于 检测 粪便 乳糖 含量 试剂 基于 方法
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摘要
申请专利号:

CN201910027280

申请日:

20190111

公开号:

CN109557088A

公开日:

20190402

当前法律状态:

实质审查的生效

有效性:

审中

法?#19978;?#24773;: 实质审查的生效
IPC分类号: G01N21/78 主分类号: G01N21/78
申请人: 四川沃文特生物技术有限公司
发明人: 陈功台
地址: 610000 四川省成都市高新区西芯大道6号
优先权:
专利代理机构: 51220 代理人: 李英
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法律状态
申请(专利)号:

CN201910027280

授权公告号:

法律状态公告日:

20190426

法律状态类型:

实质审查的生效

摘要

本发明公开了一种用于检测粪便乳糖含量的试?#37327;ǎ?#21253;括依次相连的样?#38236;妗?#21453;应垫和显色垫,其中样?#38236;?#25215;载有乳糖酶,反应垫承载有半乳糖氧化酶,显色垫上承载有显色剂。利用该试纸卡能够有效测定粪便中的乳糖,临床操作简单,且特异性高。本发明还公开一种粪便乳糖含量检测方法。

权利要求书

1.一种用于检测粪便乳糖含量的试?#37327;ǎ?#20854;特征在于,包括依次相连的样?#38236;妗?#21453;应垫和显色垫,其中样?#38236;?#25215;载有乳糖酶,反应垫承载有半乳糖氧化酶,显色垫上承载有显色剂。 2.根据权利要求1所述的一种用于检测粪便乳糖含量的试?#37327;ǎ?#20854;特征在于,所述反应垫上还承载有4-氨基安替比林和过氧化物酶。 3.根据权利要求1所述的一种用于检测粪便乳糖含量的试?#37327;ǎ?#20854;特征在于,所述样?#38236;?#26448;质为玻璃?#23435;?#32032;膜,样?#38236;?#22788;理工艺为:将玻璃?#23435;?#32032;膜在含有缓冲剂、表面活性剂和乳糖酶的样?#38236;?#22788;理液中浸泡后,在36~38℃下干燥。 4.根据权利要求1所述的一种用于检测粪便乳糖含量的试?#37327;ǎ?#20854;特征在于,所述反应垫材质为聚酯?#23435;?#33180;,反应垫处理工艺为:将聚酯?#23435;?#33180;在含有缓冲剂、4-氨基安替比林、半乳糖氧化酶和过氧化物酶的反应垫处理液中浸泡后,在36~38℃下干燥。 5.根据权利要求1所述的一种用于检测粪便乳糖含量的试?#37327;ǎ?#20854;特征在于,所述显色垫材质为硝酸?#23435;?#32032;膜,显色垫处理工艺为:在硝酸?#23435;?#32032;膜上喷涂含显色剂和缓冲剂的显色垫处理液,?#32531;?#22312;36~38℃下干燥。 6.根据权利要求1所述的一种用于检测粪便乳糖含量的试?#37327;ǎ?#20854;特征在于,所述显色剂为N-?#19968;?N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯?#32442;?#30416;或对羟基苯甲酸钠。 7.一种粪便乳糖含量检测方法,其特征在于,包括以下步骤: (1)将粪便样本液滴加到权利要求1-6中任一项所述的一种用于检测粪便乳糖含量的试?#37327;?#30340;样?#38236;?#19978;,36~38℃反应3-5min; (2)反应完毕后,观察试?#37327;?#30340;显色垫颜色,对比判定粪便样本液内乳糖的浓度。 8.根据权利要求7所述的一种粪便乳糖含量检测方法,其特征在于,步骤(2)中,粪便样本液内乳糖浓度的判定通过将显色垫颜色与比色卡颜色对比实现。 9.根据权利要求8所述的一种粪便乳糖含量检测方法,其特征在于,所述比色卡制备方式如下?#21495;?#21046;多个不同浓度的标准乳糖浓度反应液,分别与试?#37327;?#21453;应后拍照记录显色垫颜色深浅,将每种颜色与标准乳糖浓度反应液的乳糖浓度对应起来,印刷制作出比色卡。 10.一种用于检测粪便乳糖含量的试?#37327;?#22312;乳糖不耐受症的诊断中的应用。

说明书


一种用于检测粪便乳糖含量的试?#37327;?#21450;基于此的粪便乳糖检测方法
技术领域


本发明涉及乳糖检测领域,具体涉及一种用于检测粪便乳糖含量的试?#37327;?#21450;基于
此的粪便乳糖检测方法。


背景技术


乳糖[lactose]是二糖的一种,分子式是C
12H
22O
11,是在哺乳动物乳汁中的双糖,因
此而得名。它的分子结构是由一分子葡萄糖和一分子半乳糖缩合形成,分α-型和β-型两种
异构体,α-乳糖可被酸和乳糖酶分解成葡萄糖和半乳糖,可受乳酸菌类的作用而成为乳酸,
但酵母不能利用。β-型乳糖仅存在于动物乳汁中,人乳中约含7%(5%~8%),牛乳中约含
4.5%(4%~5%),在体温状态时,按二份α-型和三份β-型的比例混合而成平衡状态。


乳糖在人体中不能?#33519;?#21560;收,需要在乳糖酶的作用下分解才能被吸收,缺少乳糖
分解酶的人群在摄入乳糖后,未被消化的乳糖?#33519;?#36827;入大肠,刺激大肠蠕动加快,造成腹
鸣、腹泻等症状称乳糖不耐受症。食用酸奶、低乳糖奶可以减缓乳糖不耐受症。


哺乳动物的幼体在断乳后,开始逐渐的减少乳糖酶的合成,人类的幼儿在4岁的时
候通常会失去90%的乳糖消化能力,但各人之间的差异很大。一些人种的第2号染色体上发
生基因突变,表现能终止乳糖酶的减少性状,所以这些人种终生能消化乳糖。


关于该变异出现的时间和地点科学上?#24418;?#19968;致的结论。有人认为是前4000年左右
在瑞典和阿拉伯半岛分别独立出现并逐渐在扩展中融合,有人认为是前4500年左右在中东
地区出现后,扩展到别处。另外有人认为该变异在更晚的时候又独立出现在东非的图西族
人中。目前的状况是:多数祖籍西欧的人基因中存在该变异(意味着他们够终生消化乳糖),
而东亚人、撒哈拉沙漠以南的非洲人和美洲、大洋洲的原住民族则多数没有该变异(意味着
他们成年后会出现乳糖不耐症),全球平均有75%的人成年后会出?#31181;?#29366;。


乳糖不耐症发生的人种间差别据悉,70%的成年黑人、10-15%的成年白人、95%
的亚洲人受乳糖不耐症困扰。在中国,根据科研人员的?#33455;?#32467;果,成年人饮用牛乳后乳糖吸
收不良的发生率高达86.7%,不耐受指数为0.9。


在缺乏乳糖酶的情况下,人摄入的乳糖不能被消化吸收进血液,而是滞留在肠道。
肠道细菌发酵分解乳糖的过程中会产生大量气体,造成腹胀、放屁,过量的乳糖?#22815;?#21319;高肠
道内部的渗透压,阻止?#36816;?#20998;的吸收而导致腹泻。当未分解吸收的乳糖进入结肠后,被肠道
存在的细菌发酵成为小分子的有机酸如醋酸、丙酸、丁酸等,并产生一些气体如甲烷、H2、
CO2等,这些产物大部分可被结肠重吸收,新生儿小肠粘膜乳糖酶缺乏是主要病因,部分人
群因长期不摄入奶及奶?#30772;芬不?#36896;成乳糖酶缺乏。未被吸?#29031;?#25110;仍未被分解的乳糖可引起
肠鸣、腹胀、腹痛、排气、不舒服、腹泻等症状,有的人?#22815;?#21457;生嗳气、恶心等,这些症状称为
乳糖不耐受症。乳糖不耐症状个体差异很大,?#29616;?#30340;乳糖不耐受多于摄入一定量乳糖后30
?#31181;又?#25968;小时内发生。


乳糖不耐症对婴幼儿影响较大,并会同时伴有尿布疹、呕吐、生长发育迟缓等,成
人有时伴恶心反应。不耐受症状的多少和?#29616;?#31243;度与多种因素有关,如小肠内乳糖酶活性、
摄入的乳糖量以及是否同时摄入其它类食品等。


婴幼儿由于先天性或者继发性乳糖酶缺乏,在进食乳类后,乳糖不能被小肠吸收,
于?#19988;?#36215;腹泻。母乳和牛乳中的糖类主要是乳糖,小肠尤其是空肠黏膜表面绒毛的顶端乳
糖酶的分泌量减少或活性不高,就不能完全消化和分解乳汁中的乳糖。部分乳糖从大便排
出,粪便中还原糖增加,部分留在肠腔内的乳糖被细菌酵解成乳酸等,肠腔内的渗透压增
高,?#31181;?#20102;水分的吸收,乳酸刺激肠壁增加肠蠕动而出现腹泻。


目前常用诊断乳糖酶缺乏的实验室方法有以下几种。


1.呼气实验:乳糖酶缺乏者未被小肠吸收的乳糖进入结肠后,经结肠内细菌作用,
生成H
2、CO
2及CH
4等气体,弥散入血后由肺排出,检测呼出气体中上述气体的含量有助于乳
糖酶缺乏的诊断。呼气试验是目前诊断乳糖酶缺乏最常用的试验。口服(1~2)g/kg乳糖,每
隔30min取呼气末样本1次,约取2~4小时标本,如H
2数值>20mg/L(ppm)?#21050;?#31034;乳糖酶缺
乏。本方法准确、简单、无创、方便,特异度和敏感度均>90%,但不足之处包括:1)需配备微
量氢气测定仪,基层单位难以推广;2)操作时间长达数小时,不利于大样本人群的调查;3)
约2%正常人群不产H
2;4)糖尿病等因素影响检测结果;5)需要受试者配合,年幼儿(\u0026lt;3岁)
无法进行;6)对于阳性患者,需排除是否存在蔗糖?#20154;?#31958;不耐受;7)缺乏统一乳糖口服剂量
及阳性试验结果判定标准。试验?#27688;?#20813;摄入酸性食物,否则可出现假阳性。


2.空肠活检测定乳糖酶的活性并病理组织学观察:该方法是目前确诊乳糖酶缺乏
最?#33519;印?#26368;可靠的方法,如乳糖酶/蔗糖酶的比值≤0.3,或乳糖酶的绝对值<5IU/g蛋白或
<1.5IU/g肠组织,即可诊断为乳糖酶缺乏。同?#33519;?#34892;病理组织学检查,原发性乳糖酶缺乏
仅有乳糖酶活力下降,而无肠黏膜病变;继发性者常伴有肠黏膜病变。还可区别单发性或多
发性糖吸收不良。但因该方法为有创检查,难以作为常规诊断方法。婴幼儿更是难以实施。


3.乳糖耐量试验:乳糖耐量试验是传统的检测方法,口服乳糖后于不同的时间点
取血,检测血糖水平,如血糖<200mg/L?#27425;?#38451;性,提示乳糖酶缺乏。该法操作简单,但需多
次取血,小儿难以接受,假阳性率高,特异性差。


4.大便还原糖及pH值测定:哺乳期婴儿摄入的糖主要为乳糖,肠道内未被分解的
乳糖随粪便排出,同时粪便中含有乳糖代谢所产生的有机酸(乙酸、乳酸、丙酸、丁酸等)而
使粪便pH?#21040;档停?#22240;而粪便中还原糖含量和pH值改变可体现乳糖分解情况。醋酸铅法检测
粪便还原糖含量,如还原糖≥(++)为阳性,同时粪便pH值<5.5,?#21050;?#31034;乳糖酶缺乏。该法标
本来源方便、操作简便、灵敏度高,可以作为大样本人群的筛查方法。其他还可用改?#21450;?#27663;
试剂法等检测粪便中还原糖含量。但均需要对样品预处理和高?#28388;?#28020;加热,在临床操作中
比?#32454;叢印?#29305;异性差,难以实现自动化,且醋酸铅法和改?#21450;?#27663;试剂法均存在重金属污染和
生物安全风险,?#27605;?#21313;分明显。


发明内容


为?#31169;?#20915;上述技术问题,本发明公开一种用于检测粪便乳糖含量的试剂,利用该
试纸卡能够有效测定粪便中的乳糖,操作简单,且特异性高。本发明还公开一种粪便乳糖含
量检测方法。


本发明通过下述技术方案实现:


一种用于检测粪便乳糖含量的试?#37327;ǎ?#21253;括依次相连的样?#38236;妗?#21453;应垫和显色垫,
其中样?#38236;?#25215;载有乳糖酶,反应垫承载有半乳糖氧化酶,显色垫上承载有显色剂。


其中,所述反应垫上还承载有4-氨基安替比林和过氧化物酶。


本发明中,样?#38236;?#19978;的乳糖酶用于将粪便中的乳糖分解为半乳糖和葡萄糖,反应
垫上的半乳糖氧化酶用于将层析至反应垫上的半乳糖分解为半乳己二醛糖和过氧化氢,层
析?#26009;?#33394;垫上的过氧化氢、4-氨基安替比林在过氧化物酶的作用下,与显色垫上的显色剂
反应呈现颜色,因此能够有效检测出粪便中是否含有乳糖,由于与显色剂反应的过氧化氢
为半乳糖分解所得到,因此当显色垫出现颜色反应时,即可得知粪便中含有乳糖,准确度
高,特异性好,能够有效避免其他杂质的干扰和影响。


进一步的,所述样?#38236;?#26448;质为玻璃?#23435;?#32032;膜,样?#38236;?#22788;理工艺为:将玻璃?#23435;?#32032;膜
在含有缓冲剂、表面活性剂和乳糖酶的样?#38236;?#22788;理液中浸泡后,在36~38℃下干燥3~5小
时。


所述缓冲剂包括:磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠和谷氨酸钠,所述表面活性剂
为Brij-35,Tween-20。


进一步的,所述反应垫材质为聚酯?#23435;?#33180;,反应垫处理工艺为:将聚酯?#23435;?#33180;在含
有缓冲剂、4-氨基安替比林、半乳糖氧化酶和过氧化物酶的反应垫处理液中浸泡后,在36~
38℃下干燥3~5小时。


进一步的,所述显色垫材质为硝酸?#23435;?#32032;膜,显色垫处理工艺为:在硝酸?#23435;?#32032;膜
上喷涂含显色剂和缓冲剂的显色垫处理液,?#32531;?#22312;36~38℃下干燥3~5小时。


本发明中,样?#38236;?#30340;作用在于拦截粪便样本液中的大颗粒杂质和作为试?#37327;?#26816;测
?#20302;?#36827;行缓冲以保障反应体系中1分子乳糖在乳糖酶的作用下分解成1分子葡萄糖和1分子
半乳糖,反应垫的作用在于为试?#37327;?#26816;测?#20302;?#36827;行缓冲以保障反应体系中半乳糖在半乳糖
氧化酶作用下生成半乳己二醛糖和过氧化氢,过氧化氢、4-氨基安替比林在过氧化物酶的
作用下,与显色剂N-?#19968;?N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯?#32442;?#30416;或对羟基苯甲酸钠氧化
生成醌亚胺化合物呈现颜色。


进一步的,所述显色剂为N-?#19968;?N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯?#32442;?#30416;或对羟
基苯甲酸钠。


本发明的显色剂采用N-?#19968;?N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯?#32442;?#30416;或对羟基苯
甲酸钠,过氧化氢、4-氨基安替比林在过氧化物酶的作用下,与显色剂N-?#19968;?N-(2-羟基-
3-磺丙基)-3-甲基苯?#32442;?#30416;或对羟基苯甲酸钠氧化生成醌亚胺化合物,由于醌亚胺化合物
在一定范围内显色的深浅与半乳糖的浓度?#25910;?#27604;,因此也是与乳糖的浓度?#25910;?#27604;,通过显
色强度与比色卡的标准色带比较从而检测出含量范围,不仅实现粪便乳糖的定性测量,还
能够实现定量测量。


一种粪便乳糖含量检测方法,包括以下步骤:


(1)将粪便样本液滴加到上述一种用于检测粪便乳糖含量的试?#37327;?#30340;样?#38236;?#19978;,
反应3-5min;


(2)反应完毕后,观察试?#37327;?#30340;显色垫颜色,对比判定粪便样本液内乳糖的浓度。


本发明中,当粪便样本中存在乳糖时,粪便样本液首?#26579;?#36807;样?#38236;?#36807;滤掉样品中
的大颗粒物质并进行缓冲,并在层析的过程中,1分子乳糖在样?#38236;?#20013;乳糖酶的作用下分解
成1分子葡萄糖和1分子半乳糖,当半乳糖层析至反应垫上时,在半乳糖氧化酶作用下生成
半乳糖己二醛糖和过氧化氢,层析?#26009;?#33394;垫上的过氧化氢、4-氨基安替比林在过氧化物酶
的作用下,与显色垫中显色剂N-?#19968;?N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯?#32442;?#30416;或对羟基苯
甲酸钠生成醌亚胺化合物,在一定范围内显色的深浅与半乳糖的浓度?#25910;?#27604;,因此也是与
乳糖的浓度?#25910;?#27604;,通过显色强度与比色卡的标准色带进行比较,从而检测出含量范围。


粪便样本液内乳糖浓度的判定通过将显色垫颜色与比色卡颜色对比实现,所述比
色卡制备方式如下?#21495;?#21046;多个不同浓度的标准乳糖浓度反应液,分别与试?#37327;?#21453;应后拍照
记录显色垫颜色深浅,将每种颜色与标准乳糖浓度反应液的乳糖浓度对应起来,印刷制作
出比色卡。


标准乳糖浓度反应液的乳糖浓度可以为,0g/L、0.01g/L、0.02g/L、0.05g/L、0.1g/
L、0.2g/L、0.5g/L、1.0g/L、2.0g/L、5.0g/L、10g/L、20g/L、50g/L、100g/L,分别将配制好的
标准乳糖浓度反应液加入到试?#37327;?#20013;进行测试,并拍照记录颜色深浅后印刷制作出比色
卡。
















浓度


0g/L


0.01g/L


0.02g/L


0.05g/L


0.1g/L


0.2g/L


0.5g/L




结果











+


+


+


++




浓度


1.0g/L


2.0g/L


5.0g/L


10g/L


20g/L


50g/L


100g/L




结果


++


++


+++


++++


++++


++++


++++






根据颜色深浅变化,选择浓度为0.05g/L、0.5g/L将比色卡条的颜色分级为3个半
定量区间,<0.05g/L提示乳糖耐受;0.05g/L~0.5g/L提示乳糖吸收不良;>0.5g/L提示乳
糖不耐受。


所述样?#38236;妗?#21453;应垫和显色垫依次首尾相连呈一条线。


一种用于检测粪便乳糖含量的试?#37327;?#22312;乳糖不耐受症的诊断中的应用。


本发明与现有技术相比,具有如下的优点和有益效果:


1、本发明一种用于检测粪便乳糖含量的试?#37327;ǎ?#26679;?#38236;?#19978;的乳糖酶用于将粪便中
的乳糖分解为半乳糖和葡萄糖,反应垫上的半乳糖氧化酶用于将层析至反应垫上的半乳糖
分解为半乳己二醛糖和过氧化氢,层析?#26009;?#33394;垫上的过氧化氢、4-氨基安替比林在过氧化
物酶的作用下,与显色垫上的显色剂反应呈现颜色,因此能够有效检测出粪便中是否含有
乳糖,由于与显色剂反应的过氧化氢为半乳糖分解所得到,因此当显色垫出现颜色反应时,
即可得知粪便中含有乳糖,准确度高,特异性好,能够有效避免其他杂质的干扰和影响;


2、本发明一种用于检测粪便乳糖含量的试?#37327;ǎ?#26174;色剂采用N-?#19968;?N-(2-羟基-
3-磺丙基)-3-甲基苯?#32442;?#30416;或对羟基苯甲酸钠,过氧化氢、4-氨基安替比林在过氧化物酶
的作用下,与显色剂N-?#19968;?N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯?#32442;?#30416;或对羟基苯甲酸钠氧
化生成醌亚胺化合物,由于醌亚胺化合物在一定范围内显色的深浅与半乳糖的浓度?#25910;?br>比,因此也是与乳糖的浓度?#25910;?#27604;,通过显色强度与比色卡的标准色带比较从而检测出含
量范围,不仅实现粪便乳糖的定性测量,还能够实现定量测量;


3、本发明一种粪便乳糖含量检测方法,该方法利用样?#38236;?#19978;的乳糖酶用于将粪便
中的乳糖分解为半乳糖和葡萄糖,利用反应垫上的半乳糖氧化酶用于将层析至反应垫上的
半乳糖分解为半乳己二醛糖和过氧化氢,层析?#26009;?#33394;垫上的过氧化氢、4-氨基安替比林在
过氧化物酶的作用下,与显色垫上的显色剂反应呈现颜色,因此能够有效检测出粪便中是
否含有乳糖,操作简单,准确度高,特异性好。


具体实施方式


为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白,下面结合实施例,对本发明作
进一步的详细说明,本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明,并不作为对本
发明的限定。


实施例1


一种粪便乳糖含量检测方法,包括以下步骤:


A.样?#38236;?#30340;制备:将玻璃?#23435;?#32032;膜在样?#38236;?#22788;理液中浸泡处理5?#31181;?#21518;,轻轻挤干
样?#38236;?#22788;理液后放入36~38℃鼓风干燥箱干燥3~5小时,其中,样?#38236;?#22788;理液包含:0.05M
~0.15M的磷酸氢二钠、0.01M~0.05M的磷酸二氢钾、0.05M~0.25M的氯化钠、0.01M~
0.05M的谷氨酸钠、0.1%~1.0%的Brij-35、0.1%~1.0%的Tween-20,100KU/L~400KU/L
的乳糖酶,样?#38236;?#22788;理液pH为7.0~7.5;


B.反应垫的制备:将聚酯?#23435;?#33180;在反应垫处理液中浸泡处理5?#31181;?#21518;,轻轻挤干反
应垫处理液后放入36~38℃鼓风干燥箱干燥3~5小时,其中,反应垫处理液包含:0.05M~
0.15M的磷酸氢二钠、0.01M~0.05M的磷酸二氢钾、0.05M~0.25M的氯化钠、0.01M~0.05M
的谷氨酸钠、0.1%~1.0%的Brij-35、0.1%~1.0%的Tween-20、0.5g/L~3g/L的4-氨基
安替比?#21482;?#23545;羟基苯甲酸钠、200KU/L~500KU/L的半乳糖氧化酶、100KU/L~300KU/L的过
氧化物酶,反应垫处理液pH为7.0~7.5;


C.显色垫的制备:利用喷金机将显色垫处理?#21495;?#28034;在硝酸?#23435;?#32032;膜上,喷量为2.0
μl/cm
2~5.0μl/cm
2,?#32531;?#22312;36~38℃鼓风干燥箱干燥3~5小时,其中,显色垫处理液包含:
0.25M~0.75M的磷酸氢二钠、0.05M~0.25M的磷酸二氢钾、0.25M~1.25M的氯化钠、0.05M
~0.25M的谷氨酸钠、0.5%~3.0%的Brij-35、0.5%~3.0%的Tween-20、2.5g/L~10g/L
的N-?#19968;?N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯?#32442;?#30416;或对羟基苯甲酸钠,显色垫处理液pH为
7.0~7.5;


D.将样?#38236;妗?#21453;应垫和显色垫依次相连,得到线型的试?#37327;ǎ?br>

E.比色卡的制备?#21495;?#21046;多个不同浓度的标准乳糖浓度反应液,分别与试?#37327;?#21453;应
后拍照记录显色垫颜色深浅,将每种颜色与标准乳糖浓度反应液的乳糖浓度对应起来,印
刷制作出比色卡,其中,标准乳糖浓度反应液的乳糖浓度可以为,0g/L、0.01g/L、0.02g/L、
0.05g/L、0.1g/L、0.2g/L、0.5g/L、1.0g/L、2.0g/L、5.0g/L、10g/L、20g/L、50g/L、100g/L;


F.粪便样本液的制备:将粪便样本与样本稀释液的按质量体积比0.25g:8mL混合,
其中样本稀释液为质量分数0.9%的氯化钠溶液;


G.通过移液枪将100μL的粪便样本液滴加在试?#37327;?#30340;样?#38236;?#19978;,在36-38℃下反应
3~5min,反应完毕后观察显色垫上的颜色,并与比色卡对比,判定粪便样本液中乳糖浓度。


实施例2


一种粪便乳糖含量检测方法,包括以下步骤:


A.样?#38236;?#30340;制备:将玻璃?#23435;?#32032;膜在样?#38236;?#22788;理液中浸泡处理5?#31181;?#21518;,轻轻挤干
样?#38236;?#22788;理液后放入36~38℃鼓风干燥箱干燥5小时,其中,样?#38236;?#22788;理液包含:0.10M的磷
酸氢二钠、0.03M的磷酸二氢钾、0.15M的氯化钠、0.03M的谷氨酸钠、0.6%的Brij-35、0.6%
的Tween-20,300KU/L的乳糖酶,样?#38236;?#22788;理液pH为7.2;


B.反应垫的制备:将聚酯?#23435;?#33180;在反应垫处理液中浸泡处理5?#31181;?#21518;,轻轻挤干反
应垫处理液后放入36~38℃鼓风干燥箱干燥4小时,其中,反应垫处理液包含:0.10M的磷酸
氢二钠、0.03M的磷酸二氢钾、0.15M的氯化钠、0.03M的谷氨酸钠、0.6%的Brij-35、0.6%的
Tween-20、1.5g/L的4-氨基安替比?#21482;?#23545;羟基苯甲酸钠、300KU/L的半乳糖氧化酶、300KU/L
的过氧化物酶,反应垫处理液pH为7.3;


C.显色垫的制备:利用喷金机将显色垫处理?#21495;?#28034;在硝酸?#23435;?#32032;膜上,喷量为4.0
μl/cm
2,?#32531;?#22312;36~38℃鼓风干燥箱干燥4小时,其中,显色垫处理液包含:0.50M的磷酸氢
二钠、0.15M的磷酸二氢钾、0.075M的氯化钠、0.15M的谷氨酸钠、1.8%的Brij-35、1.5%的
Tween-20、6g/L的N-?#19968;?N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯?#32442;?#30416;或对羟基苯甲酸钠,显色
垫处理液pH为7.2;


D.将样?#38236;妗?#21453;应垫和显色垫依次相连,得到线型的试?#37327;ǎ?br>

E.比色卡的制备?#21495;?#21046;多个不同浓度的标准乳糖浓度反应液,分别与试?#37327;?#21453;应
后拍照记录显色垫颜色深浅,将每种颜色与标准乳糖浓度反应液的乳糖浓度对应起来,印
刷制作出比色卡,其中,标准乳糖浓度反应液的乳糖浓度可以为,0g/L、0.01g/L、0.02g/L、
0.05g/L、0.1g/L、0.2g/L、0.5g/L、1.0g/L、2.0g/L、5.0g/L、10g/L、20g/L、50g/L、100g/L;


F.粪便样本液的制备:将粪便样本与样本稀释液的按质量体积比0.25g:8mL混合,
其中样本稀释液为质量分数0.9%的氯化钠溶液;


G.通过移液枪将100μL的粪便样本液滴加在试?#37327;?#30340;样?#38236;?#19978;,在37℃下反应
4min,反应完毕后观察显色垫上的颜色,并与比色卡对比,判定粪便样本液中乳糖浓度。


收集43例年龄在0-12个月的腹泻婴幼儿粪便样本,其中临床确诊为乳糖不耐受的
样本20例,临床确诊为乳糖耐受测样本23例,以班氏试剂作为对照试剂本试剂盒作为参比
试剂进行临床试验。结果如下表所示:














乳糖不耐受


乳糖耐受




班氏试剂


14/20(70%)


23/23(100%)




本试剂


19/20(95%)


23/23(100%)






在上述实施例中,显示利用本发明的试?#37327;?#23545;乳糖不耐受样本的检出率为95%,
敏?#34892;?#26174;著高于班氏试剂,可以看出本发明试剂盒的性能相当出色,另外本发明的操作相
比班氏试剂需要高温加热简便,因此可以很好的帮助临床对乳糖不耐受症进行辅助诊断。


以上所述的具体实施方式,对本发明的目的、技术方案和有益效果进行?#31169;?#19968;步
详细说明,所应理解的是,以上所述仅为本发明的具体实施方式而已,并不用于限定本发明
的保护范围,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含
在本发明的保护范围之内。


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