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一种L缬氨酸的生产方法.pdf

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一种 缬氨酸 生产 方法
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摘要
申请专利号:

CN201910028347

申请日:

20190111

公开号:

CN109486894A

公开日:

20190319

当前法律状态:

实质审查的生效

有效性:

审中

法?#19978;?#24773;: 实质审查的生效
IPC分类号: C12P39/00;C12P13/08;C12R1/13;C12R1/74 主分类号: C12P39/00;C12P13/08;C12R1/13;C12R1/74
申请人: 内蒙古拜克生物有限公司
发明人: 王奇;宋春慧;刘培;杨爱华;钱莉
地址: 010206 内蒙古自治区呼和浩特市托克托县托克托工业园区
优先权:
专利代理机构: 11470 代理人: 宋秀兰
PDF完整版下载: PDF下载
法律状态
申请(专利)号:

CN201910028347

授权公告号:

法律状态公告日:

20190412

法律状态类?#20572;?/td>

实质审查的生效

摘要

本发明公开了一种L?缬氨酸的生产方法,包括:S1、发酵工序:将?#26149;?#33740;种接入发酵培养基中,连续发酵,得到缬氨酸发酵液;S2、过滤;S3、超滤、浓缩、结晶:将步骤S2得到的滤液进行超滤,得到超滤液;将得到的超滤液进行蒸发浓缩,得到浓缩液;向得到的浓缩液中加入溶析剂和晶粒进行结晶,抽滤干燥,得到缬氨酸粗品;S4、水溶、离子交换、脱色、精滤以及结晶:将步骤S3得到的缬氨酸粗品溶于蒸馏水中,经离子交换纯化、脱色、精滤、结晶获?#37238;?#32431;度缬氨酸,本发明与现有技术相比,发酵周期短,L?缬氨酸的含量高,同时提高了L?缬氨酸的收率,产品纯度高,为我国L?缬氨酸产业化发?#22266;?#20379;了技术支持。

权利要求书

1.一种L-缬氨酸的生产方法,其特征在于,包括以下步骤: S1、发酵工序: 将?#26149;?#33740;种黄色短?#21496;鶫L41(CICC10135)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)DLPU-IL-和黄色短?#21496;鶭HV 2-58接入发酵培养基中,连续发酵,得到缬氨酸发酵液; S2、过滤: 向步骤S1得到的缬氨酸发酵液中加入β-环?#26149;?#31934;,搅拌溶解后,利用陶瓷膜过滤,得到滤液和湿菌体; S3、超滤、浓缩、结晶: 将步骤S2得到的滤液进行超滤,得到超滤液;将得到的超滤液进行蒸发浓缩,得到浓缩液;向得到的浓缩液中加入溶析剂和晶粒进行结晶,抽滤干燥,得到缬氨酸粗品; S4、水溶、离子交换、脱色、精滤以及结晶: 将步骤S3得到的缬氨酸粗品,溶于蒸馏水中,经离子交换纯化、脱色、精滤、结晶获?#37238;?#32431;度缬氨酸。 2.根据权利要求1所述的生产方法,其特征在于,步骤S1中所述的?#26149;?#33740;种黄色短?#21496;鶫L41(CICC10135)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)DLPU-IL-和黄色短?#21496;鶭HV 2-58的质量比为3:1:1.5。 3.根据权利要求2所述的生产方法,其特征在于,步骤S1中所述发酵培养基的组分包括?#28009;?#33796;糖10-15g/L、海藻粉1-5g/L、玉米浆5-10g/L,硫酸铵15-35g/L,七水硫酸镁0.1-0.5g/L和磷酸二氢钾0.5-1.2g/L,灭菌前pH为6.8-7.0。 4.根据权利要求3所述的生产方法,其特征在于,步骤S1中所述发酵的条件包括,发酵温度为32+2℃,压力为0.103MPa,发酵时间为40-50h。 5.根据权利要求4所述的生产方法,其特征在于,步骤S1中所述发酵采用间歇式曝气,控制培养基中的溶解氧含量,具体为: (1)利用罗茨鼓风机曝气2h,使发酵培养基中的氧溶解饱和度控制在50-60%; (2)关闭罗茨鼓风机,停止曝气,监测培养液中的溶解氧; (3)当培养基中的氧溶解饱和度降至0时,重复步骤(1)-(2)。 6.根据权利要求1所述的生产方法,其特征在于,步骤S2中缬氨酸发酵液与β-环?#26149;?#31934;的质量比为100:3-6。 7.根据权利要求1-6任一项所述的生产方法,其特征在于,步骤S3中所述的结晶为:在20-50min内,以1-10mL/min的速率向20-30℃的浓缩液中加入溶洗剂,同时加入晶粒,搅拌,析出晶体。 8.根据权利要求7所述的生产方法,其特征在于,所述的溶洗剂为乙醇和丙三醇。 9.根据权利要求8所述的生产方法,其特征在于,所述的晶粒为10-30μm的L-缬氨酸。 10.根据权利要求9所述的生产方法,其特征在于,所述浓缩液和L-缬氨酸的质量比为500-1000:1。

说明书


一种L-缬氨酸的生产方法
技术领域


本发明涉及微生物发酵领域,涉及一种L-缬氨酸的生产方法,更具体地说,涉及一
种L-缬氨酸的发酵及分离纯化的方法。


背景技术


L-缬氨酸(L-val),学名2-氨基-3-甲基丁酸,是人体八大必需氨基酸之一,与L-亮
氨酸、L-异亮氨酸统称为支链氨基酸,在医药、调味品、化妆品、营养添加剂、饲料添加剂等
方面有着广泛的应用。


L-缬氨酸的生产方法主要有提取法、合成法和发酵法,其中,微生物发酵法,具有
原材料成?#38236;停?#21453;应条件温和及?#36164;?#29616;大规模生产等优点,成为广泛采用的生产方法。但
是,目前,我国以微生物发酵法生产L-缬氨酸的技术尚不成熟,发酵水平不高,导致发酵周
期长,产酸偏?#20572;?#26434;酸多,成为影响我国L-缬氨酸产业化应用的首要因素。


CN101962664A公开了一种高效生产L-缬氨酸的发酵工艺,其以营养缺陷型和缬氨
酸渗漏型菌株为生产菌株,以一些营养组分按一定比例配制成营养丰富且均衡的培养基作
为发酵培养基,发酵过程中,通过调节发酵罐搅拌转速和风量将溶氧控制在适当的水平,通
过流加液氨控制pH,并通过流加一定浓度的葡萄糖溶液将残糖控制在较低水平,发酵60h后
L-缬氨酸的产量和转化率大幅度提高。


CN105695526A公开了一种通过分步补料提高L-缬氨酸产酸的发酵工艺,通过对培
养基配方的调整,并同时采取分时段补料工艺及分段控制溶氧的方式,促进了缬氨酸的生
物合成,避免了氨基酸生物合成途径中的反馈调节作用,减少了副酸的生成,该发酵工艺能
使L-缬氨酸产酸由原来的70-80h产酸4.5-5.5%提高到现在的50-55h产酸7.0-8.0%,转化
率由原来的20-25%提高到30-32%。


分离纯化是L-缬氨酸工业化生产的另一个重要工序,通常,分离纯化的成本?#30002;?br>生产成本的50%以上。目前,L-缬氨酸的提取方法有沉淀法、全膜法和离子交换法。沉淀法
是根据沉淀剂与L-缬氨酸的特异性结合形成沉淀,然后分离提取,该方法具有收率高、操作
简便等优点,但存在环境污染高的技术问题;全膜法虽?#29615;?#27700;量少,但膜滤法只能去除大量
的无机盐离子及大分子的杂蛋白,发酵液中存在的与L-缬氨酸性质相近的氨基酸无法根
除,得到的L-缬氨酸杂质偏高;离子交换法是将除去菌体的发酵液调pH为酸性,用强酸性阳
离子交换树脂分离L-缬氨酸和杂质氨基酸,最后通过氨水洗脱分离出L-缬氨酸。若提高L-
缬氨酸纯度,需采用多级离子交换柱串联提取,这将导致生产过程中生产废水量?#27927;螅?#19988;采
用离子交换法提取收率?#27493;?#20302;。


CN105274182A公开了一种从发酵液中高效提取L-缬氨酸的工艺,包括如下步骤:
1)发酵:将乳酸发酵短?#21496;鶤TCC13869种子液,谷氨酸棒?#21496;鶤TCC21670种子液以及枯草芽
孢?#21496;鶤TCC21616种子液按照2∶1∶1的体积比混合,然后接入到发酵培养基中,连续发酵60
小时,得到发酵液;2)微滤膜过滤:发酵液采用微滤膜过滤,收集滤过液和截留物;所述微滤
膜截留分子量5000MV;3)蒸发浓缩:将步骤2)的滤过液进行蒸发浓缩,浓缩至原料液体积的
三?#31181;?#19968;,收集浓缩液;4)结晶:将步骤3)的浓缩液进行结晶,得到L-缬氨酸粗品;5)溶解:
往步骤4)的L-缬氨酸粗品加入去离子水重新溶解得到L-缬氨酸溶液,加水量为?#21046;分?#37327;的
40%-120%;6)离子交换:将步骤5)的L-缬氨酸溶液调pH至4.5,温度20-25℃,强酸离子交
换树脂进行离子交换,再用质量数为2%的稀氨水解析,收集流出液;7)超滤膜过滤:将步骤
6)所得流出液进行超滤膜过滤,截留分子量800MW,收集滤液;8)真空浓缩:将步骤7)所述滤
液加到四效蒸发器中进行真空浓缩,浓缩至滤液体积的八?#31181;?#19968;;9)离心烘干:将步骤8)所
得浓缩液进行冷却结晶,离心、烘干制得L-缬氨酸成品。


CN108285912公开了一种发酵制备提取医药级缬氨酸的方法,其包括:步骤1)发酵
工序:(1)将乳酸发酵短?#21496;?#25353;照6-8%的接种量接入发酵培养基中,连续发酵50-55小时,
得到缬氨酸发酵液;发酵过程中的温度控制在30℃,pH控制在6.5,控?#30772;?#33796;糖浓度不低于
10g/L;(2)利用陶瓷膜过滤缬氨酸发酵液得到滤液A和湿菌体;往湿菌体中添加1-3wt%电
气石粉,100rpm搅拌30min,然后停止搅拌,加热至50-55℃,保温60-90s,自然冷?#31895;?#23460;温,
然后添加到三倍重量的透析培养基中,温度控制在30℃,100rpm搅拌培养4-6h,陶瓷膜过滤
收集菌体和滤液B;步骤2)超滤和浓缩制备缬氨酸粗品:合并步骤1)所得滤液A和滤液B,通
过超滤膜进行超滤,收集超滤液,将超滤?#21644;?#36807;真空浓缩至缬氨酸含量为30wt%,降温结
晶,离心得到缬氨酸粗品;步骤3)酸溶、结晶以及离?#27169;?#37319;用1.0-1.5倍体积的7mol/L盐酸对
缬氨酸?#21046;方?#34892;一次酸溶,再经降温结晶、离?#27169;?#33719;得缬氨酸固体A和母液;采用0.5-0.8倍
体积的1mol/L盐酸对缬氨酸固体A进行二次酸溶,再经降温结晶、离?#27169;?#20877;次获得缬氨酸固
体B和母液;步骤4)水溶、离子交换、脱色、精滤以及结晶:采用8-10倍体积的蒸馏水对缬氨
酸固体B进行水溶后,经离子交换、脱色、精滤、结晶获得医药级缬氨酸。但是,由于缬氨酸在
?#20811;?#20013;的溶解?#20154;?#28201;度变化不大,本发明采用降温结晶时,在结晶终了?#27604;?#26377;大量溶质溶
于溶剂中,导致结晶产品收率?#20572;?#20174;而导致缬氨酸产品的收率较低。


目前,我国以微生物发酵法生产L-缬氨酸的技术尚不成熟,菌种选择和培育条件
不合理,导致发酵周期长,转化率和产酸偏?#20572;?#21516;时现有的分离纯化技术落后,结晶过程中
仍有大量溶质溶解于溶剂中,导致结晶产品收率?#20572;?#22823;大影响了L-缬氨酸的产量,导致我国
国产L-缬氨酸的市场竞争力差,无法实现规模化生产。


发明内容


本发明的目的是针对现有技术的不足,提供了一种L-缬氨酸的生产方法,从发酵
和分离纯化两个方面进行优化,在增加L-缬氨酸产量的同时,提高了L-缬氨酸的收率和产
?#20998;?#37327;,为L-缬氨酸的国产化提供技术支持。


为了实现上述目的,本发明采用以下技术方案:


一种L-缬氨酸的生产方法,包括以下步骤:


S1、发酵工序:


将?#26149;?#33740;种黄色短?#21496;鶫L41(CICC10135)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)
DLPU-IL
-和黄色短?#21496;鶭HV2-58接入发酵培养基中,连续发酵,得到缬氨酸发酵液;


S2、过滤:


向步骤S1得到的缬氨酸发酵液中加入β-环?#26149;?#31934;,搅拌溶解后,利用陶瓷膜过滤,
得到滤液和湿菌体;


S3、超滤、浓缩、结晶:


将步骤S2得到的滤液进行超滤,得到超滤液;将得到的超滤液进行蒸发浓缩,得到
浓缩液;向得到的浓缩液中加入溶析剂和晶粒进行结晶,抽滤干燥,得到缬氨酸粗品;


S4、水溶、离子交换、脱色、精滤以及结晶:


将步骤S3得到的缬氨酸粗品溶于蒸馏水中,经离子交换纯化、脱色、精滤、结晶获
?#37238;?#32431;度缬氨酸。


优选地,步骤S1中?#26149;?#33740;种的接种量为4.0-6.0%。


优选地,步骤S1中所述?#26149;?#33740;种中黄色短?#21496;鶫L41(CICC10135)、热带假丝酵母
(Candida tropicalis)DLPU-IL
-和黄色短?#21496;鶭HV 2-58的质量比为3:1:1.5。


优选地,步骤S1中所述发酵培养基的组分包括?#28009;?#33796;糖10-15g/L、海藻粉1-5g/L、
玉米浆5-10g/L,硫酸铵15-35g/L,七水硫酸镁0.1-0.5g/L和磷酸二氢钾0.5-1.2g/L,灭菌
前pH为6.8-7.0。


优选地,步骤S1中所述发酵的条件为,发酵温度为32±2℃,压力为0.103MPa,发酵
时间为40-50h。


优选地,步骤S1中所述发酵采用间歇式曝气,控制培养基中的溶解氧含量,具体
为:


(1)利用罗茨鼓风机曝气2h,使发酵培养基中的氧溶解饱和度控制在50-60%;


(2)关闭罗茨鼓风机,停止曝气,监测培养液中的溶解氧;


(3)当培养基中的氧溶解饱和度降至0时,重复步骤(1)-(2)。


进一?#25509;?#36873;地,步骤(2)中停止曝气的时间为20-90min。


优选地,步骤S2中缬氨酸发酵液与β-环?#26149;?#31934;的质量比为100:3-6。


优选地,步骤S3中浓缩液与原超滤液的体积比为1:3-4。


优选地,步骤S3中所述的结晶为:在20-50min内,以1-10mL/min的速率向20-30℃
的浓缩液中加入溶洗剂,同时加入晶粒,搅拌,析出晶体。


进一?#25509;?#36873;地,所述的溶洗剂为?#29366;肌?#20057;醇、丙酮和丙三醇中的至少两种;更进一
?#25509;?#36873;地为体积比2:1的丙三醇和乙醇的混合液。


进一?#25509;?#36873;地,所述的晶粒为10-30μm的L-缬氨酸。


更进一?#25509;?#36873;地,所述浓缩液和L-缬氨酸的质量比为500-1000:1。


优选地,步骤S4中缬氨酸粗品与蒸馏水的质量比为1:3-5。


本发明的有益效果为:


(1)本发明从发酵和分离纯化两个方面进行优化,缩短了发酵周期,增加L-缬氨酸
的含量,同时提高了L-缬氨酸的收率,提升了产?#20998;?#37327;,为我国L-缬氨酸产业化发?#22266;?#20379;了
技术支持;


(2)本发明通过不同菌种的复配、培养基的优化和溶解氧的控制,提高了L-缬氨酸
的转化率,缩短了发酵周期,减少了杂氨基酸的产生;同时通过发酵过程中的间歇式曝气,
使菌种处于好氧和微氧的状态,促进了缬氨酸的生成,提高了缬氨酸的转化率,同时有效避
免了发酵过程中泡沫的产生。


(3)本发明的分离纯化过程简单,相对成?#38236;停?#21516;时,通过改进结晶工艺,避免?#31169;?br>温结晶中缬氨酸在溶剂中的残留,提高了缬氨酸产品的收率。


具体实施方式


本发明提供了一种L-缬氨酸的生产方法,包括以下步骤:


S1、发酵工序:


将?#26149;?#33740;种黄色短?#21496;鶫L41(CICC10135)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)
DLPU-IL
-和黄色短?#21496;鶭HV2-58接入发酵培养基中,连续发酵,得到缬氨酸发酵液;


S2、过滤:


向步骤S1得到的缬氨酸发酵液中加入β-环?#26149;?#31934;,搅拌溶解后,利用陶瓷膜过滤,
得到滤液和湿菌体;


S3、超滤、浓缩、结晶:


将步骤S2得到的滤液进行超滤,得到超滤液;将得到的超滤液进行蒸发浓缩,得到
浓缩液;向得到的浓缩液中加入溶析剂和晶粒进行结晶,抽滤干燥,得到缬氨酸粗品;


S4、水溶、离子交换、脱色、精滤以及结晶:


将步骤S3得到的缬氨酸粗品,溶于蒸馏水中,经离子交换纯化、脱色、精滤、结晶获
?#37238;?#32431;度缬氨酸。


本发明?#36816;?#26377;原料的来源并没有特殊的限制,为市售?#32431;傘?br>

所述?#26149;?#33740;种为黄色短?#21496;鶫L41(CICC10135)、热带假丝酵母(Candida
tropicalis)DLPU-IL
-和黄色短?#21496;鶭HV2-58,优选地,所述黄色短?#21496;鶫L41(CICC10135)、
热带假丝酵母(Candida tropicalis)DLPU-IL
-和黄色短?#21496;鶭HV 2-58的质量比为3:1:
1.5。所述的?#26149;?#33740;种的接入方法为本领域技术人员熟知的接种方法,并无特殊的限制,所
述?#26149;?#33740;种的接种量优选为4.0-6.0%。本发明利用三种菌种的复配,在提高发酵产酸能力
的同时,提高了发酵液中L-缬氨酸的纯度,有利于高纯度L-缬氨酸产品的生产。


所述的发酵培养基包括10-15g/L葡萄糖、1-5g/L海藻粉、5-10g/L玉米浆、15-35g/
L硫酸铵、0.1-0.5g/L七水硫酸镁和0.5-1.2g/L磷酸二氢钾,灭菌前pH为6.8-7.0,更优选包
括11-14g/L葡萄糖、1.5-4.5g/L海藻粉、5.5-9g/L玉米浆、14-34g/L硫酸铵、0.15-0.45g/L
七水硫酸镁和0.55-1.1g/L磷酸二氢钾,灭菌前pH为6.8-7.0,再优选包括11.5-13.5g/L葡
萄糖、1.6-4.4g/L海藻粉、5.6-8.5g/L玉米浆、14.5-33g/L硫酸铵、0.16-0.44g/L七水硫酸
镁和0.56-1.0g/L磷酸二氢钾,灭菌前pH为6.8-7.0,最优选包括12.5g/L葡萄糖、2.8g/L海
藻粉、8.4g/L玉米浆、16.8g/L硫酸铵、0.32g/L七水硫酸镁和0.76g/L磷酸二氢钾,灭菌前pH
为6.8-7.0。以上所述的原料均为本领域技术人员熟知的原料,并无特殊限制。


所述的发酵采用本领域技术人员熟知的方法?#32431;桑?#24182;无特殊限制,本发明中所述
发酵的温度优选为30-34℃,更优选为30.5-33.5℃,再优选为30.8-33.2℃,所述发酵的压
力为0.103MPa,所述发酵的时间优选为40-50h,更优选为41-49h,再优选为42-48h,最优选
为44h。


所述发酵过程中采用间歇式曝气,控制培养基中的溶解氧含量,具体为:


(1)利用罗茨鼓风机曝气2h,使发酵培养基中的氧溶解饱和度控制在50-60%;


(2)关闭罗茨鼓风机,停止曝气,监测培养液中的溶解氧;


(3)当培养基中的氧溶解饱和度降至0时,重复步骤(1)-(2)。


本发明通过对?#26149;?#33740;种培养基和发酵工艺进行了优化,提高了?#26149;?#33740;种发酵产
量,缩短了发酵周期,同时通过发酵过程中的间歇式曝气,使菌种处于好氧和微氧的状态,
促进了缬氨酸的生成,减少了杂氨基酸的产生,提高了缬氨酸的转化率,同时有效避免了发
酵过程中泡沫的产生。


本发明所述的过滤采用本领域技术人员公知的陶瓷膜过滤?#32431;桑?#24182;无特殊限制,
在过滤前缬氨酸发酵液中加入β-环?#26149;?#31934;,优选地缬氨酸发酵液与β-环?#26149;?#31934;的质量比为
100:3-6;更优选为100:3.2-5.5;再优选为100:3.5-5.0;最优选为100:4.2。


本发明所述的超滤、浓缩和结晶采用本领域技术人员公知的技术?#32431;桑?#24182;无特殊
限制,本发明所述的结晶优选条件为:20-50min内,以1-10mL/min的速率向20-30℃的浓缩
液中加入溶洗剂,同时加入晶粒,搅拌,析出晶体。所述的溶析剂优选为?#29366;肌?#20057;醇、丙酮和
丙三醇中的至少一种,更优选为丙三醇和乙醇;所述丙三醇和乙醇的体积比优选为2:1;所
述晶粒优选为L-缬氨酸,所述L-缬氨酸的粒径优选为10-30μm,更优选为12-28μm,再优选为
14-26μm,最优选为18μm;所述浓缩液和L-缬氨酸的质量比优选为为500-1000:1;更优选为
550-950:1,再优选为580-920:1,最优选为678:1。本发明在结晶过程中添加溶析剂和晶粒,
使析出的晶体粒径更加均匀,避免?#31169;?#28201;结晶中缬氨酸在溶剂中的残留,可以有效提高缬
氨酸产品的收率。


本发明所述的水溶、离子交换、脱色、精滤以及结晶均采用本领域技术人员公知的
技术?#32431;桑?#24182;无特殊限制,本发明所述步骤S4中缬氨酸粗品与蒸馏水的质量比优选为1:3-
5;更优选为1:3.2-4.8,再优选为1:3.4-4.6,最优选为1:5.3。


为?#31169;?#19968;步说明本发明,以下结合实施例对本发明提供的一种L-缬氨酸的生产方
法进行详?#35813;?#36848;。


以下实施例中所用的试剂均为市售。


实施例1


一种L-缬氨酸的生产方法,包括以下步骤:


S1、发酵工序:


将质量比为3:1:1.5的黄色短?#21496;鶫L41(CICC10135)、热带假丝酵母(Candida
tropicalis)DLPU-IL
-和黄色短?#21496;鶭HV2-58?#26149;?#33740;种按4.0%接入发酵培养基中,连续发
酵,得到缬氨酸发酵液;


所述的发酵培养基包括10g/L葡萄糖、1g/L海藻粉、5g/L玉米浆、15g/L硫酸铵、
0.1g/L七水硫酸镁和0.5g/L磷酸二氢钾,灭菌前pH为6.8;所述发酵的温度为30℃,所述发
酵的压力为0.103MPa,所述发酵的时间为40h;


所述发酵过程中采用间歇式曝气,控制培养基中的溶解氧含量,具体为:


(1)利用罗茨鼓风机曝气2h,使发酵培养基中的氧溶解饱和度控制在50-60%;


(2)关闭罗茨鼓风机,停止曝气,监测培养液中的溶解氧;


(3)当培养基中的氧溶解饱和度降至0时,重复步骤(1)-(2);


S2、过滤:


按100:3的质量比,向步骤S1得到的缬氨酸发酵液中加入β-环?#26149;?#31934;,搅拌溶解
后,利用陶瓷膜过滤,得到滤液和湿菌体;


S3、超滤、浓缩、结晶:


将步骤S2得到的滤液进行超滤,得到超滤液;将得到的超滤液蒸发浓缩至原超滤
液体积的1/3,得到浓缩液;向得到的浓缩液中加入溶析剂和L-缬氨酸进行结晶,抽滤干燥,
得到缬氨酸粗品;


所述的结晶条件为:20min内,以10mL/min的速率向20℃的浓缩液中加入溶洗剂,
同时加入L-缬氨酸作为晶粒,搅拌,析出晶体。所述的溶析剂为体积比为2:1的丙三醇和乙
醇;所述L-缬氨酸的粒径为10μm,所述浓缩液和L-缬氨酸的质量比为500:1;


S4、水溶、离子交换、脱色、精滤以及结晶:


按1:3的质量比,将步骤S3得到的缬氨酸粗品溶解于蒸馏水中,经离子交换纯化、
脱色、精滤、结晶获?#37238;?#32431;度缬氨酸。


发酵液中L-缬氨酸的含量为9.0%,糖转化率为46.5%,得到L-缬氨酸成品的纯度
为99.92%,收率为78.5%。


实施例2


一种L-缬氨酸的生产方法,包括以下步骤:


S1、发酵工序:


将质量比为3:1:1.5的黄色短?#21496;鶫L41(CICC10135)、热带假丝酵母(Candida
tropicalis)DLPU-IL
-和黄色短?#21496;鶭HV2-58?#26149;?#33740;种按6.0%接入发酵培养基中,连续发
酵,得到缬氨酸发酵液;


所述的发酵培养基包括15g/L葡萄糖、5g/L海藻粉、10g/L玉米浆、35g/L硫酸铵、
0.5g/L七水硫酸镁和1.2g/L磷酸二氢钾,灭菌前pH为7.0;所述发酵的温度为34℃,所述发
酵的压力为0.103MPa,所述发酵的时间为50h;


所述发酵过程中采用间歇式曝气,控制培养基中的溶解氧含量,具体为:


(1)利用罗茨鼓风机曝气2h,使发酵培养基中的氧溶解饱和度控制在50-60%;


(2)关闭罗茨鼓风机,停止曝气,监测培养液中的溶解氧;


(3)当培养基中的氧溶解饱和度降至0时,重复步骤(1)-(2);


S2、过滤:


按100:6的质量比,向步骤S1得到的缬氨酸发酵液中加入β-环?#26149;?#31934;,搅拌溶解
后,利用陶瓷膜过滤,得到滤液和湿菌体;


S3、超滤、浓缩、结晶:


将步骤S2得到的滤液进行超滤,得到超滤液;将得到的超滤液蒸发浓缩至原超滤
液体积的1/4,得到浓缩液;向得到的浓缩液中加入溶析剂和L-缬氨酸进行结晶,抽滤干燥,
得到缬氨酸粗品;


所述的结晶条件为:50min内,以1mL/min的速率向30℃的浓缩液中加入溶洗剂,同
时加入L-缬氨酸作为晶粒,搅拌,析出晶体。所述的溶析剂为体积比为2:1的丙三醇和乙醇;
所述L-缬氨酸的粒径为30μm,所述浓缩液和L-缬氨酸的质量比为1000:1;


S4、水溶、离子交换、脱色、精滤以及结晶:


按1:5的质量比,将步骤S3得到的缬氨酸粗品,溶解于蒸馏水中,经离子交换纯化、
脱色、精滤、结晶获?#37238;?#32431;度缬氨酸。


发酵液中L-缬氨酸的含量为9.2%,糖转化率为47.8%,得到L-缬氨酸成品的纯度
为99.90%,收率为79.5%。


实施例3


一种L-缬氨酸的生产方法,包括以下步骤:


S1、发酵工序:


将质量比为3:1:1.5的黄色短?#21496;鶫L41(CICC10135)、热带假丝酵母(Candida
tropicalis)DLPU-IL
-和黄色短?#21496;鶭HV2-58?#26149;?#33740;种按4.5%接入发酵培养基中,连续发
酵,得到缬氨酸发酵液;


所述的发酵培养基包括11g/L葡萄糖、1.5g/L海藻粉、5.5g/L玉米浆、14g/L硫酸
铵、0.15g/L七水硫酸镁和0.55g/L磷酸二氢钾,灭菌前pH为6.9;所述发酵的温度为33.5℃,
所述发酵的压力为0.103MPa,所述发酵的时间为41h;


所述发酵过程中采用间歇式曝气,控制培养基中的溶解氧含量,具体为:


(1)利用罗茨鼓风机曝气2h,使发酵培养基中的氧溶解饱和度控制在50-60%;


(2)关闭罗茨鼓风机,停止曝气,监测培养液中的溶解氧;


(3)当培养基中的氧溶解饱和度降至0时,重复步骤(1)-(2);


S2、过滤:


按100:3.2的质量比,向步骤S1得到的缬氨酸发酵液中加入β-环?#26149;?#31934;,搅拌溶解
后,利用陶瓷膜过滤,得到滤液和湿菌体;


S3、超滤、浓缩、结晶:


将步骤S2得到的滤液进行超滤,得到超滤液;将得到的超滤液蒸发浓缩至原超滤
液体积的1/3,得到浓缩液;向得到的浓缩液中加入溶析剂和L-缬氨酸进行结晶,抽滤干燥,
得到缬氨酸粗品;


所述的结晶条件为:25min内,以8mL/min的速率向25℃的浓缩液中加入溶洗剂,同
时加入L-缬氨酸作为晶粒,搅拌,析出晶体。所述的溶析剂为体积比为2:1的丙三醇和乙醇;
所述L-缬氨酸的粒径为12μm,所述浓缩液和L-缬氨酸的质量比为550:1;


S4、水溶、离子交换、脱色、精滤以及结晶:


按1:3.2的质量比,将步骤S3得到的缬氨酸粗品,溶解于蒸馏水中,经离子交换纯
化、脱色、精滤、结晶获?#37238;?#32431;度缬氨酸。


发酵液中L-缬氨酸的含量为9.5%,糖转化率为48.5%,得到L-缬氨酸产品的纯度
为99.95%,收率为80.1%。


实施例4


一种L-缬氨酸的生产方法,包括以下步骤:


S1、发酵工序:


将质量比为3:1:1.5的黄色短?#21496;鶫L41(CICC10135)、热带假丝酵母(Candida
tropicalis)DLPU-IL
-和黄色短?#21496;鶭HV2-58?#26149;?#33740;种按5.8%接入发酵培养基中,连续发
酵,得到缬氨酸发酵液;


所述的发酵培养基包括14g/L葡萄糖、5.5g/L海藻粉、9g/L玉米浆、34g/L硫酸铵、
0.45g/L七水硫酸镁和1.1g/L磷酸二氢钾,灭菌前pH为7.0;所述发酵的温度为30.5℃,所述
发酵的压力为0.103MPa,所述发酵的时间为49h;


所述发酵过程中采用间歇式曝气,控制培养基中的溶解氧含量,具体为:


(1)利用罗茨鼓风机曝气2h,使发酵培养基中的氧溶解饱和度控制在50-60%;


(2)关闭罗茨鼓风机,停止曝气,监测培养液中的溶解氧;


(3)当培养基中的氧溶解饱和度降至0时,重复步骤(1)-(2);


S2、过滤:


按100:5.5的质量比,向步骤S1得到的缬氨酸发酵液中加入β-环?#26149;?#31934;,搅拌溶解
后,利用陶瓷膜过滤,得到滤液和湿菌体;


S3、超滤、浓缩、结晶:


将步骤S2得到的滤液进行超滤,得到超滤液;将得到的超滤液蒸发浓缩至原超滤
液体积的1/4,得到浓缩液;向得到的浓缩液中加入溶析剂和L-缬氨酸进行结晶,抽滤干燥,
得到缬氨酸粗品;


所述的结晶条件为:45min内,以3mL/min的速率向28℃的浓缩液中加入溶洗剂,同
时加入L-缬氨酸作为晶粒,搅拌,析出晶体。所述的溶析剂为体积比为2:1的丙三醇和乙醇;
所述L-缬氨酸的粒径为28μm,所述浓缩液和L-缬氨酸的质量比为950:1;


S4、水溶、离子交换、脱色、精滤以及结晶:


按1:4.8的质量比,将步骤S3得到的缬氨酸粗品溶解于蒸馏水中,经离子交换纯
化、脱色、精滤、结晶获?#37238;?#32431;度缬氨酸。


发酵液中L-缬氨酸的含量为9.7%,糖转化率为48.7%,得到L-缬氨酸成品的纯度
为99.94%,收率为85.1%。


实施例5


一种L-缬氨酸的生产方法,包括以下步骤:


S1、发酵工序:


将质量比为3:1:1.5的黄色短?#21496;鶫L41(CICC10135)、热带假丝酵母(Candida
tropicalis)DLPU-IL
-和黄色短?#21496;鶭HV2-58?#26149;?#33740;种按5.5%接入发酵培养基中,连续发
酵,得到缬氨酸发酵液;


所述的发酵培养基包括11.5g/L葡萄糖、1.6g/L海藻粉、5.6g/L玉米浆、14.5g/L硫
酸铵、0.16g/L七水硫酸镁和0.56g/L磷酸二氢钾,灭菌前pH为6.8所述发酵的温度为30.8
℃,所述发酵的压力为0.103MPa,所述发酵的时间为42h;


所述发酵过程中采用间歇式曝气,控制培养基中的溶解氧含量,具体为:


(1)利用罗茨鼓风机曝气2h,使发酵培养基中的氧溶解饱和度控制在50-60%;


(2)关闭罗茨鼓风机,停止曝气,监测培养液中的溶解氧;


(3)当培养基中的氧溶解饱和度降至0时,重复步骤(1)-(2);


S2、过滤:


按100:3.5的质量比,向步骤S1得到的缬氨酸发酵液中加入β-环?#26149;?#31934;,搅拌溶解
后,利用陶瓷膜过滤,得到滤液和湿菌体;


S3、超滤、浓缩、结晶:


将步骤S2得到的滤液进行超滤,得到超滤液;将得到的超滤液蒸发浓缩至原超滤
液体积的1/3,得到浓缩液;向得到的浓缩液中加入溶析剂和L-缬氨酸进行结晶,抽滤干燥,
得到缬氨酸粗品;


所述的结晶条件为:27min内,以6.5mL/min的速率向24℃的浓缩液中加入溶洗剂,
同时加入L-缬氨酸作为晶粒,搅拌,析出晶体。所述的溶析剂为体积比为2:1的丙三醇和乙
醇;所述L-缬氨酸的粒径为14μm,所述浓缩液和L-缬氨酸的质量比为580:1;


S4、水溶、离子交换、脱色、精滤以及结晶:


按1:3.4的质量比,将步骤S3得到的缬氨酸粗品溶解于蒸馏水中,经离子交换纯
化、脱色、精滤、结晶获?#37238;?#32431;度缬氨酸。


发酵液中L-缬氨酸的含量为9.8%,糖转化率为48.9%,得到L-缬氨酸成品的纯度
为99.93%,收率为86.5%。


实施例6


一种L-缬氨酸的生产方法,包括以下步骤:


S1、发酵工序:


将质量比为3:1:1.5的黄色短?#21496;鶫L41(CICC10135)、热带假丝酵母(Candida
tropicalis)DLPU-IL
-和黄色短?#21496;鶭HV2-58?#26149;?#33740;种按4.4%接入发酵培养基中,连续发
酵,得到缬氨酸发酵液;


所述的发酵培养基包括13.5g/L葡萄糖、4.4g/L海藻粉、8.5g/L玉米浆、33g/L硫酸
铵、0.44g/L七水硫酸镁和1.0g/L磷酸二氢钾,灭菌前pH为6.9,所述发酵的温度为33.2℃,
所述发酵的压力为0.103MPa,所述发酵的时间为48h;


所述发酵过程中采用间歇式曝气,控制培养基中的溶解氧含量,具体为:


(1)利用罗茨鼓风机曝气2h,使发酵培养基中的氧溶解饱和度控制在50-60%;


(2)关闭罗茨鼓风机,停止曝气,监测培养液中的溶解氧;


(3)当培养基中的氧溶解饱和度降至0时,重复步骤(1)-(2);


S2、过滤:


按100:5.0的质量比,向步骤S1得到的缬氨酸发酵液中加入β-环?#26149;?#31934;,搅拌溶解
后,利用陶瓷膜过滤,得到滤液和湿菌体;


S3、超滤、浓缩、结晶:


将步骤S2得到的滤液进行超滤,得到超滤液;将得到的超滤液蒸发浓缩至原超滤
液体积的1/4,得到浓缩液;向得到的浓缩液中加入溶析剂和L-缬氨酸进行结晶,抽滤干燥,
得到缬氨酸粗品;


所述的结晶条件为:43min内,以4.7mL/min的速率向28℃的浓缩液中加入溶洗剂,
同时加入L-缬氨酸作为晶粒,搅拌,析出晶体。所述的溶析剂为体积比为2:1的丙三醇和乙
醇;所述L-缬氨酸的粒径为26μm,所述浓缩液和L-缬氨酸的质量比为920:1;


S4、水溶、离子交换、脱色、精滤以及结晶:


按1:4.6的质量比,将步骤S3得到的缬氨酸粗品溶解于蒸馏水中,经离子交换纯
化、脱色、精滤、结晶获?#37238;?#32431;度缬氨酸。


发酵液中L-缬氨酸的含量为9.9%,糖转化率为49.2%,得到L-缬氨酸产品的纯度
为99.96%,收率为89.8%。


实施例7


一种L-缬氨酸的生产方法,包括以下步骤:


S1、发酵工序:


将质量比为3:1:1.5的黄色短?#21496;鶫L41(CICC10135)、热带假丝酵母(Candida
tropicalis)DLPU-IL
-和黄色短?#21496;鶭HV2-58?#26149;?#33740;种按5.1%接入发酵培养基中,连续发
酵,得到缬氨酸发酵液;


所述的发酵培养基包括12.5g/L葡萄糖、2.8g/L海藻粉、8.4g/L玉米浆、16.8g/L硫
酸铵、0.32g/L七水硫酸镁和0.75g/L磷酸二氢钾,灭菌前pH为7.0,所述发酵的温度为32.5
℃,所述发酵的压力为0.103MPa,所述发酵的时间为44h;


所述发酵过程中采用间歇式曝气,控制培养基中的溶解氧含量,具体为:


(1)利用罗茨鼓风机曝气2h,使发酵培养基中的氧溶解饱和度控制在50-60%;


(2)关闭罗茨鼓风机,停止曝气,监测培养液中的溶解氧;


(3)当培养基中的氧溶解饱和度降至0时,重复步骤(1)-(2);


S2、过滤:


按100:4.0的质量比,向步骤S1得到的缬氨酸发酵液中加入β-环?#26149;?#31934;,搅拌溶解
后,利用陶瓷膜过滤,得到滤液和湿菌体;


S3、超滤、浓缩、结晶:


将步骤S2得到的滤液进行超滤,得到超滤液;将得到的超滤液蒸发浓缩至原超滤
液体积的1/4,得到浓缩液;向得到的浓缩液中加入溶析剂和L-缬氨酸进行结晶,抽滤干燥,
得到缬氨酸粗品;


所述的结晶条件为:38min内,以5.3mL/min的速率向26℃的浓缩液中加入溶洗剂,
同时加入L-缬氨酸作为晶粒,搅拌,析出晶体。所述的溶析剂为体积比为2:1的丙三醇和乙
醇;所述L-缬氨酸的粒径为18μm,所述浓缩液和L-缬氨酸的质量比为678:1;


S4、水溶、离子交换、脱色、精滤以及结晶:


按1:5.3的质量比,将步骤S3得到的缬氨酸粗品溶解于蒸馏水中,经离子交换纯
化、脱色、精滤、结晶获?#37238;?#32431;度缬氨酸。


发酵液中L-缬氨酸的含量为10.5%,糖转化率为49.9%,得到L-缬氨酸成品的纯
度为99.97%,收率为95.7%。


对比例1


本对比例与实施例7的不同之处在于:发酵培养基中的海藻粉被替换为大豆饼粉。


发酵液中L-缬氨酸的含量为6.5%,糖转化率为28.0%,得到L-缬氨酸成品的纯度
为99.90%,收率为66.5%。


对比例2


本对比例与实施例7的不同之处在于:所述发酵过程中采用分阶段供氧控制溶氧:
0-18h为20%,18h以后为5-10%。


发酵液中L-缬氨酸的含量为6.8%,糖转化率为26.7%,得到L-缬氨酸成品的纯度
为99.85%,收率为65.8%。


对比例3


本对比例与实施例7的不同之处在于:步骤S2中不添加β-环?#26149;?#31934;。


发酵液中L-缬氨酸的含量为10.3%,糖转化率为49.5%,得到L-缬氨酸成品的纯
度为96.95%,收率为66.7%。


对比例4


本对比例与实施例7的不同之处在于:步骤S3中结晶过程中晶粒L-缬氨酸的粒径
为8μm,浓缩液与L-缬氨酸的质量比为450:1。


发酵液中L-缬氨酸的含量为10.6%,糖转化率为49.8%,得到L-缬氨酸成品的纯
度为96.22%,收率为65.2%。


对比例5


本对比例与实施例7的不同之处在于:步骤S3中结晶过程中溶析剂为乙醇。


发酵液中L-缬氨酸的含量为10.7%,糖转化率为50.0%,得到L-缬氨酸的纯度为
95.98%,收率为62.9%。


对比例6


本对比例与实施例7的不同之处在于:步骤S3中结晶过程中溶析剂为丙三醇。


发酵液中L-缬氨酸的含量为10.3%,糖转化率为49.8%,得到L-缬氨酸成品的纯
度为96.12%,收率为61.5%。


对比例7


本对比例与实施例7的不同之处在于:将实施例7获得的发酵液采用CN108285912
实施例2的工艺进行分离提纯,制得L-缬氨酸。


发酵液中L-缬氨酸的含量为10.4%,糖转化率为49.5%,得到L-缬氨酸成品的纯
度为99.87%,收率为63.2%。


以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护?#27573;?#24182;不局限于此,
任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术?#27573;?#20869;,根据本发明的技术方案及其
发明构思加以等同替换或改变,?#21152;?#28085;盖在本发明的保护?#27573;?#20043;内。


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