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一种获得高生物产量的羌活细胞培养方法.pdf

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一种 获得 生物 产量 羌活 细胞培养 方法
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摘要
申请专利号:

CN201910027791

申请日:

20190111

公开号:

CN109652360A

公开日:

20190419

当前法律状态:

公开

有效性:

审中

法?#19978;?#24773;: 公开
IPC分类号: C12N5/04 主分类号: C12N5/04
申请人: 成都大学
发明人: 王跃华;屈锡梅;陈芳;马涛;任倩;史斯予;王一品;陈诚;陈勤科;贾宇航;张婕萱;冯玉柯;张晓捷;付雪玲;陈泓杉;王盼
地址: 610106 四川省成都市外东十陵镇
优先权:
专利代理机构: 51101 代理人: 余丽生
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法律状态
申请(专利)号:

CN201910027791

授权公告号:

法律状态公告日:

20190419

法律状态类型:

公开

摘要

本发明公开了一种获得高生物产量的羌活细胞培养方法,该方法包括如下步骤:羌活丛生芽诱导→愈伤组织的诱导培养→羌活细胞的悬浮培养→细胞的继代培养。本发明可实现大规模快速生产出有效成分含量高的羌活细胞培养物,从而有效解决当前羌活植物资源和药材资源短缺的问题。

权利要求书

1.一种获得高生物产量的羌活细胞培养方法,其特征在于包括如下步骤: (1)羌活丛生芽诱导:选取羌活植物根茎上生长的健康、无病虫害的不定芽作为外植体,将其进行消毒处理后接种到丛生芽诱导培养基1/2MS+ZT2.0~5.0mg/L+NAA 0.2~0.5mg/L+LH300~600mg/L+琼脂6.8g/L中,在培养温度20~25℃、每天光照10~15h、光照强度1000~1500lx条件下进行丛生芽诱导培养; (2)愈伤组织的诱导培养:取丛生芽2个为一组接入愈伤组织诱导培养基B5+2,4-D 1.0~3.0mg/L+6-BA 0.5~1.0mg/L+IAA 0.5~1.5mg/L+活性炭30~60g/L+琼脂6.8g/L中,在培养温度18~22℃、每天光照4~8h、光照强度500~800lx条件下进行愈伤组织诱导培养; (3)羌活细胞的悬浮培养:选取生长良好、颜色为黄白色且质地疏松的愈伤组织,以20~40g/L的接种量接入羌活细胞悬浮培养基改良MS+6-BA 0.1~0.5mg/L+IAA 1.0~3.0mg/L+NAA 0.5~1.5mg/L+PVP 5.0~15.0g/L+苯丙氨酸200~600μmol/L中,在培养温度20~28℃、每天光照6~10h、光照强度600~1000lx及摇床转数100~140r/min的条件下进行羌活细胞的悬浮培养,所述改良MS是指NH4NO3含量为825mg/L、KNO3含量为950mg/L的MS培养基; (4)细胞的继代培养:羌活细胞悬浮培养20~40天继代一次,接种量、培养基和培养条件与步骤(3)相同; 上述所有培养基的pH值为5.8~6.2、蔗糖25~35g/L。 2.根据权利要求1所述的获得高生物产量的羌活细胞培养方法,其特征在于:步骤(1)中所述消毒处理是指将作为外植体的羌活植物根茎上的不定芽先用浓?#20219;?0%的酒精消毒10~30s,再用浓?#20219;?.1%的升汞消毒4~8min,最后用无菌水冲洗3~5次。

?#24471;?#20070;


一种获得高生物产量的羌活细胞培养方法
技术领域


本发明?#23125;?#19968;种羌活细胞的组织培养方法,特别是?#23125;?#19968;种获得高生物产量的羌
活细胞培养方法。


背景技术


羌活(Notopterygium incisum Ting ex H.T.Chang)为伞形科、羌活属多年生草
?#23616;?#29289;,以根及根茎入药。


羌活具有祛风除湿、解表散寒以及镇痛的功效,通常用于风寒湿引起的?#32440;?#40635;痹、
恶寒引起的发烧发热以及发汗止利等的症状。另外有研究者表明羌活挥发油具有一定的药
理作用,给小鼠口服后,LD
50为6.64mL/kg,进行腹腔注射和灌胃后,均能起到镇痛的作用,同
时对二甲苯耳水肿及右旋糖酐足肿胀起到?#31181;?#30340;作用,能明显?#26723;?#33268;热性大鼠的体温,缓
解醋酸引起的小鼠扭体?#20174;Γ?#21516;时能一定程度上?#31181;?#23567;鼠?#20521;?#21457;育的变态?#20174;Α?#29616;代药理
研究还表明,羌活氯仿提取物中的部分呋喃香豆素类化合物对小鼠小?#36816;?#27597;细胞瘤(MB39)
的生物活?#36291;?#26377;?#31181;?#20316;用,且能够?#31181;芀lotho基因表达水平的下降,?#26723;?#34928;老引起的疾病
的发生;羌活乙醇?#32487;?#21462;物不仅能够?#31181;?#20154;肺癌细胞和人红白血病K526的增?#24120;?#23545;心脑血
管疾病也具有一定的作用。羌活多糖提取物对·OH自由基有较理想的清除能力,多糖作为
一类生物大分子,能够提供生物所需的能量,此外多糖还有特殊的生物活性和药理特性,用
于抗肿瘤、?#20849;?#27602;、抗衰老等研究。


与羌活广泛的应用形成鲜明的对比,羌活资源十分有限,这?#19988;?#20026;羌活植物的生
长发育对环境有极为特殊的要求,羌活喜冷凉,喜肥沃,喜弱光,耐寒却不耐旱,多生长在高
山灌木林、草丛及林缘地带,以微酸性或中性的草甸土和山地森林土为佳,地域性较强,在
低海拔温暖气候条件下不易生长。近年来,羌活药材的年需求量迅速增加,羌活资源供应需
求也发生了极大的改变,由之前的供应有余到供应平衡直接转为供不应求,?#36158;?#32652;活药材
的市场价格?#28903;牽?#24182;刺激人们大量采挖野生羌活,使得野生羌活资源日渐减少,濒临灭绝,
目前羌活植物已经?#40644;?#20026;“国家三级濒危保护植物”。因此,目前仅靠羌活有限的野生资源,
是远不能满足市场的需求的,而利用现代组织培养技术快速生产羌活培养物就成为解决这
一问题的重要途径。植物组织培养技术具有生长周期短,繁?#38472;?#39640;、能有效?#26723;?#28798;害性气候
对植物生长的不利影响等优点,可进行周年培养生产。目前对羌活植物的组织培养已开展
了一些研究工作,但还未见有关利用生物技术获得羌活细胞高生物产量的培养方法的报
道。


发明内容


本发明的目的在于提供一种获得高生物产量的羌活细胞培养方法,该方法能实现
羌活细胞的快速增?#24120;?#20197;?#33322;?#24403;前羌活药材资源紧缺的问题。


为达到上述目的,本发明采用的解决方案由如下步骤构成:


(1)羌活丛生芽诱导:选取羌活植物根茎上生长的健康、无病虫害的不定芽作为外
植体,将其进行消毒处理后接种到丛生芽诱导培养基1/2MS+ZT2.0~5.0mg/L+NAA 0.2~
0.5mg/L+LH300~600mg/L+琼脂6.8g/L中,在培养温度20~25℃、每天光照10~15h、光照强
度1000~1500lx条件下进行丛生芽诱导培养;


(2)愈伤组织的诱导培养:取丛生芽2个为一组接入愈伤组织诱导培养基B5+2,4-D
1.0~3.0mg/L+6-BA 0.5~1.0mg/L+IAA 0.5~1.5mg/L+活性炭30~60g/L+琼脂6.8g/L中,
在培养温度18~22℃、每天光照4~8h、光照强度500~800lx条件下进行愈伤组织诱导培
养;


(3)羌活细胞的悬浮培养:选取生长良好、颜色为黄白色且质地疏松的愈伤组织,
以20~40g/L的接种量接入羌活细胞悬浮培养基改良MS+6-BA 0.1~0.5mg/L+IAA 1.0~
3.0mg/L+NAA 0.5~1.5mg/L+PVP 5.0~15.0g/L+苯丙氨酸200~600μmol/L中,在培养温度
20~28℃、每天光照6~10h、光照强度600~1000lx及摇床转数100~140r/min的条件下进
行羌活细胞的悬浮培养,所述改良MS是指NH
4NO
3含量为825mg/L、KNO
3含量为950mg/L的MS培
养基;


(4)细胞的继代培养:羌活细胞每悬浮培养20~40天继代一次,每次的接种量、培
养基和培养条件与步骤(3)相同;


上述所有培养基的pH值为5.8~6.2、蔗糖25~35g/L。


进一步地,步骤(1)中所述消毒处理是指将作为外植体的羌活植物根茎上的不定
芽先用浓?#20219;?0%的酒精消毒10~30s,再用浓?#20219;?.1%的升汞消毒4~8min,最后用无菌
水冲洗3~5次。


本发明通过对羌活细胞进行悬浮培养,可实现大规模快速生产出有效成分含量高
的羌活细胞培养物,从而可有效解决当前羌活植物资源和药材资源短缺的问题。


具体实施方式


实施例1


本实施例提供的获得高生物产量的羌活细胞培养方法包括如下步骤:


(1)羌活丛生芽诱导:选取羌活植物根茎上生长的健康、无病虫害的不定芽作为外
植体,先用浓?#20219;?0%的酒精消毒20s,再用浓?#20219;?.1%的升汞消毒6min,然后用无菌水冲
洗4次后,接种到丛生芽诱导培养基1/2MS+ZT(玉米素)3.0mg/L+NAA 0.4mg/L+LH(水解乳蛋
白)500mg/L+琼脂6.8g/L中,在培养温度22℃、每天光照13h、光照强度1200lx条件下进行丛
生芽诱导培养,培养25天统计,丛生芽的诱导率为89.86%;


(2)愈伤组织的诱导培养:取丛生芽2个为一组接入愈伤组织诱导培养基B5+2,4-D
2.0mg/L+6-BA 0.8mg/L+IAA 1.0mg/L+活性炭40g/L+琼脂6.8g/L中,在培养温度20℃、每天
光照6h、光照强度600lx条件下进行愈伤组织诱导培养,培养30天统计,愈伤组织的诱导率
为83.56%;


(3)羌活细胞的悬浮培养:选取生长良好、颜色为黄白色且质地疏松的愈伤组织,
以30g/L的接种量接入羌活细胞悬浮培养基改良MS+6-BA 0.3mg/L+IAA 2.0mg/L+NAA
1.0mg/L+PVP 10g/L+苯丙氨酸450μmol/L中,在培养温度25℃、每天光照8h、光照强度800lx
及摇床转数120r/min的条件下进行羌活细胞的悬浮培养,所述改良MS是指NH
4NO
3含量为
825mg/L、KNO
3含量为950mg/L的MS培养基;


(4)细胞的继代培养:羌活细胞悬浮培养30天继代一次,每次的接种量、培养基和
培养条件与步骤(3)相同;


(5)细胞增殖倍数计算:取继代培养4次的羌活细胞悬浮?#26097;?#20837;离心管中,在
4000r/min的离心机上离心10min,倒掉上清?#33322;?#34892;称重,按如下公式计算出羌活细胞的增
殖倍数为3.63倍,并根据2015版药典测出其羌活醇和异欧前胡素的总百分含量为0.398%;


细胞增殖倍数=(收获细胞?#25163;?接种细胞?#25163;?/接种细胞?#25163;兀?br>

上述所有培养基的pH值为6.0、蔗糖30g/L。


实施例2


本实施例提供的获得高生物产量的羌活细胞培养方法包括如下步骤:


(1)羌活丛生芽诱导:选取羌活植物根茎上生长的健康、无病虫害的不定芽作为外
植体,先用浓?#20219;?0%的酒精消毒10s,再用浓?#20219;?.1%的升汞消毒4min,然后用无菌水冲
洗3次后,接种到丛生芽诱导培养基1/2MS+ZT(玉米素)2.0mg/L+NAA 0.2mg/L+LH(水解乳蛋
白)300mg/L+琼脂6.8g/L中,在培养温度20℃、每天光照10h、光照强度1000lx条件下进行丛
生芽诱导培养,培养25天统计,丛生芽的诱导率为78.42%;


(2)愈伤组织的诱导培养:取丛生芽2个为一组接入愈伤组织诱导培养基B5+2,4-D
1.0mg/L+6-BA 0.5mg/L+IAA 0.5mg/L+活性炭30g/L+琼脂6.8g/L中,在培养温度18℃、每天
光照4h、光照强度500lx条件下进行愈伤组织诱导培养,培养30天统计,愈伤组织的诱导率
为79.89%;


(3)羌活细胞的悬浮培养:选取生长良好、颜色为黄白色且质地疏松的愈伤组织,
以20g/L的接种量接入至羌活细胞悬浮培养基改良MS+6-BA 0.1mg/L+IAA 1.0mg/L+NAA
0.5mg/L+PVP 5.0g/L+苯丙氨酸200μmol/L中,在培养温度20℃、每天光照6h、光照强度
600lx及摇床转数100r/min的条件下进行羌活细胞的悬浮培养,所述改良MS是指NH
4NO
3含量
为825mg/L、KNO
3含量为950mg/L的MS培养基;


(4)细胞的继代培养:羌活细胞每悬浮培养20天继代一次,每次的接种量、培养基
和培养条件与步骤(3)相同;


(5)细胞增殖倍数计算:取羌活细胞悬浮?#26097;?#20837;离心管中,在4000r/min的离心机
上离心10min,倒掉上清?#33322;?#34892;称重,按如下公式计算出羌活细胞的增殖倍数为2.97倍;并
根据2015版药典测出其羌活醇和异欧前胡素的总百分含量为0.345%;


细胞增殖倍数=(收获细胞?#25163;?接种细胞?#25163;?/接种细胞?#25163;兀?br>

上述所有培养基的pH值为5.8、蔗糖25g/L。


实施例3


本实施例提供的获得高生物产量的羌活细胞培养方法包括如下步骤:


(1)羌活丛生芽诱导:选取羌活植物根茎上生长的健康、无病虫害的不定芽作为外
植体,先用浓?#20219;?0%的酒精消毒30s,再用浓?#20219;?.1%的升汞消毒8min,然后用无菌水冲
洗5次后,接种到丛生芽诱导培养基1/2MS+ZT(玉米素)5.0mg/L+NAA 0.5mg/L+LH(水解乳蛋
白)600mg/L+琼脂6.8g/L中,在培养温度25℃、每天光照15h、光照强度1500lx条件下进行丛
生芽诱导培养,培养25天统计,丛生芽的诱导率为83.92;


(2)愈伤组织的诱导培养:取丛生芽2个为一组接入愈伤组织诱导培养基B5+2,4-D
3.0mg/L+6-BA 1.0mg/L+IAA 1.5mg/L+活性炭60g/L+琼脂6.8g/L中,在培养温度22℃、每天
光照8h、光照强度800lx条件下进行愈伤组织诱导培养,培养30天统计,愈伤组织的诱导率
为82.13%;


(3)羌活细胞的悬浮培养:选取生长良好、颜色为黄白色且质地疏松的愈伤组织,
以40g/L的接种量接入至羌活细胞悬浮培养基改良MS+6-BA 0.5mg/L+IAA 3.0mg/L+NAA
1.5mg/L+PVP 15.0g/L+苯丙氨酸600μmol/L中,在培养温28℃、每天光照10h、光照强度
1000lx及摇床转数140r/min的条件下进行羌活细胞的悬浮培养,所述改良MS是指NH
4NO
3含
量为825mg/L、KNO
3含量为950mg/L的MS培养基;


(4)细胞的继代培养:羌活细胞每悬浮培养40天继代一次,每次的接种量、培养基
和培养条件与步骤(3)相同;


(5)细胞增殖倍数计算:取羌活细胞悬浮?#26097;?#20837;离心管中,在4000r/min的离心机
上离心10min,倒掉上清?#33322;?#34892;称重,按如下公式计算出羌活细胞的增殖倍数为3.71倍;并
根据2015版药典测出其羌活醇和异欧前胡素的总百分含量为0.374%;


细胞增殖倍数=(收获细胞?#25163;?接种细胞?#25163;?/接种细胞?#25163;兀?br>

上述所有培养基的pH值为6.2、蔗糖35g/L。


实施例4


在实施例1步骤(1)中,将丛生芽诱导培养基改为1/2MS+ZT(玉米素)2.0mg/L+NAA
0.2mg/L+LH(水解乳蛋白)300mg/L+琼脂6.8g/L,其它步骤同实施例1,培养25d统计,丛生芽
的诱导率为81.86%。


实施例5


在实施例1步骤(1)中,将丛生芽诱导培养基改为1/2MS+ZT(玉米素)5.0mg/L+NAA
0.5mg/L+LH(水解乳蛋白)600mg/L+琼脂6.8g/L。其它步骤同实施例1,培养25d统计,丛生芽
的诱导率为84.13%。


实施例6


在实施例1步骤(2)中,将愈伤组织诱导培养基改为B5+2,4-D 1.0mg/L+6-BA
0.5mg/L+IAA 0.5mg/L+活性炭30g/L+琼脂6.8g/L,其它步骤同实施例1,诱导培养30d统计,
愈伤组织的诱导率为77.87%。


实施例7


在实施例1步骤(2)中,将愈伤组织诱导培养基改为B5+2,4-D 3.0mg/L+6-
BA1.0mg/L+IAA 1.5mg/L+活性炭60g/L+琼脂6.8g/L,其它步骤同实施例1,诱导培养30d统
计,愈伤组织的诱导率为79.17%。


实施例8


在实施例1步骤(3)中,将羌活细胞的悬浮培养基改为


改良MS+6-BA 0.1mg/L+IAA 1.0mg/L+NAA 1.5mg/L+PVP 15.0g/L+苯丙氨酸600μ
mol/L,所述改良MS是指NH
4NO
3含量为825mg/L、KNO
3含量为950mg/L的MS培养基,其它步骤同
实施例1,羌活细胞的增殖倍数为3.08倍,其羌活醇和异欧前胡素的总百分含量为0.358%。


比较实施例1


在实施例1步骤(1)中,将丛生芽诱导培养基改为MS+NAA 0.4mg/L+LH(水解乳蛋
白)500mg/L+琼脂6.8g/L,其它步骤同实施例1,培养25d统计,丛生芽的诱导率仅为
19.37%。


比较实施例2


在实施例1步骤(1)中,将丛生芽诱导培养基改为1/2MS+6-BA 3.0mg/L+NAA
0.4mg/L+琼脂6.8g/L,其它步骤同实施例1,培养25d后统计,丛生芽的诱导率为21.32%。


比较实施例3


在实施例1步骤(2)中,将丛生芽改为单个接入愈伤组织诱导培养基中,其它步骤
同实施例1,培养30d统计,愈伤组织的诱导率仅为38.96%。


比较实施例4


在实施例1步骤(2)中,将愈伤组织诱导培养基改为MS+NAA 2.0mg/L+6-BA 0.8mg/
L+IAA 1.0mg/L+活性炭40g/L+琼脂6.8g/L中,其它步骤同实施例1,培养30d统计,愈伤组织
的诱导率仅为29.91%。


比较实施例5


在实施例1步骤(3)中,改选颜色为黄绿色且质地紧密的愈伤组织细胞悬浮培养基
中,其它步骤同实施例1,羌活细胞的增殖倍数为1.72倍,其羌活醇和异欧前胡素的总百分
含量为0.213%。


比较实施例6


在实施例1步骤(3)中,将羌活细胞的悬浮培养基改为MS+6-BA 0.3mg/L+IAA
2.0mg/L+NAA 1.0mg/L,其它步骤同实施例1,羌活细胞的增殖倍数为2.18倍,其羌活醇和异
欧前胡素的总百分含量为0.154%。


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